郭秋平，金若敏

（1.廣州醫(yī)藥研究總院有限公司藥物非臨床評(píng)價(jià)研究中心，廣東廣州 510240；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)中心，上海 201203）

苦參堿和氧化苦參堿致小鼠肝毒性比較

郭秋平1，金若敏2

（1.廣州醫(yī)藥研究總院有限公司藥物非臨床評(píng)價(jià)研究中心，廣東廣州 510240；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)中心，上海 201203）

目的比較苦參堿和氧化苦參堿的肝毒性，探索其肝毒性機(jī)制。方法ICR小鼠單次ig給予苦參堿200 mg·kg-1或氧化苦參堿200 mg·kg-1，第15天計(jì)算小鼠死亡率；采用生化分析儀檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、堿性磷酸酶（ALP）和乳酸脫氫酶（LDH）含量；HE染色法檢查肝組織病理變化；ELISA法檢測(cè)肝組織勻漿液超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）含量；TUNEL染色法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡率。結(jié)果苦參堿組小鼠死亡率為80%，氧化苦參堿組小鼠全部存活。與正常對(duì)照組相比，苦參堿組死亡小鼠血清酶GPT，GOT和ALP明顯升高（P<0.05），氧化苦參堿組小鼠僅血清ALP升高（P<0.05）；HE染色結(jié)果表明，苦參堿組8只死亡小鼠中4只小鼠肝細(xì)胞變性、灶性壞死（P<0.05），氧化苦參堿組10例中1只小鼠肝細(xì)胞輕度壞死；ELISA結(jié)果表明，苦參堿組死亡小鼠肝組織勻漿液SOD和GSH含量降低（P<0.05，P<0.01），氧化苦參堿組僅GSH含量降低（P<0.05）；苦參堿組存活小鼠和氧化苦參堿組小鼠肝細(xì)胞凋亡率均升高（P<0.05）。結(jié)論苦參堿和氧化苦參堿對(duì)小鼠均具有肝毒性，苦參堿的肝毒性大于氧化苦參堿，肝毒性機(jī)制與氧化應(yīng)激和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

苦參堿；氧化苦參堿；肝毒性

苦參的生物堿中含有氧化槐果堿、氧化苦參堿、槐花醇、槐花堿和苦參堿［1］，山豆根的生物堿中含有金雀花堿、氧化槐果堿、氧化苦參堿、槐花醇、槐花堿和苦參堿［2］?？鄥A和氧化苦參堿是苦參和山豆根生物堿的主要活性成分，兩者具有明確的抗病毒及保護(hù)心肌等作用［3-4］，也是主要質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)成分［5］。

苦參堿和氧化苦參堿在臨床廣泛應(yīng)用于治療乙型肝炎、抗腫瘤和抗病毒等，大量基礎(chǔ)研究和報(bào)道顯示，它們具有保肝作用。Wan等［6］對(duì)苦參堿和甘草酸進(jìn)行了聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)苦參堿和甘草酸合用后，明顯減小了對(duì)乙酰氨基酚引起的肝損傷，具有保護(hù)肝細(xì)胞的作用。但對(duì)于苦參堿和氧化苦參堿的肝毒性，卻知之較少。近年來，已有文獻(xiàn)報(bào)道，它們均具有肝毒性。但兩者的毒性大小和毒性機(jī)制尚不明確。本研究采用整體小鼠實(shí)驗(yàn)，以大劑量并等劑量的苦參堿和氧化苦參堿給藥，比較兩者的肝毒性，探討其肝毒性機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物、試劑和主要儀器

苦參堿，純度99.1%，氧化苦參堿，純度99.3%（均上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒，脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶熒光素標(biāo)記（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）試劑盒（均南京建成生物科技有限公司）。日立7100生化分析儀（日本Hitachi公司），BX51熒光顯微鏡和Image圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

30只ICR小鼠，18 ～22 g，雌雄各半，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)期間小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室，12 h明/暗，標(biāo)準(zhǔn)飲食飲水。所有實(shí)驗(yàn)方案均符合廣州醫(yī)藥研究總院IACUC的要求（方案編號(hào)：EX-EL2014007-02）。ICR小鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組、苦參堿200 mg·kg-1組和氧化苦參堿200 mg·kg-1組，每組10只，單次ig給藥，正常對(duì)照組給予超純水。

1.3急性毒性癥狀的觀察和死亡率的計(jì)算

苦參堿和氧化苦參堿給藥后4 h，參照《藥物單次給藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，每天觀察小鼠的行為活動(dòng)、飲食和飲水等，連續(xù)觀察14 d，計(jì)算小鼠死亡率。

1.4血清生化指標(biāo)檢測(cè)

死亡小鼠瀕死前采血，存活動(dòng)物第15天采血。乙醚麻醉，眼眶靜脈叢取血0.5 mL，1000×g離心10 min，制備血清，按試劑盒步驟檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-oxalacetic transaminase，GOT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性。

1.5HE染色檢測(cè)肝組織病理變化

死亡小鼠及時(shí)解剖，存活小鼠第15天解剖。取肝，于4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，在光鏡下觀察肝組織病理變化；參照文獻(xiàn)［7］將肝細(xì)胞病理分級(jí)為：①肝細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，未見肝細(xì)胞壞死，為“-”，計(jì)0級(jí)；②偶見小葉中央散在肝細(xì)胞壞死，為“+”，計(jì)1級(jí)；③見小葉中央肝細(xì)胞少數(shù)壞死，為“++”，計(jì)2級(jí)；④壞死細(xì)胞廣泛存在于小葉中央，為“+++”，計(jì)3級(jí)；⑤壞死細(xì)胞彌散于小葉中央，為“++++”，計(jì)4級(jí)。

1.6ELISA法檢測(cè)肝組織勻漿液中SOD和GSH含量

肝組織病理檢測(cè)同時(shí)，用0.9%氯化鈉溶液對(duì)部分肝加工成勻漿，制備10%肝組織勻漿液，按試劑盒操作步驟檢測(cè)肝組織勻漿液中SOD（kU·g-1蛋白質(zhì)）和GSH（mg·g-1蛋白質(zhì)）的含量。

1.7TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡

取肝石蠟切片，脫蠟，PBS沖洗，胃蛋白酶消化，PBS沖洗，浸入樣本封閉液，室溫封閉10 min，PBS沖洗，加TdT酶反應(yīng)液，加蓋玻片37℃避光濕潤(rùn)反應(yīng)60 min，PBS沖洗，加1 ～2滴辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素工作液，加蓋玻片37℃避光濕潤(rùn)反應(yīng)30 min，PBS沖洗，滴加DAB工作液，室溫孵育5 ～30 min，PBS沖洗，普通光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照。細(xì)胞核棕黃色為陽性，每個(gè)樣本觀察5個(gè)視野，采用圖像分析軟件進(jìn)行陽性著色區(qū)域統(tǒng)計(jì)，以陽性著色區(qū)域面積表示各組凋亡率。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表達(dá)，組間比較采用t檢驗(yàn)，死亡率采用卡方檢驗(yàn)，病理半定量分析采用Ridit檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1苦參堿和氧化苦參堿致小鼠急性毒性癥狀及死亡率

給藥后4 h，與正常對(duì)照組相比，苦參堿200 mg·kg-1組小鼠表現(xiàn)為活動(dòng)減弱、閉目、蜷縮、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、驚厥，間或出現(xiàn)強(qiáng)直性痙攣，甚至出現(xiàn)劇烈跳動(dòng)，給藥4 h內(nèi)8只小鼠死亡，存活小鼠1 d后采食、飲水、自主活動(dòng)和糞便恢復(fù)正常；氧化苦參堿200 mg·kg-1組小鼠癥狀與苦參堿200 mg·kg-1組相似，但癥狀較輕，未出現(xiàn)小鼠死亡，給藥1 d后，所有小鼠采食、飲水、自主活動(dòng)和糞便恢復(fù)正常?？鄥A200 mg·kg-1組小鼠死亡率為80%，氧化苦參堿200 mg·kg-1組小鼠全部存活。

2.2苦參堿和氧化苦參堿對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響

由表1可見，與正常對(duì)照組相比，苦參堿組死亡小鼠血清GPT，GOT和ALP含量升高（P<0.05），存活小鼠血清生化指標(biāo)無明顯差異；氧化苦參堿組小鼠血清ALP含量升高（P<0.05）。與氧化苦參堿組相比，苦參堿組死亡小鼠血清GPT升高（P<0.05），其存活小鼠血清生化指標(biāo)無明顯差異。

Tab.1 Effect of matrine and oxymatrine on hepato?toxic biomarkers in serum of mice

2.3苦參堿和氧化苦參堿對(duì)小鼠肝組織病理變化的影響

由圖1可見，正常對(duì)照組小鼠肝竇清晰，肝細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整?？鄥A組8只死亡小鼠中，有4只肝細(xì)胞發(fā)生變性、灶性壞死（P<0.05），2只存活小鼠肝無明顯異常。氧化苦參堿組10只小鼠中，1只小鼠肝小葉偶見肝細(xì)胞壞死，其余小鼠未出現(xiàn)明顯肝細(xì)胞形態(tài)的改變。表2可見，苦參堿組死亡小鼠肝病變程度比氧化苦參堿組嚴(yán)重（P<0.05）。

Fig.1 Effect of matrine and oxymatrine on pathological changes in liver tissues of mice（HE×100）.See Tab.1for the mouse treatment.Arrows show degeneration and focal ne?crosis in liver cells.

Tab.2 Effect of matrine and oxymatrine on class of histopathological change in liver of mice

2.4苦參堿和氧化苦參堿對(duì)小鼠肝組織勻漿液中SOD和GSH含量的影響

由表3可見，與正常對(duì)照組相比，苦參堿組死亡小鼠肝組織SOD和GSH含量降低（P<0.05，P< 0.01），氧化苦參堿組僅GSH含量降低（P<0.05）。與氧化苦參堿組相比，苦參堿組死亡小鼠肝組織SOD含量降低無顯著性差異。

Tab.3 Effect of matrine and oxymatrine on SOD and GSH level in the liver of mice

2.5苦參堿和氧化苦參堿對(duì)小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響

由圖2可見，正常對(duì)照組肝細(xì)胞圓形或類圓形，細(xì)胞質(zhì)形狀規(guī)則，細(xì)胞僅少數(shù)見棕黃色。苦參堿組死亡小鼠有很多細(xì)胞核被深染為棕黃色的凋亡細(xì)胞，可見細(xì)胞縮小，間隙增大，苦參堿組存活小鼠和氧化苦參堿組可見少量細(xì)胞的細(xì)胞核被染為棕黃色。

Fig.2 Effect of matrine and oxymatrine on liver cell apoptosis in mice by TUNEL staining.See Tab.1 for the mouse treatment.Arrows show the apoptotic cells in liver tissue.

由表4可見，陽性著色區(qū)域面積越大，凋亡率越高。與正常對(duì)照組相比，苦參堿組死亡和存活小鼠肝細(xì)胞的凋亡率明顯升高（P<0.01，P<0.05），氧化苦參堿組小鼠肝細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）；與氧化苦參堿組相比，苦參堿組死亡小鼠肝細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.01）。

Tab.4 Effect of matrine and oxymatrine on liver cell apoptosis in mice

3 討論

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苦參堿毒性明顯大于氧化苦參堿，結(jié)合前期文獻(xiàn)報(bào)道，苦參堿具有肝毒性。因此，本研究選擇了一個(gè)>50%死亡的苦參堿劑量（200 mg·kg-1），然后選擇等劑量的氧化苦參堿，對(duì)比死亡率，觀察它們對(duì)肝的毒性作用。宋兵等［8］對(duì)兩者進(jìn)行急性毒性研究，結(jié)果顯示，苦參堿180 mg·kg-1單次ig給藥，小鼠死亡率為30%，與氧化苦參堿260 mg·kg-1組相同。另有文獻(xiàn)報(bào)道，苦參堿200 mg·kg-1ig給藥，小鼠死亡率為100%［9］。本研究結(jié)果顯示，與等劑量氧化苦參堿相比，苦參堿組小鼠死亡率和血清酶含量明顯升高，肝細(xì)胞形態(tài)病變程度明顯加重，提示大劑量苦參堿和氧化苦參堿對(duì)小鼠均具有肝毒性作用，等劑量時(shí)苦參堿對(duì)小鼠的肝毒性明顯大于氧化苦參堿。張茜等［10］采用體外肝細(xì)胞，研究了兩者對(duì)肝細(xì)胞的毒性，結(jié)果得出兩者均具有一定的肝毒性，苦參堿的肝毒性明顯大于氧化苦參堿。本文的研究結(jié)果與張茜等報(bào)道的體內(nèi)外研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，苦參堿使小鼠肝SOD和GSH含量明顯降低，氧化苦參堿僅使小鼠肝GSH含量降低，苦參堿組小鼠肝GSH含量降低幅度大于氧化苦參堿組；兩者雖都能使肝細(xì)胞凋亡率升高，但苦參堿組肝細(xì)胞凋亡率的升高幅度大于氧化苦參堿組；以上結(jié)果提示，兩者的肝毒性機(jī)制均與氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡有關(guān)。只是毒性機(jī)制基本一致，毒性程度有所不同。

目前，大多數(shù)中藥因?yàn)橘|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的問題難以進(jìn)行藥效及安全性物質(zhì)基礎(chǔ)的研究，近年來，中藥整體質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)體系構(gòu)建及應(yīng)用已取得突破性進(jìn)展，提倡基于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的中藥藥效/安全性研究。在《中國(guó)藥典》已明確指出，本實(shí)驗(yàn)所研究的苦參堿和氧化苦參堿是中藥山豆根和苦參的質(zhì)量指標(biāo)成分，但它們?cè)谶@兩種中藥中的含量有所差異。山豆根的生物堿部位中，氧化苦參堿的峰面積明顯大于苦參堿，峰面積比約為4∶1［11］；苦參的生物堿部位中，氧化苦參堿的峰面積大于苦參堿，峰面積比約為7∶1［12］；山豆根中兩者含量之比大于苦參。本研究表明，苦參堿的毒性明顯大于氧化苦參堿，在《中國(guó)藥典》中注明山豆根有小毒，而苦參無毒，這種差異是否是苦參堿與氧化苦參堿含量的差異引起的，還有待于進(jìn)一步深入研究。藥效方面，已有報(bào)道對(duì)兩者的藥效進(jìn)行了比較研究，在等劑量（40 mg·kg-1）時(shí)，苦參堿的鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于氧化苦參堿，氧化苦參堿的抗炎作用強(qiáng)于苦參堿［13］；等濃度下，苦參堿的抑菌作用強(qiáng)于氧化苦參堿［14］，表明兩者的藥效各有所長(zhǎng)。本研究主要介紹了兩者在體內(nèi)小鼠模型的肝毒性比較，本課題組將結(jié)合兩者的含量配比，在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究中藥山豆根和苦參的藥效/肝毒性，為這2種中藥在臨床更加合理的使用提供科學(xué)依據(jù)。

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Comparison of liver toxicity of matrine and oxymatrine in mice

GUO Qiu-ping1，JIN Ruo-min2
（1.Drug Non-clinical Evaluation and Research Center，Guangzhou General Pharmaceutical Research Institute，Guangzhou 510240，China；2.Drug Safety Evaluation Center，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China）

OBJECTIVE To compare the liver toxicity of matrine and oxymatrine，and to explore their toxic mechanism.METHODS Thirty ICR mice were randomly divided into normal control，matrine 200 mg·kg-1and oxymatrine 200 mg·kg-1groups，10 mice per group.After single ig administration of corresponding drugs or water，animal mortality was calculated at the 15thday.The content of glutamic-pyruvic transami?nase（GPT），glutamic-oxalacetic transamin（GOT），alkaline phosphatase（ALP）and lactate dehydroge?nase（LDH）in serum were detected.Histopathological changes of the liver were examined by HE stain.The content of superoxide dismutase（SOD）and glutathione（GSH）in liver homogenates were detected by ELISA.Hepatocyte apoptosis was detected by Tunel stain.RESULTS The mortality rate of mice in two groups was 80%and 0，respectively.GPT，GOT and ALP contents of dead mice in matrine group were significantly higher than that in normal control group（P<0.05）.In oxymatrine group，only the content of ALP was increased（P<0.05）.Four of the eight dead mice in matrine group exhibited liver cell necrosis（P<0.05），while only 1/10 mice in oxymatrine group had a mild liver cell necrosis（P>0.05）. The content of SOD and GSH of dead mice in matrine group was lower than that in control group（P< 0.05，P<0.01）.The content of GSH in oxymatrine group was also decreased（P<0.05）.The apoptosis rate of liver cells in dead mice in matrine group was increased（P<0.05）.CONCLUSION A large dose of matrine and oxymatrine can produce liver toxicity.At an equal dosage，the liver toxicity of matrine is significantly higher than that of oxymatrine.The toxic mechanism is related to oxidative stress and apoptosis.

matrine；oxymatrine；hepatotoxicity

JIN Ruo-min，E-mail：rmj801@126.com，Tel：（021）51322401

R285.1

A

1000-3002-（2016）07-0736-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.07.005

Foundation item：The project supported by National Key Basic Research and Development Program（2009CB522807）；Major Bioscience and Technology Project of Guangzhou City（201300000053）；and Science and Technology Project of Haizhu District in Guangzhou City（2012-CG-01）

2016-03-22接受日期：2016-07-15）

（本文編輯：賀云霞）

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2009CB522807），廣州市生物產(chǎn)業(yè)重大專項(xiàng)（201300000053）；廣州市海珠區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012-CG-01）

郭秋平，女，博士，高級(jí)工程師，主要從事藥理毒理學(xué)研究，E-mail：vipvivenguoguo@126.com，Tel：（020）66284078。

金若敏，E-mail：rmj801@126.com，Tel：（021）51322401