蘇 楠，馬麗卿，馬永成，岳曉禹

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品工程學(xué)院，河南鄭州 450011；2.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院臨床藥理室，河南 鄭州 450003）

棒曲霉素對人肝細(xì)胞L-02的毒性效應(yīng)及作用機(jī)制

蘇 楠1，馬麗卿1，馬永成2，岳曉禹1

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品工程學(xué)院，河南鄭州 450011；2.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院臨床藥理室，河南 鄭州 450003）

目的研究棒曲霉素（PAT）對人肝細(xì)胞L-02的毒性作用，并探討其作用的分子機(jī)制。方法PAT 1.25，2.5，5，10和20 μmol·L-1分別作用于L-02細(xì)胞24和48 h，采用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測PAT對L-02細(xì)胞增殖的抑制作用；PAT 0，5和10 μmol·L-1作用L-02細(xì)胞24 h后，Hoechst33258和JC-1染色，通過熒光顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)及線粒體膜電位（MMP）觀察；利用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞凋亡、MMP及細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平進(jìn)行定量分析；Western蛋白印跡法檢測PAT對線粒體凋亡通路的影響。結(jié)果PAT明顯抑制L-02細(xì)胞的生長，24和48 h的IC50值分別為6.61和2.78 μmol·L-1；與正常對照組低MMP比率（9.2±2.3）%相比，PAT 5和10 μmol·L-1組低MMP比率顯著升高（P<0.01），分別升高至（23.4±4.5）%和（47.1±5.5）%；PAT 5和10 μmol·L-1處理后L-02細(xì)胞早期凋亡率較正常對照組（3.8±1.1）%升高（P<0.01），分別增至（29.8±4.5）%和（24.1±6.2）%；PAT引起L-02細(xì)胞內(nèi)ROS增加，使用外源性谷胱甘肽預(yù)孵育細(xì)胞后，阻斷了PAT誘導(dǎo)的ROS升高和增殖抑制的作用。結(jié)論P(yáng)AT可顯著影響L-02的生長，并通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與胞內(nèi)ROS水平升高有關(guān)。

棒曲霉素；細(xì)胞毒性；細(xì)胞凋亡；線粒體；活性氧

棒曲霉素（patulin，PAT）屬于曲霉和青霉等真菌的次級代謝產(chǎn)物，普遍存在于發(fā)霉的水果、蔬菜、谷物和動(dòng)物飼料中，尤其在腐爛的蘋果及蘋果汁、蘋果酒等蘋果制品中，PAT的含量最高。PAT的主要接觸途徑是消化道，經(jīng)消化道吸收進(jìn)入血液循環(huán)，分布于全身各個(gè)組織器官，在細(xì)胞色素P450酶作用下其毒性有所下降，但代謝產(chǎn)物仍具有毒性［1-2］。體外實(shí)驗(yàn)表明，PAT可誘導(dǎo)多種菌株的基因突變、對體外培養(yǎng)的細(xì)胞亦有DNA損傷作用；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，PAT對胃腸、肝腎及免疫系統(tǒng)具有明顯毒性。因此，WHO和歐盟已將果汁中的PAT檢測限量定為50 μg·L-1，目前FDA以及世界多個(gè)國家也對食品中PAT含量做了嚴(yán)格限定［3］。

雖PAT的生物毒性已明確，但多項(xiàng)報(bào)道指出由于常規(guī)的巴氏消毒法不能有效減少食品中PAT的含量，市場流通的商品中PAT超標(biāo)的情況仍較多見，嚴(yán)重威脅著人們的健康［4］。目前針對食品中PAT的檢測技術(shù)研究較多［5］，且應(yīng)用相對成熟，但對于PAT的毒理研究不足。因此，本研究以人正常肝細(xì)胞L-02為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，評估PAT的細(xì)胞毒性，探討可能的毒性機(jī)制，為進(jìn)一步了解其對人類潛在的危害提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑和主要儀器

人肝細(xì)胞L-02購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫；細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI 1640（美國Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；PAT（P1639）、噻唑藍(lán)（MTT，M2128）及Hoechst33258（B2883）（美國Sigma公司）；FITC-AnnexinⅤ/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（K201-25）（美國Biovision公司）；細(xì)胞線粒體分離試劑盒（C3601）、JC-1熒光染料（C2005）、熒光探針2′7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2′7′-dichlorodihydroflu-orescein diace?tate，DCFH-DA）（S0033）（碧云天生物技術(shù)研究所）；鼠抗人細(xì)胞色素c單克隆抗體（sc-13156，15 ku）（美國Santa Cruz公司）；GAPDH抗體（AB-PR001）（杭州賢至生物科技公司）；辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)公司）；谷胱甘肽（glutathione，GSH，A600229）（上海生工生物公司）。

311型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；sw-cj-1f超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；5424R高速低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；80i熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；Powerwave XS酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司）；MiniVE電泳電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（美國GE公司）；ME104分析天平（瑞士梅特勒托利公司）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

使用RPMI 1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，青霉素100 kU·L-1和鏈霉素100 g·L-1），于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)L-02細(xì)胞。待細(xì)胞生長至大約70%滿時(shí)，胰酶消化，傳代。選用對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT法檢測細(xì)胞存活率

胰酶消化，離心收集細(xì)胞，使用新鮮培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度，按每孔約7000細(xì)胞接種于96孔板，邊緣孔用無菌PBS填充。置培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞充分貼壁，使用或不使用GSH預(yù)孵育細(xì)胞后，加入終濃度為1.25，2.5，5，10和20 μmol·L-1的PAT，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。PAT分別作用24和48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，移液器吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），于搖床低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度（A490nm）。按照以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）=處理組（A490nm）/正常對照組（A490nm）×100%。并使用GraphPad Prism軟件計(jì)算IC50值。

1.4倒置熒光顯微鏡檢測細(xì)胞形態(tài)

于6孔板中做細(xì)胞爬片，使用PAT 5和10 μmol·L-1作用細(xì)胞24 h后，使用免疫染色固定液室溫固定10 min。加入適量的Hoechst33258染液進(jìn)行細(xì)胞染色，室溫避光30 min。倒掉染液，PBS漂洗2次，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

PAT 5和10 μmol·L-1作用細(xì)胞24 h后，按照FITC-AnnexinⅤ/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作。先加入適量結(jié)合緩沖液，然后加入FITC標(biāo)記的AnnexinⅤ和PI，室溫避光孵育5 min，使用流式細(xì)胞儀分析早期凋亡的細(xì)胞。

1.6JC-1染色檢測線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）［6］

將細(xì)胞在6孔板中制成爬片，使用PAT 5和10 μmol·L-1分別作用細(xì)胞24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入JC-1染液（線粒體熒光探針，10 mg·L-1），在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min，使用熒光顯微鏡在488 nm激發(fā)波長下觀察并拍照。同樣，藥物作用24 h后離心收集細(xì)胞并進(jìn)行上述染色操作后，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞MMP的變化情況，結(jié)果使用FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.7Western蛋白印跡法檢測細(xì)胞色素c

參考馬永成等［7］的方法，按線粒體分離試劑盒說明書，分離線粒體，提取線粒體蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白。BCA法測定蛋白濃度，取60 μg總蛋白上樣，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗室溫孵育2 h或4℃孵育過夜，辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫下孵育2 h，充分洗膜后加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemilumines?cence，ECL）劑，暗室中對膠片曝光，掃描并保存結(jié)果。掃描條帶計(jì)算積分吸光度值（integrated absor?bance，IA），蛋白相對表達(dá)水平以目標(biāo)蛋白IA與內(nèi)標(biāo)IA的比值表示。

1.8熒光探針DCFH-DA流式法檢測活性氧水平

使用氧化還原敏感探針DCFH-DA檢測胞內(nèi)ROS的水平，細(xì)胞內(nèi)的ROS可氧化無熒光的DCFH-DA生成有熒光的二氯熒光素（2′7′-dichlo?rodihydrofluorescein dictate，DCF），從而通過DCF的熒光強(qiáng)度判別細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。細(xì)胞處理后，胰酶消化離心收集細(xì)胞，PBS洗2次，使用無血清配制的10 μmol·L-1的DCFH-DA 37℃孵育30 min。再使用無血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞3次，以去除未結(jié)合的游離探針，流式檢測ROS的變化情況。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s的形式表示，采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用t檢驗(yàn)檢測各組間的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1棒曲霉素對L-02存活的影響

如圖1所示，PAT對人肝細(xì)胞L-02生長有顯著的抑制作用，且呈濃度和時(shí)間依賴性（24 h，r2=0.95，P<0.01；48 h，r2=0.99，P<0.01）；由濃度-效應(yīng)曲線計(jì)算24和48 h時(shí)PAT對L-02細(xì)胞的IC50值分別為6.6和2.8 μmol·L-1。

Fig.1 Effect of patulin（PAT）on viability of L-02 cells by MTT assay.x±s，n=3.

2.2棒曲霉素對L-02細(xì)胞凋亡的影響

Fig.2 Effect of PAT for 24 h on apoptosis of L-02 cells by Hoechst33258 staining（×200）.Arrows indicate apoptotic cells.

PAT作用L-02細(xì)胞24 h后，正常對照組細(xì)胞核大小均勻，染色質(zhì)無濃縮。而PAT組細(xì)胞可見染色質(zhì)濃縮，邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)碎裂成塊狀，形成凋亡小體等典型凋亡狀態(tài)（圖2）；AnnexinⅤ-FITC/PI雙染，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，PAT 5和10 μmol·L-1組的早期凋亡率較正常對照組（3.8±1.1）%顯著升高（P<0.01），分別增至（29.8±4.5）%和（24.1± 6.2）%；晚期凋亡率由正常對照組的（1.8±0.3）%增至（6.0±3.1）%（P<0.05）和（25.6±5.5）%（P<0.01）（圖3）。上述結(jié)果表明，PAT可誘導(dǎo)L-02細(xì)胞凋亡。

Fig.3 Effect of PAT for 24 h on apoptosis of L-02 cells by flow cytometry.B was the semi-quantitative result of A.x±s，n=3.*P<0.05，**P<0.01，compared with normal control（0 μmol·L-1）group.

2.3棒曲霉素對L-02細(xì)胞MMP的影響

PAT作用細(xì)胞24 h后熒光顯微鏡觀察，可見正常對照組細(xì)胞線粒體顯示強(qiáng)的橙色熒光，提示MMP較高，細(xì)胞狀態(tài)正常；在PAT 5 μmol·L-1作用下，細(xì)胞線粒體呈現(xiàn)了一定量的綠色熒光，提示MMP較正常對照組有所下降；當(dāng)濃度升至10 μmol·L-1時(shí)，線粒體幾乎完全呈現(xiàn)綠色熒光，提示此濃度下MMP完全喪失，細(xì)胞死亡不可逆轉(zhuǎn)（圖4）。

Fig.4 Effect of for 24 h PAT on mitochondrial mem?brane potential(MMP)of L-02 cells by JC-1 staining（×200）.

流式分析結(jié)果表明（圖5），PAT 5和10 μmol·L-1使L-02細(xì)胞MMP降低，低MMP的細(xì)胞比例由正常對照組的（9.2±2.3）%分別升高至（23.4±4.5）%和（47.1±5.5）%（P<0.01）。同時(shí)，Western蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖6）顯示，L-02細(xì)胞經(jīng)PAT作用24 h后，線粒體中的細(xì)胞色素c減少，而胞質(zhì)中的細(xì)胞色素c則增多，進(jìn)一步證明了PAT導(dǎo)致MMP下降，通透性增加，細(xì)胞色素c由線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)。這些結(jié)果表明，PAT誘導(dǎo)的凋亡過程與線粒體損傷有關(guān)。

Fig.5 Effect of PAT for 24 h on percent of low MMP cells by flow cytometry.B was the semi-quantitative result of A.x±s,n=3.**P<0.01,compared with normal control(0 μmol· L-1)group.

Fig.6 Effect of PAT on release of cytochrome c from mitochondria to cytosols in L-02 cells treated with PAT for 24 h by Western blotting.B was the semi-quantitative re?sults of A.x±s，n=3.**P<0.01，compared with nromal control（0 μmol·L-1）group.

2.4棒曲霉素對L-02細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

不同濃度PAT分別處理L-02細(xì)胞12 h后，裝載DCFH-DA探針，流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，L-02細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加（圖7A），與正常對照組相比，PAT 5和10 μmol·L-1組ROS含量由正常對照組的（4.0±1.2）%分別增至（22.1±4.7）%和（32.0± 7.1）%（P<0.01）（圖7B）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，PAT可誘導(dǎo)L-02細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高。

Fig.7 Effect of PAT for 12 h on intracellular levels of reactive oxygen species(ROS)in L-02 cells by flow cytometry.A：cells were treated with patulin at indicated doses for 12 h，followed by incubation with DCFH-DA 10 μmol·L-1for 30 min at 37℃；B was the semi-quantative result of A.x±s，n=3. **P<0.01，compared with normal control（0 μmol·L-1）group.

2.5抗氧化劑GSH對棒曲霉素誘導(dǎo)的ROS升高和增殖抑制的影響

圖8結(jié)果表明，GSH完全阻斷PAT 0 μmol·L-1誘導(dǎo)的ROS升高；此外，GSH也明顯阻斷了PAT作用L-02 24 h所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，且差異具有顯著性（圖9）。這些結(jié)果表明，PAT通過消耗胞內(nèi)GSH，導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)失衡，ROS積累，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

Fig.8 Effect of glutathione(GSH)on PAT induced ROS increase by flow cytometer.L-02 cells were pretreated with or without GSH 3 mmol·L-1，incubated with patulin 10 μmol·L-1for 12 h，stained with DCFH-DA and then determined by flow cytometry.

Fig.9 Effect of GSH on PAT induced L-02 proliferation decrease by MTT assay.Cells were pretreated with or without GSH 3 mmol·L-1，and then incubated with the indicated doses ofpatulin for24 h.x±s，n=3.**P<0.01，compared with corresponding patulin group.

3 討論

本研究結(jié)果表明，PAT可明顯抑制L-02的生長，呈濃度和時(shí)間依賴關(guān)系。通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)PAT可致L-02發(fā)生典型的凋亡形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)分析也證明PAT可引起L-02凋亡。表明PAT對人肝細(xì)胞具有顯著毒性。

在線粒體介導(dǎo)的凋亡通路中，線粒體膜通透性起到“開關(guān)”的作用［8］。因此，本研究檢測了PAT對MMP的影響，經(jīng)過JC-1熒光染色以及Western蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PAT導(dǎo)致L-02 MMP下降，引起細(xì)胞色素c釋放，最終誘導(dǎo)L-02凋亡。表明PAT通過線粒體損傷途徑發(fā)揮了其細(xì)胞毒性。

細(xì)胞內(nèi)部抗氧化系統(tǒng)失衡，ROS積聚，是細(xì)胞凋亡、組織衰老及損傷的起始原因。多項(xiàng)研究已證明PAT可與細(xì)胞內(nèi)含巰基的生物大分子結(jié)合，破壞氧化還原系統(tǒng)，造成氧化壓力，誘發(fā)細(xì)胞毒性［9-10］。其中GSH是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中巰基的主要來源，是動(dòng)物細(xì)胞中關(guān)鍵的抗氧化劑，已證明一分子PAT可與三分子GSH發(fā)生反應(yīng)，破壞其抗氧化作用［2］。本研究檢測了PAT對ROS產(chǎn)生的影響，研究發(fā)現(xiàn)，PAT可顯著升高L-02內(nèi)部的ROS水平。外源性抗氧化劑GSH幾乎可完全阻斷PAT誘導(dǎo)的ROS水平升高及細(xì)胞死亡。因此推測，消耗胞內(nèi)GSH引起ROS水平升高是PAT的主要毒性機(jī)制?？傊狙芯繛檫M(jìn)一步揭示PAT的毒性機(jī)制、深入研究PAT對人體肝的影響，以及為制定PAT在食品中的限量標(biāo)準(zhǔn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Toxicological effect and mechanism of patulin on human normal liver cells L-02

SU Nan1，MA Li-qing1，MA Yong-cheng2，YUE Xiao-yu1
（1.Food Science and Engineering College，Henan University of Animal Husbandry and Economy，Zhengzhou 450011，China；2.Clinical Pharmacology Laboratory，People′s Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450003，China）

OBJECTIVE To investigate the toxicological effect of patulin（PAT）on the growth of human normal liver cells L-02 and its possible mechanisms.METHODS After cells were treated with PAT 1.25，2.5，5，10 and 20 μmol·L-1for 24 or 48 h，cell viability was examined using MTT assay.L-02 cells were treated with PAT 5 and 10 μmol·L-1for 24 h，respectively.Cytomorphology and mitochondrial membrane potential（MMP）were observed under a fluorescence microscope.Apoptosis，MMP and reactive oxygen species（ROS）were analyzed by flow cytometry.Mitochondria apoptosis pathways were detected by Western blotting.RESULTS PAT exhibited a strong inhibitory effect on L-02 in a concentration-dependent and time-dependent manner.IC50of PAT treatment for 24 or 48 h was 6.61 and 2.78 μmol·L-1，respectively.MMP was decreased，while the percentage of low MMP cells increased from（9.2±2.3）%in controls to（23.4±4.5）%（PAT 5 μmol·L-1）and（47.1±5.5）%（PAT 10 μmol·L-1），respectively.Compared to untreated cells，the early apoptosis population increased from（3.8±1.1）% to（29.8±4.5）%（PAT 5 μmol·L-1）and（24.1±6.2）%（PAT 10 μmol·L-1）（P<0.01），respectively.Further?more，the accumulation of ROS was also observed.The effect of PAT on ROS and cell viabilities could be attenuated by glutathione.CONCLUSION PAT can significantly inhibit the growth of L-02 and induce apoptosis via ROS-dependent mitochondria pathways.

patulin；cytotoxicity；apoptosis；mitochondria；reactive oxygen species

s：MA Yong-cheng，E-mail：myc66881998@163.com；YUE Xiao-yu，E-mail：yuerain@163.com

R996.1

A

1000-3002-（2016）07-0741-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.07.006

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（U1404332）；and Program for Science&Technology Innovation Talents of Henan Province（16HASTIT017）

2016-01-07接受日期：2016-06-17）

（本文編輯：賀云霞）

國家自然科學(xué)基金（U1404332）；河南省科技創(chuàng)新人才支持計(jì)劃（16HASTIT017）

蘇 楠，女，碩士，主要從事食品藥品檢測及毒理學(xué)研究，E-mail：catnancy@163.com

馬永成，E-mail：myc66881998@163.com；岳曉禹，E-mail：yuerain@163.com