俞雪鋒，蔣 曦，王國康，張佳佳，趙應(yīng)征，潘建春

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波 315000；2.浙江大學(xué)明州醫(yī)院，浙江寧波 315000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江溫州 325035）

·論 著·

阿魏酸對脊髓損傷大鼠微管相關(guān)蛋白輕鏈3、Beclin1、Bcl-2和Bax表達的影響

俞雪鋒1，蔣 曦2，3，王國康1，張佳佳1，趙應(yīng)征3，潘建春3

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波 315000；2.浙江大學(xué)明州醫(yī)院，浙江寧波 315000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江溫州 325035）

目的研究阿魏酸（FA）對脊髓損傷（SCI）模型大鼠的改善作用及其對微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）、人卷曲螺旋肌球蛋白樣BCL-2結(jié)合蛋白/自噬基因1（Beclin1）、Bcl-2和Bax表達的影響。方法采用脊髓壓迫損傷動物模型，即動脈鉗夾閉脊髓2 min造成SCI。實驗分為假手術(shù)組、模型6 h，1，3，7和14 d組、FA 100 mg·kg-1（術(shù)后po，每天2次）給藥6 h，1，3，7和14 d組。SCI后，進行BBB評分和斜板功能評分，隨后處死大鼠，取脊髓進行HE染色，采用免疫組織染色法檢測LC3和Beclin1蛋白，采用Western蛋白印跡法檢測LC-3，Beclin1，Bcl-2和Bax蛋白表達。結(jié)果與假手術(shù)組相比，模型6 h組BBB評分和斜板功能評分明顯下降，分別由21分和70°下降為（0.5±0.5）分和（5.8±2.0）°；而FA給藥7 d后BBB評分由模型7 d組的3.0±1.7上升為6.2±3.6（P<0.05），斜板功能評分則由（13.3±4.1）°上升為（26.7±8.7）°（P<0.01）；HE染色發(fā)現(xiàn)，SCI損傷后出現(xiàn)組織水腫，結(jié)構(gòu)呈空洞狀；FA給藥7 ～14 d，脊髓內(nèi)部水腫及結(jié)構(gòu)空洞得到改善。West?ern蛋白印跡法檢測結(jié)果顯示，SCI損傷后1 d，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin1表達增加（P<0.01），14 d組蛋白表達相比于1 d組下降（P<0.05）；相對于自噬蛋白，抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加，并且Bcl-2與致凋亡蛋白Bax的比值增加（P<0.05）。SCI損傷后給予FA，相比于SCI模型組，1 d組LC3和Beclin1表達增加（P<0.05）；14 d組Bcl-2表達明顯增加，其與Bax比值增加更為顯著（P<0.05）。結(jié)論SCI后可能存在著自噬先增強后減弱的發(fā)展過程，而抗凋亡作用可能存在著逐漸增強的趨勢。FA對SCI具有潛在的治療作用，其機制可能涉及對自噬和凋亡的影響。

阿魏酸；脊髓損傷；細胞凋亡；自噬

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種可逆性差、致殘率高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病，發(fā)生率逐年增高且呈年輕化趨勢，且其治療也一直是醫(yī)學(xué)界的重點和難點。SCI按病理、生理學(xué)機制可分為原發(fā)性和繼發(fā)性損傷。因原發(fā)性損傷的不可逆性，目前研究的焦點主要集中于繼發(fā)性SCI。繼發(fā)性SCI主要表現(xiàn)為神經(jīng)受損。自噬和凋亡作為細胞程序性死亡的2種重要方式［1］，是目前SCI后細胞死亡機制的研究熱點。

目前，治療SCI的特效藥物幾乎不存在，圍繞自噬與凋亡機制展開的藥物研究成為焦點。雷帕霉素屬于自噬增強劑，能改善SCI癥狀，但其本身具有很強的毒性作用。大多抗凋亡藥物起效慢，并且對SCI癥狀的改善作用較弱。阿魏酸鈉（ferulic acid，F(xiàn)A）為多酚類化合物，是中藥當(dāng)歸的有效單體成分，具有抗氧化、清除自由基及抗炎等藥理作用［2-4］。重要的是，在多種疾病模型的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A具有較強的抗凋亡作用［5-7］；更重要的是，最新研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A具有增強自噬的作用，且其藥物作用強度與雷帕霉素（rapamycin）相當(dāng)［8］。結(jié)合FA抗炎抗氧化的活性，推測其對SCI具有治療作用。

本研究通過建立SCI大鼠模型，首先確認FA是否能夠改善SCI，其次深入研究自噬與凋亡相關(guān)蛋白的表達改變，進一步探討FA治療作用是否涉及其對自噬和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1藥物、試劑和儀器

FA購于美國Sigma公司。微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）抗體（貨號：ab128025，100 μL）、人卷曲螺旋肌球蛋白樣BCL-2結(jié)合蛋白/自噬基因1（human coiledcoil myosin-like BCL2-interacting protein 1，Beclin1）抗體（貨號：ab55878，50 μL）、β肌動蛋白（貨號：ab1801）和ECL曝光液（貨號：120711-92）均購于美國Abcam公司；Bcl-2抗體（貨號：sc7382）、Bax抗體（貨號：sc6236）和辣根過氧化物酶標記驢抗兔IgG二抗（貨號：sc2313）均購于美國Santa Cruz公司；PVDF膜（貨號：IPVH00011）購于北京Solarbio公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：P0012）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

Avanti-20XP型離心機（美國 Beckman-Coulter）；BP211D型電子天平（德國Sartorius公司；I×70型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；WDT-Ⅴ型腦立體定向儀（西安西北光電醫(yī)療器械廠）；Bio-Rad電泳與轉(zhuǎn)膜設(shè)備自動酶標分析儀（美國Bio-Rad公司）；GL-20C高速冷凍離心機（美國Thermo Scientific）；BMJ-Ⅲ型病理組織包埋機（常州中威電子儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)型石蠟切片機（英國珊頓公司）。

1.2動物和大鼠SCI模型的建立

SD雄性大鼠，90只，體質(zhì)量200 ～220 g，由中國科學(xué)院上海動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK（浙）2010-0150。每籠6只，室溫23 ～25℃，濕度40% ～60%，晝夜節(jié)律，自由攝食飲水。

將無癱瘓、無行動不便的清潔級SD大鼠，ip給予戊巴比妥鈉30 mg·kg-1麻醉，大鼠取俯臥位。按肋骨確定椎體序列，以肋骨為標志，取后正中，分離皮膚下筋膜與椎旁肌，暴露位于第8到第9胸椎（T8 ～T9）和T9 ～T10，在T9節(jié)段進行椎板切除術(shù)打開椎管，完全暴露脊髓背側(cè)面。采用血管動脈夾（30 g）夾閉脊髓2 min，過程中可觀察到大鼠后肢和尾部出現(xiàn)痙攣性抽搐后癱軟，之后將動脈夾取下，止血后，去除組織和血塊后縫合肌層與皮膚，加熱墊維持動物體溫在36 ～37℃，直至大鼠完全蘇醒。

大鼠蘇醒后，常規(guī)ip給予青霉素鈉20 kU·kg-1，并采用下腹部擠壓膀胱人工排尿，每日3 ～4次，直至自主排尿功能完全恢復(fù)。

1.3動物分組和處理

大鼠隨機分為假手術(shù)組、各時間點SCI模型組和FA治療組（FA給藥劑量參照文獻報道［9-10］），每組30只。模型組與FA治療組按照1.2制備模型；假手術(shù)組麻醉，但打開椎管后不進行脊髓夾閉。待大鼠蘇醒后，F(xiàn)A治療組po給予FA 100 mg·kg-1，每天2次（10：00與17：00），F(xiàn)A用羧甲纖維素鈉（carmellose sodium，CMC-Na）溶解，且新鮮配制，其他各組則給予CMC-Na。各組大鼠分別于手術(shù)后6 h，1，3，7和14 d進行行為學(xué)評價，各個時間點測試后每組處死6只大鼠，取T8 ～T10進行染色與生化指標測定。

1.4BBB（Basso，Beattie and Bresnahan）評分和斜板功能評分測試運動能力

1.4.1BBB評分

在造模前以及造模后6 h，1，3，7和14 d的SD大鼠進行BBB運動能力評分。即將大鼠置于一空曠場地，2個觀察者對側(cè)站立觀察大鼠的臀、膝、踝關(guān)節(jié)，行走，軀干運動及其協(xié)調(diào)情況。觀察時間為5 min，期間觀察者依照評分標準（0 ～21分）進行評分并繪制得分圖。由于嚙齒類動物自然恢復(fù)反射，即便是SCI大鼠也可在損傷后幾周內(nèi)重新獲得行走能力，后肢因形成脊髓反射弧可產(chǎn)出運動而無需經(jīng)過大腦。由于此原因，SCI大鼠在損傷后幾周內(nèi)后肢的活動能力會逐步提高，達到某個平臺，但無法恢復(fù)正常水平而造成永久性損傷。脊髓夾閉損傷以后，大鼠兩后肢的的運動能力喪失，肌力降為零。BBB評分<5，說明造模成功。實驗中采用雙盲、雙人獨立觀察記錄，最后取均值。

1.4.2斜板功能評分

將大鼠頭朝左橫放在改良的Rivlin斜板上，從水平位置（0°角）起逐漸增大角度，以大鼠能夠在板上停留5 s而不跌落的最大角度作為評分標準，試驗中采用雙盲、雙人獨立觀察記錄，重復(fù)3次取其平均值。

1.5HE染色觀察脊髓損傷程度

在每組相對應(yīng)時間點，取大鼠用戊巴比妥鈉30 mg·kg-1麻醉。將大鼠由腹部至胸骨剪開，暴露心臟，由左心室插入注射針頭，同時剪開右心耳，待右心耳流出液體變澄清后，更換為4%多聚甲醛快速灌注，待大鼠肢體僵硬后，解剖椎管取出損傷段脊髓，小心取出損傷處上下各0.5 cm脊髓，置于4%多聚甲醛中固定24 h。脊髓固定后，用紗布包好放在細水流下沖洗過夜。乙醇梯度脫水后包埋切片，厚度為4 μm。HE染色過程：在63 ～65℃溫度下烘片3 ～4 h后，進行脫蠟水化，染色后采用5%乙醇脫水，二甲苯透明，封片后，在顯微鏡下觀察脊髓損傷程度。

1.6免疫組化檢測LC3和Beclin1表達

免疫組化染色操作均按照免疫組化試劑盒說明書進行。取已固定的脊髓組織，包埋切片，厚度為4 μm，切片后進行脫蠟脫水，經(jīng)過PBS溶液洗滌后，經(jīng)熱修復(fù)抗原，進行封閉過程，封閉結(jié)束后，依次進行一抗孵育2 h與二抗孵育1 h，隨后進行DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片。封片后，在顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果。

1.7 Western蛋白印跡法檢測LC3，Beclin1，Bcl-2和Bax蛋白表達

各組樣本加300 μL的細胞裂解液（含蛋白酶和磷酸化酶抑制劑），勻漿后離心2次取上清液，BCA法進行蛋白定量。上樣量為60 μg蛋白，電泳分離及轉(zhuǎn)膜后，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h或4℃封閉過夜，4℃孵育一抗過夜（LC3和Beclin1稀釋比為：1∶1000 ～1∶2000），之后TBST洗膜3次，每次8 min，結(jié)束后加入二抗（稀釋倍數(shù)：1∶10 000）反應(yīng)1 h，洗膜3次，每次8 min。曝光顯影后，以β肌動蛋白作為內(nèi)參照，以目標蛋白與內(nèi)參蛋白的積分吸光度的比值表示蛋白的相對表達水平。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以x±s表示，數(shù)據(jù)進行多因素方差分析。組間的多重比較用Duncan檢驗。單因素方差分析中，采用Dunnettt檢驗進行多重比較。

2 結(jié)果

2.1FA對SCI大鼠BBB運動能力評分和斜板功能評分的影響

脊髓夾閉手術(shù)后，各組大鼠并未出現(xiàn)死亡情況，均存活。各組大鼠在SCI前及損傷后6 h，1，3，7和14 d分別進行了BBB運動能力評分和斜板功能（圖1）。假手術(shù)組脊神經(jīng)功能正常，BBB為21分，具有良好的運動功能。在SCI后，各組的BBB均穩(wěn)定在0 ～1分間，說明SCI大鼠模型成功制備，且損傷較為一致，減少了實驗誤差。經(jīng)歷7 d給藥后，治療7 d組評分6.2±3.6，明顯高于SCI模型組的3.0±1.7（P<0.05），并且隨著給藥天數(shù)的增加，評分差異更為顯著（P<0.01）。

斜板評分實驗的結(jié)果與BBB結(jié)果相似（圖1B）。給藥7 d后，F(xiàn)A治療組所測得的斜板角度為（26.7±8.7）°，與SCI組的（13.3±4.1）°相比明顯增加（P<0.01）；隨著給藥天數(shù)的增多，斜板角度也隨著增大，與SCI組相比具有顯著差異（P<0.01）。

Fig.1 Effect of ferulic acid（FA）on Basso，Beattie andBresnahan（BBB） locomotiontest（A） and inclined plane test（B）of spinal cord injury（SCI）rats.A spinal cord compression injury model was chosen to establish an SCI rat model in this experiment.During surgery，moderate contusion injuries were induced in rats using a vascular clip for 2 min，while sham group received the samesurgical procedures，but impaction had no effect on the spinal cord by the vascular clip.After SCI surgery，rats received two administrations（10：00 am and 5：00 pm）of FA（100 mg·kg-1，po）or vehicle（CMC-Na）for 14 d.BBB scoring method and inclined plane test were used to assess rat motor function at 6 h and 1，3，7 and 14 d.x±s，n=6.*P<0.05，**P<0.01，compared with SCI model group.

2.2FA對SCI大鼠脊髓組織的影響

HE染色顯示，正常大鼠T8 ～T10段脊髓組織結(jié)構(gòu)正常，纖維走向平行一致，且具有一定的連續(xù)性，且無出血現(xiàn)象和瘢痕組織生成。檢測造模后隨時間推移（6 h，1，3，7和14 d）大鼠受損脊髓的病理情況發(fā)現(xiàn)，在損傷出現(xiàn)的初期，脊髓內(nèi)部出血，結(jié)構(gòu)紊亂，逐漸出現(xiàn)組織水腫，瘢痕形成，出現(xiàn)組織纖維錯亂，神經(jīng)元減少，脊髓受損逐漸加重，最終脊髓結(jié)構(gòu)呈明顯空洞狀。在給予FA 7 d后，脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元略有增加，白質(zhì)中的神經(jīng)纖維排列具有一定的方向性，但排列依舊紊亂；給藥14 d后，脊髓灰質(zhì)白質(zhì)界線較為清晰，空洞狀有明顯改善（見圖2）。

Fig.2 Effect of FA on pathology of SCI rats by HE staining（10×）.See Fig.1 for the treatment.

2.3FA對SCI大鼠脊髓中Beclin1和LC3表達的影響

2.3.1免疫組織化學(xué)

圖3和圖4免疫組化結(jié)果表明，損傷前脊髓內(nèi)Beclin1和LC3陽性細胞數(shù)目較少，即圖中的棕色部分較少，而在損傷后6 h和1 d，Beclin1和LC3的陽性細胞均有增加，表現(xiàn)為圖中的棕色部分增加；在損傷后7 ～14 d，尤其是14 d組，Beclin1（圖3F）與LC3（圖4F）的陽性細胞數(shù)較損傷后6 h和1 d組，棕色陽性細胞數(shù)降低。相比于模型組，F(xiàn)A給藥6 h，1，3，7和14 d組也呈現(xiàn)出相似的變化趨勢。其中，F(xiàn)A給藥1 d組，Beclin1和LC3的棕色陽性細胞較損傷前明顯增加。

Fig.3 Effect of FA on expression of LC3 in spinal cord of SCI rats by immunohistochemical staining. See Fig.1 for the treatment.Scale bar=150 mm.Arrows show postive LC3 protein.

Fig.4 Effect of FA on expression of Beclin1 in spinal cord of SCI rats by immunohistochemical staining. See Fig.1 for the treatment.Scale bar=150 mm.Arrows show postive Beclin1 protein.

2.3.2Western蛋白印跡法

如圖5所示，與假手術(shù)組相比，模型組各時間點LC-Ⅱ/LC-Ⅰ（6 h除外）和Beclin表達明顯上調(diào)（P< 0.05，P<0.01）。與模型1 d組相比，F(xiàn)A 1 d治療組LC-Ⅱ/LC-Ⅰ及Beclin表達顯著上調(diào)（P<0.05），其他時間點FA治療組兩蛋白表達相對模型組有下調(diào)趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異。

Fig.5 Effect of FA on expression of LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ（A）and Beclin1（B）in spinal cord of SCI rats by Western blotting.See Fig.1 for the treatment.A2 and B2 were the semi-quantitative results of A1 and B1.x±s，n=6.*P< 0.05，**P<0.01，compared with sham（0 h）group；#P<0.05，compared with SCI model group.

2.4FA對SCI大鼠脊髓中Bcl-2和Bax表達的影響

如圖6所示，SCI后6 h ～7 d，Bcl-2與Bax的比值與假手術(shù)組相比無明顯變化；而14 d組，Bcl-2表達增加，比值也明顯增加（P<0.05）。相比于模型組，F(xiàn)A治療組Bcl-2與Bax的比值損傷后6 h ～3 d組無明顯變化，但7 ～14 d組比值顯著增加（P< 0.05）。

Fig.6 Effect of FA on expression of Bcl-2 and Bax in spinal cord of SCI rats by Western blotting.See Fig.1 for the treatment.B was the semi-quantitative results of A.x±s，n=6.*P<0.05，**P<0.01，compared with sham（0 h）group；#P< 0.05，compared with SCI model group.

3 討論

SCI的病理變化機制復(fù)雜，但其共同的主要表現(xiàn)為損傷后大量脊髓神經(jīng)的壞死。自噬與凋亡作為神經(jīng)死亡的主要進程，越來越多的研究表明自噬與凋亡機制與SCI密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在SCI早期給予西羅莫司（自噬增強劑）增強自噬后，能明顯改善大鼠的運動能力，表明增強自噬能明顯改善SCI病癥，同時抗凋亡作用的增強也是SCI修復(fù)的關(guān)鍵因素［11］。FA是中藥當(dāng)歸的主要有效成分之一，研究表明，其具抗凋亡作用的同時，具有西羅莫司相當(dāng)?shù)恼{(diào)控自噬的作用，結(jié)合SCI的病理特點與FA的藥理作用特點，推測FA能夠改善SCI病癥。這一推測也在本研究中得到了證實。本研究行為學(xué)結(jié)果表明，在SCI后，F(xiàn)A連續(xù)給予7 d能明顯改善脊髓損傷后的運動能力障礙，表明FA對SCI后的運動功能障礙有明顯的治療作用。HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A能夠改善SCI后的脊髓內(nèi)部出血、組織水腫及脊髓結(jié)構(gòu)空洞化，這一結(jié)果也驗證了行為學(xué)實驗，表明FA通過改善脊髓內(nèi)部微環(huán)境從而發(fā)揮治療作用。

為進一步研究FA治療SCI的分子機制，本研究檢測了自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1的表達。Beclin1是自噬重要的正調(diào)節(jié)因子，其主要通過控制自噬體的形成，從而調(diào)節(jié)自噬活性，在自噬起始階段起重要作用［12-13］。本研究結(jié)果顯示，Beclin1在SCI損傷初期，即SCI損傷后6 h ～1 d蛋白表達明顯增加，表明SCI損傷初期出現(xiàn)自噬，同時Beclin1的表達增加也驗證了其對自噬起始階段的影響，在其他缺氧缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)疾病動物模型中也發(fā)現(xiàn)，Beclin1的表達呈現(xiàn)損傷后初期增強的特點［14］。Kanno等［15］發(fā)現(xiàn)，SCI損傷后Beclin1的表達在損傷后4 h開始增加，在24 h達到峰值，這一結(jié)果也與本研究結(jié)果相符。在給予FA后，Beclin1表達明顯增加，表明FA在SCI初期增強了自噬。FA的增強自噬作用與其擬雷帕霉素樣的藥理作用密切相關(guān)，雷帕霉素能抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的活性而使得自噬被激活［16］，mTOR是自噬的主要調(diào)控蛋白。FA已被證明是一類天然的mTOR抑制劑［8］，因此FA能明顯增加SCI初期的Beclin1蛋白表達，與其抑制mTOR活性相關(guān)。本研究結(jié)果表明，在SCI損傷后期，Beclin1表達從損傷后3 d開始下降，這一結(jié)果也與而Kanno等［15］研究相符。而給予FA后，Beclin1蛋白表達并沒有升高，反而呈現(xiàn)下降趨勢，與其自噬增強作用不符，這可能與FA的抗凋亡作用有關(guān)。Beclin1與細胞凋亡因子——Bcl-2存在自噬/凋亡互反饋作用，大量研究也證實，Bcl-2對自噬起著抑制作用［17-18］，尤其是對Beclin1蛋白表達的抑制作用，而FA在各類細胞亦或是動物模型中，都表現(xiàn)出強大的抗凋亡作用，同時表現(xiàn)出增加Bcl-2的表達［4-7］。這表明在SCI損傷后期，F(xiàn)A可能通過增加Bcl-2的表達，增強抗凋亡作用，一定程度上抑制了自噬蛋白Beclin1的表達。

LC3也是自噬檢測過程中常用的一種蛋白。LC3有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式，分別定位于前自噬體和自噬體膜表面。當(dāng)自噬發(fā)生時，LC3-Ⅰ將向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)變，這一轉(zhuǎn)變過程代表著自噬的發(fā)生過程。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組LC3-Ⅱ表達較少，而SCI損傷后初期表達明顯增加，且在損傷后1 d達到峰值，這一結(jié)果與Kanno等［19］、Carloni等［20］和Ginet等［21］的報道結(jié)果相吻合，LC3-Ⅱ表達達到峰值大多在SCI損傷后12 h ～3 d，之所以有這樣的時間差距，可能是因為各自采用的動物模型不同或是脊髓夾閉時間的不同而造成損傷程度不一，從而導(dǎo)致LC3-Ⅱ達峰時間的不同。在LC3-Ⅱ變化的同時，LC3-Ⅰ的變化并不明顯，這也符合相關(guān)研究的報道，因為在Western蛋白印跡實驗中，LC3-Ⅱ較LC3-Ⅰ更為敏感［22］，因此LC3-Ⅱ表達的變化更易被檢測。在給予FA后，發(fā)現(xiàn)初期的LC3-Ⅱ表達明顯增加，表明FA在SCI初期增強了自噬，這是依賴于對mTOR的抑制作用，而在SCI后期，F(xiàn)A的增強自噬作用消失則可能與機體自身抗凋亡機制的產(chǎn)生密切相關(guān)。

基于本研究LC-3和Beclin1蛋白表達的變化，推測SCI后期FA可能存在抗凋亡作用。為了論證這一假說，本研究檢測了凋亡相關(guān)蛋白的表達。凋亡是一種受到多層次、多通路、多基因蛋白調(diào)控的途徑，多種基因參與凋亡的調(diào)控，這些基因主要包括Bcl-2家族基因，即刻早期基因，p53和Ice基因家族等。其中，最為主要的有Bcl-2和bd-XL等抑制調(diào)亡的基因，以及Bax和BIK等促進調(diào)亡的基因［23-24］。因此，本研究檢測了抗凋亡蛋白Bcl-2與致凋亡蛋白Bax的表達，并且兩者作為細胞凋亡的最后通路之一，也與SCI密切相關(guān)［25-26］。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SCI損傷早期，Bcl-2的表達并無明顯的增加，同時Bax的表達也未見下降，兩者比值與假手術(shù)組相比無明顯變化，而在SCI后14 d，Bcl-2表達增加，Bax表達減少，隨著時間的推移，比值明顯變大，表明抗凋亡作用增強，F(xiàn)A能明顯增加SCI后期的Bcl-2與Bax的比值，表明在SCI后期，F(xiàn)A通過增強抗凋亡作用，改善SCI病癥，同時因為自噬與凋亡的互反饋調(diào)節(jié)作用，F(xiàn)A后期的抗凋亡作用可能抑制其自噬增強的作用，這在一定程度上解釋了SCI后期FA增強自噬作用消失的現(xiàn)象。

基于本研究結(jié)果，課題組提出以下推測：①在SCI損傷后初期，大量神經(jīng)受損，自噬機制啟動，因此初期的自噬最為明顯，F(xiàn)A通過增強自噬能夠增強清除作用，有利于脊髓損傷的治療；②SCI后期模型組自噬現(xiàn)象的減少，可能是由于機體自身抗凋亡機制的啟動，而FA干預(yù)后，因其本身強大的抗凋亡特點，尤其是對Bcl-2表達的上調(diào)，從而一定程度上抑制自身自噬增強的作用，從而導(dǎo)致FA給藥在后期對自噬并無明顯增強作用。

綜上所述，F(xiàn)A治療作用可能涉及對自噬和凋亡的影響，同時揭示了SCI后自噬可能存在著先增強后減弱的發(fā)展過程，而抗凋亡作用則可能存在一個逐漸增強的過程，藥物通過增強前期的自噬或是增強后期抗凋亡作用可能均會發(fā)揮良好的治療作用。進一步研究自噬與凋亡機制的相互作用對SCI病程發(fā)展的影響，為SCI的發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)，為相關(guān)治療藥物的研發(fā)開拓新方向。

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Effect of ferulic acid on expression of microtubule-associated protein light chain 3，Beclin1，Bcl-2 and Bax in spinal cord injury rats

YU Xue-feng1，JIANG Xi2，3，WANG Guo-kang1，ZHANG Jia-jia1，ZHAO Ying-zheng3，PAN Jian-chun3
（1.Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo 315000，China；2.Mingzhou Hospital Zhejiang University，Ningbo 315000，China；3.Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China）

OBJECTIVE To investigate the effect of ferulic acid（FA）on motor function of rats with a spinal cord injury model（SCI）and its possible effects on expression of microtubule-associated protein light chain 3（LC3），Beclin1，Bcl-2 and Bax.METHODS SD rats were randomly divided into 3 groups：sham group，SCI group，F(xiàn)A（100 mg·kg-1，po）group.Rats were subjected to moderate contusion inju?ries using a vascular clip for 2 min to establish an SCI animal model beforfe they were given BBB scores and inclined plate scoring function test on 6 h，1，3，7 and 14 d after SCI.After the test，rats were sacrificed.Spinal cords were observed by hematoxylin eosin（HE）staining.Furthermore，the expressions of LC3，Beclin1，Bcl-2 and Bax were detected by Western blotting.RESULTS Compared with the sham group，BBB scores and inclined plate function scores significantly decreased in model group.The BBB scores decreased from 21 in sham group to（0.5±0.5）in SCI group，and inclined plate function scores decreased from 70°in sham group to（5.8±2.0）°in SCI group.However，this was reversed by FA treatment. BBB scores and inclined plate function scores increased from 3.0±1.7 to 6.2±3.6（P<0.05）and from（13.3±4.1）°to（26.7±8.7）°（P<0.05）after FA waspogiven for 7 d，respectively.HE staining showed the gradual emergence of internal spinal cord edema，while the structural changes associated with spinal cord injury could be significantly reversed by administration of FA.Moreover，the expression of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰand Beclin1 was significantly increased in SCI 1 d group（P<0.01），but was decreased in 14 d group when compared with SCI 1 d group（P<0.05）.The expression of Bcl-2 was increased in SCI 14 d group，and the ratio of Bcl-2/Bax was increased on 14 d after SCI（P<0.05）.Compared with the SCI group，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰand Beclin1 expression was increased in FA-treated 1 d group（P<0.05），Bcl-2 expression was increased in FA-treated 14 d group and the ratio of Bcl-2/Bax was significantly increased on 14 d after SCI（P<0.05）.CONCLUSION FA has a therapeutic effect on SCI，which may be related to the impact of neuronal autophagy and apoptosis.Meanwhile，autophagy of SCI may be a process of gradual enhancement followed by weakening，and the anti-apoptosis effect may gradually increase with autophagy.

ferulic acid；spinal cord injury；apoptosis；autophagy

YU Xue-feng，Tel：15088556139，E-mail：349401267@qq.com

R963

A

1000-3002-（2016）07-0714-09

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.07.002

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（81360195）

2015-10-30接受日期：2016-04-11）

（本文編輯：喬 虹）

國家自然科學(xué)基金項目（81360195）

俞雪鋒，男，碩士研究生，助教，主要從事神經(jīng)精神藥理學(xué)研究。

俞雪鋒，E-mail:349401267@qq.com