葉 園 何劍峰 李凱軍

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，南寧市 530021)

·微創(chuàng)醫(yī)學(xué)技術(shù)前沿·

Graves’ 眼病患者眼眶脂肪的形態(tài)學(xué)研究▲

葉 園 何劍峰*李凱軍

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，南寧市 530021)

目的 探討Graves’眼病患者眼眶脂肪細(xì)胞的生物學(xué)特性。方法 選擇12例行眼眶減壓術(shù)的Graves’眼病患者為觀察對象，術(shù)中取眼眶脂肪組織，采用酶消化培養(yǎng)法進(jìn)行體外培養(yǎng)，行蘇丹Ⅲ染色、病理學(xué)檢查，觀察活動(dòng)期及非活動(dòng)期Graves’眼病患者眼眶脂肪細(xì)胞的形態(tài)特征。結(jié)果 在體外培養(yǎng)過程中，眼眶脂肪組織中的多角形分枝細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞。活動(dòng)期患者眼眶脂肪組織中的多角形分枝細(xì)胞的數(shù)目明顯多于非活動(dòng)期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Graves’眼病活動(dòng)期患者的眼眶脂肪組織中存在大量的淋巴細(xì)胞浸潤，非活動(dòng)期患者的眼眶脂肪組織中無炎癥細(xì)胞浸潤。結(jié)論 Graves’眼病活動(dòng)期患者眼眶脂肪組織增生比非活動(dòng)期患者更活躍。

Graves’眼病；脂肪細(xì)胞；眼眶；淋巴細(xì)胞；眼外肌；形態(tài)學(xué)

Graves’眼病(Graves’ Ophthalmopathy，GO)又稱為甲狀腺相關(guān)眼病，是一種與自身免疫性甲狀腺疾病密切相關(guān)的眼病，據(jù)統(tǒng)計(jì)30%～50%的Graves’病患者合并有GO[1]。Graves’眼病通常會(huì)影響患者眼眶軟組織，包括眼外肌及眶周脂肪組織，導(dǎo)致眶內(nèi)炎癥及眼眶周圍軟組織廣泛重塑，脂肪組織及眼外肌體積增加[2]。眼球突出是Graves’眼病患者特征性的臨床表現(xiàn)，而眼眶脂肪組織擴(kuò)張則被認(rèn)為是造成眼眶內(nèi)容物體積增加，最終導(dǎo)致眼球突出的重要因素。目前，眼眶脂肪細(xì)胞在Graves’眼病發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到關(guān)注。本研究采用酶消化培養(yǎng)法對Graves’眼病患者眼眶脂肪細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和觀察，以了解其生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選擇2015年1月至2016年4月在我院眼科行眼眶減壓手術(shù)的Graves’眼病患者12例，其中男7例，女5例；年齡23～67歲，平均48.6歲；病史2～6年，平均4.5年；活動(dòng)期7例，非活動(dòng)期5例。標(biāo)本取自患者眼眶后部脂肪組織。本研究獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，且所有患者術(shù)前均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 胎牛血清、DMEM/F-12(1 ∶1)培養(yǎng)液購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品公司(生產(chǎn)批號分別為：NYB0814、NZE1150)，Ⅰ型膠原酶購自美國Sigma公司(生產(chǎn)批號：C0130)，蘇丹Ⅲ購自上海研生公司(生產(chǎn)批號：20141126)，胰蛋白酶、青鏈霉素混合液、PBS溶液購自北京索萊寶生物公司(生產(chǎn)批號分別為：20141229、20150316、20150302)。

1.2.2 主要儀器 倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS)，臺式離心機(jī)(Hettich Mikro 120)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Shellab公司)。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)液的配制 培養(yǎng)液1：商品化的DMEM/F-12培養(yǎng)液；培養(yǎng)液2：取100 mL培養(yǎng)液1加入生物素、地塞米松、胰島素使其終濃度分別為33 μmol/L、1 μmol/L、10 μg/mL；培養(yǎng)液3：取100 mL培養(yǎng)液1加入IBXM使其終濃度為0.25 mmol/L；以上培養(yǎng)液分裝后于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫褂们疤砑与p抗，即青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL。

1.3.2 消化液的配制 按說明稱?、裥湍z原酶150 mg、牛血清白蛋白2 g，加入0.01 mol/L磷酸緩沖液(PBS)定溶至100 mL，調(diào)整pH值為7.2～7.4。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)

1.3.3.1 采用酶消化培養(yǎng)法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng) 術(shù)中取患者眼眶后部脂肪組織標(biāo)本后，立即置入滅菌的玻璃培養(yǎng)皿中，用含青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 U/mL)的PBS溶液漂洗2次后，再用不含抗生素的PBS溶液清洗2次，隨后分離、去除眼眶脂肪組織中肉眼可見的血管和纖維成分，用眼科剪剪成1 mm×1 mm小塊，加入膠原酶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化，15 h后取出培養(yǎng)皿，1 000 r/min離心10 min，棄掉上清液及漂浮的脂肪塊，用培養(yǎng)液1把沉積的細(xì)胞制成混懸液，于六孔板中接種，種板密度為3×104/cm2，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。16 h后取出培養(yǎng)板，以PBS輕輕洗掉未粘附細(xì)胞，更換為培養(yǎng)液3誘導(dǎo)、維持脂肪細(xì)胞分化，視細(xì)胞生長狀況每3～4 d更換一次培養(yǎng)液2，使用倒置相差顯微鏡觀察、記錄脂肪細(xì)胞的生長狀況，對多角形分枝細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.3.2 眼眶脂肪細(xì)胞的傳代 當(dāng)六孔板內(nèi)脂肪細(xì)胞繁殖到基本融合時(shí)，吸干并棄掉舊的培養(yǎng)液，以PBS洗滌2次，加入適量胰蛋白酶進(jìn)行消化，數(shù)分鐘后倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞間隙增大，收縮呈近乎圓形，立即加入含血清培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打后1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入適量培養(yǎng)液2使細(xì)胞密度為2×104/cm2，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。視細(xì)胞生長狀況每3～4 d更換一次培養(yǎng)液2，使用倒置相差顯微鏡觀察、記錄脂肪細(xì)胞的生長狀況，對多角形分枝細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.3.3 多角形分枝細(xì)胞計(jì)數(shù)方法 對活動(dòng)期和非活動(dòng)期GO患者眼眶脂肪細(xì)胞均取3個(gè)孔板進(jìn)行觀察，隨機(jī)選取9個(gè)高倍視野，按上、中、下、左、右、左上、左下、右上、右下的方位，對多角型分枝細(xì)胞予以計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.3.4 蘇丹Ⅲ染色 稱取0.1 g蘇丹Ⅲ，溶解于20 mL 95%酒精中配制成染液。將孔板中培養(yǎng)液吸干棄掉，PBS輕輕漂洗2次，自然干燥后加入75%酒精固定7 min，吸干酒精后加入適量蘇丹Ⅲ染液，將孔板置于60℃烤箱中染色30 min，以濃度為50%的酒精進(jìn)行分化，再以蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，于倒置相差顯微鏡下觀察、記錄細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.3.5 病理學(xué)檢查 將術(shù)中取患者的眼眶脂肪組織標(biāo)本置于含有固定液的標(biāo)本瓶中，送至病理室做病理學(xué)檢查。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以 (x±s)表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GO患者眼眶脂肪細(xì)胞的形態(tài)、特征觀察 脂肪細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞貼壁后4 d，開始觀察到多角形分枝細(xì)胞，第7～8天時(shí)開始增殖，多角形分枝細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，2 d后該細(xì)胞變成橢圓形或近似圓形，約第15天時(shí)分化成單脂滴或多脂滴脂肪細(xì)胞?；顒?dòng)期和非活動(dòng)期患者眼眶脂肪細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)一些多角形分枝細(xì)胞，在形態(tài)學(xué)上兩組患者并沒有差異。見圖1、圖2。

圖1 活動(dòng)期GO患者的眼眶脂肪細(xì)胞，可見多角形分枝細(xì)胞數(shù)目較多，胞體較大(×400)

圖2 非活動(dòng)期GO患者的眼眶脂肪細(xì)胞，多角形分枝細(xì)胞數(shù)目較少(×400)

活動(dòng)期GO患者樣本中多角形分枝細(xì)胞的數(shù)目明顯多于非活動(dòng)期GO患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.337，P<0.001)。見表1。

表1 活動(dòng)期及非活動(dòng)期GO患者眼眶脂肪組織中 多角型分枝細(xì)胞數(shù)目的比較 (x±s)

2.2 GO患者眼眶脂肪細(xì)胞的蘇丹Ⅲ染色結(jié)果 對GO患者眼眶脂肪細(xì)胞(梭形、多角型分枝細(xì)胞)進(jìn)行蘇丹Ⅲ染色后觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞漿豐富，被染成紅色的為胞體，不著色的為細(xì)胞分枝(圖3)，已經(jīng)分化成熟了的脂肪細(xì)胞則呈圓形，其胞膜較薄，胞漿豐富呈紅色，蘇丹Ⅲ染色可證明為脂肪成分，纖維成分不著色。

2.3 GO患者眼眶脂肪組織的病理學(xué)檢查 于患者眼部手術(shù)中分離眼眶脂肪組織作病理學(xué)檢查，患者情況：活動(dòng)期7例，非活動(dòng)期5例。檢查結(jié)果提示，活動(dòng)期患者眼眶脂肪組織中存在大量的淋巴細(xì)胞浸潤，并有脂肪細(xì)胞擴(kuò)張；而非活動(dòng)期患者眼眶脂肪組織中無炎癥細(xì)胞浸潤，主要為脂肪細(xì)胞的擴(kuò)張。見圖4、圖5。

圖4 活動(dòng)期GO患者脂肪細(xì)胞間隔中有大量淋巴細(xì)胞浸潤，箭頭所示，脂肪細(xì)胞擴(kuò)張(×400)

圖5 非活動(dòng)期GO患者部分脂肪細(xì)胞明顯擴(kuò)張，脂肪細(xì)胞大小不一，但無淋巴細(xì)胞浸潤(×400)

3 討 論

脂肪組織是一種既具有炎性特征、又具有內(nèi)分泌特征的組織，可分泌多種因子，如炎性因子、細(xì)胞因子等，在GO的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。近年來，眼眶脂肪細(xì)胞在GO發(fā)病機(jī)制的研究廣受關(guān)注。

眼眶脂肪細(xì)胞的分化過程大致可分為四個(gè)階段：多能干細(xì)胞、間質(zhì)前體細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞、成熟脂肪細(xì)胞。人體脂肪組織中的前脂肪細(xì)胞可分化為成熟脂肪細(xì)胞，并且保持著終身分化的能力，因此患者眼眶脂肪組織的增加不僅是脂肪細(xì)胞體積的增加，同時(shí)可伴有脂肪細(xì)胞數(shù)目上的增加。研究GO患者眼眶病變時(shí)，可考慮對眼眶脂肪細(xì)胞進(jìn)行研究。我們通過應(yīng)用組織培養(yǎng)法對人眼眶前脂肪細(xì)胞，即眼眶脂肪組織中的多角形分枝細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)，已成功將其分化為成熟脂肪細(xì)胞[3]，發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期GO患者眼眶脂肪增生比非活動(dòng)期患者更活躍，大量的淋巴細(xì)胞浸潤，分泌多種細(xì)胞因子，促進(jìn)眼眶脂肪細(xì)胞的數(shù)量增多和體積增大。研究表明，由幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化，其中最主要的是CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein，C/EBP) 家族和核受體過氧化物酶體增生物活化受體(PPAR)γ蛋白家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[4]。PPARγ、C/EBPα協(xié)同誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞得以最終分化，同時(shí)脂肪組織自身分泌許多生物活性物質(zhì)與其他一些調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化的因子，如脂聯(lián)素、瘦素等，在促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖分化中起到重要的作用。Kim等[5]對Graves’病患者研究發(fā)現(xiàn)，合并有GO的患者其血清脂聯(lián)素、瘦素水平明顯高于沒有GO的患者；臨床活動(dòng)性評分、眼部病情嚴(yán)重程度與血清脂聯(lián)素、瘦素水平呈正相關(guān)。也有研究表明，透明質(zhì)酸的過度產(chǎn)生也會(huì)導(dǎo)致脂肪細(xì)胞增殖[6]，在這些因子的共同作用下，刺激眶內(nèi)免疫反應(yīng)逐漸擴(kuò)大，炎癥病變加重，導(dǎo)致眼球突出、眶周水腫等一系列臨床表現(xiàn)。

GO是一種自身免疫性疾病，根據(jù)GO的病程特點(diǎn)及臨床表現(xiàn)，可分為活動(dòng)期和非活動(dòng)期(靜止期)。GO活動(dòng)期的癥狀和體征包括：角膜潰瘍、眼球突出、結(jié)膜充血、水腫、復(fù)視、視神經(jīng)受壓導(dǎo)致的視力喪失。非活動(dòng)期GO是指炎癥消退并且有臨床癥狀改善。本研究采用酶消化培養(yǎng)法對GO患者眼眶脂肪細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在GO活動(dòng)期患者的眼眶脂肪組織中，存在大量的淋巴細(xì)胞浸潤，而非活動(dòng)期患者眼眶脂肪組織中無淋巴細(xì)胞浸潤。在GO病變過程中，新的脂肪細(xì)胞生成、粘多糖聚集導(dǎo)致水腫，致使眼外肌、眼眶脂肪結(jié)締組織擴(kuò)張，從而引發(fā)一系列的臨床表現(xiàn)。受累的組織中T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞彌漫浸潤，少許巨噬細(xì)胞、促炎性細(xì)胞因子可見。這些細(xì)胞因子由浸潤的單核細(xì)胞、眼眶脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌，參與GO的炎癥反應(yīng)。GO活動(dòng)期以Th1免疫反應(yīng)為主，非活動(dòng)期以Th2免疫反應(yīng)為主。疾病的早期活動(dòng)性階段主要是多形核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，而疾病慢性階段主要是T淋巴細(xì)胞的浸潤[7]。一些免疫抑制治療方案廣泛應(yīng)用于GO的治療，包括口服糖皮質(zhì)激素、靜脈注射糖皮質(zhì)激素、球后注射糖皮質(zhì)激素和眼眶放療[8]；單獨(dú)使用糖皮質(zhì)激素進(jìn)行免疫抑制治療或聯(lián)合放射治療是GO活動(dòng)期首選治療方案，其治療機(jī)制為殺傷對放射線敏感的淋巴細(xì)胞，減少細(xì)胞因子的分泌。而非活動(dòng)期患者眼眶脂肪組織中無淋巴細(xì)胞浸潤，這也是非活動(dòng)期患者對放射治療效果差的原因。

本研究結(jié)果顯示，GO活動(dòng)期患者脂肪細(xì)胞的形態(tài)與非活動(dòng)期患者比較無明顯差異，主要是在數(shù)量上的增多及大量的淋巴細(xì)胞浸潤，新生的脂肪細(xì)胞可能與周圍大量淋巴細(xì)胞和其它炎癥因子的刺激有密切關(guān)系，這對GO的治療具有一定的啟示意義，即采用減少炎癥細(xì)胞的產(chǎn)生、抑制細(xì)胞因子的活性的措施對促使GO活動(dòng)期轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔顒?dòng)期有一定的幫助。

本研究雖然證實(shí)了GO活動(dòng)期存在大量淋巴細(xì)胞，但是眼眶脂肪細(xì)胞的具體增殖分化機(jī)制仍未明確。這有待于今后建立GO疾病模型對其進(jìn)行深入了解。

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Study of morphology in orbital adipose of Graves’ ophthalmopathy patients

YEYuan，HEJianfeng，LIKaijun

(DepartmentofOphthalmology，theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China)

Objective To observe the biological characteristics of orbital adipose cells in Graves’ ophthalmopathy patients. Methods Twelve Graves’ ophthalmopathy patients undergoing orbital decompression surgery were selected as the object of observation, orbital adipose tissues specimens were obtained in the course of surgery.Those adipose tissues were cultured in vitro by enzymatic digestion culture method，maked Sudan III staining and pathological examination.Observed the morphological features of adipose cells from active phase and inactive phase patients. Results During the in vitro cultivation of adipose tissues,The orbit branch polygon cells were induced into mature adipose cells. The number of branch polygon cells in active patients were significantly more than inactive patients, the difference was statistically significant between the two groups(P<0.05). There was a large number of lymphocytes infiltrated in the orbital adipose tissue of active patients，this kind of situation did not appear on inactive patients. Conclusion The adipose tissue hyperplasia in active period were more active than those in inactive period.

Graves’ ophthalmopathy; Orbital adipose cells;Orbit; Lymphocytes; Extraocular muscles;Morphology

國家自然科學(xué)基金(編號：81360152)

葉園(1990～)，女，在讀碩士研究生，研究方向：視神經(jīng)炎及內(nèi)分泌眼病。

R 777.5

A

1673-6575(2016)06-0815-04

10.11864/j.issn.1673.2016.06.01

2016-08-15

2016-10-12)

*通信作者