李松濤， 劉　江， 黃學(xué)石

(1. 承德醫(yī)學(xué)院 河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北 承德　067000;

2. 中國醫(yī)科大學(xué) 代謝病分子機制與藥物研究所，遼寧 沈陽　110122)

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娃兒藤堿類似物DCB-3501的全合成及其細胞毒性

李松濤1*， 劉江2， 黃學(xué)石2

(1. 承德醫(yī)學(xué)院 河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北 承德067000;

2. 中國醫(yī)科大學(xué) 代謝病分子機制與藥物研究所，遼寧 沈陽110122)

摘要：以3,4-二甲氧基苯甲醛與3,4-二甲氧基苯乙酸為起始原料，經(jīng)Perkin縮合、自由基氧化偶聯(lián)反應(yīng)、Swern氧化、還原胺化及付克?；?步反應(yīng)全合成了娃兒藤堿類似物DCB-3501，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和ESI-MS確證。體外細胞毒性測試結(jié)果表明：DCB-3501對人結(jié)腸癌細胞HCT116、人胃癌細胞BGC-823、人肝癌細胞HepG-2、人宮頸癌細胞HeLa和人大細胞肺癌細胞H460的IC50分別為20.0 μmol·L-1, 50.9 μmol·L-1, 2.1 μmol·L-1, 65.8 μmol·L-1和30.8 μmol·L-1。

關(guān)鍵詞：3,4-二甲氧基苯甲醛; 3,4-二甲氧基苯乙酸; 娃兒藤堿類似物; DCB-3501； Perkin縮合; Swern氧化; 付克?；?； 全合成； 細胞毒性

娃兒藤堿(Tylophorine)及其類似物(Chart 1)是從羅藦科娃兒藤屬和鵝絨藤屬等植物中提取分離到的一類天然生物堿[1-2]。上世紀九十年代初，美國國家癌癥研究所開展了一項針對60種人腫瘤細胞系的體外增殖抑制活性篩選實驗，結(jié)果表明多種娃兒藤堿的天然產(chǎn)物具有潛在、廣譜的

Chart 1

Scheme 1

抗腫瘤活性，GI50可達到納摩級，有望成為新型抗腫瘤先導(dǎo)化合物。此后，該類生物堿及其類似物的化學(xué)合成、結(jié)構(gòu)修飾及抗腫瘤活性日益成為研究熱點[2-5]。

DCB-3501是Tylophorine C-14位氫被(R)-OH取代的類似物(Chart 1)，由Rapoport H等[6]首次合成。該方法的關(guān)鍵步驟是利用谷氨酸二異丙酯與2,3,6,7-四甲氧基-9-菲醛反應(yīng)引入N-谷氨酸二異丙酯側(cè)鏈，該側(cè)鏈經(jīng)環(huán)化后得到E環(huán)，再進一步經(jīng)水解與付克?；磻?yīng)構(gòu)建D環(huán)，最后D， E環(huán)上的羰基分別經(jīng)過還原得到DCB-3501。 Cheng等[7-8]研究結(jié)果表明DCB-3501對人肝癌細胞HepG-2、鼻咽癌細胞KB均具有體外增殖抑制活性，EC50分別為(110±45)nmol·L-1和(106±84)nmol·L-1。 Wang等[9]發(fā)現(xiàn)DCB-3501對人肺癌細胞A549、人白血病細胞HL60也表現(xiàn)出一定的增殖抑制活性。

本文以3,4-二甲氧基苯甲醛與3,4-二甲氧基苯乙酸為起始原料，經(jīng)Perkin縮合、自由基氧化偶聯(lián)反應(yīng)、Swern氧化、還原胺化及付克?；?步反應(yīng)實現(xiàn)了DCB-3501的全合成(Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和ESI-MS確證。并考察了其對人結(jié)腸癌細胞HCT116等五種腫瘤細胞株的體外細胞毒性。

1實驗部分

1.1　試劑與儀器

Bruker ARX-300型或Bruker AV-600型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Finnigan LCQ型質(zhì)譜儀。

1.2　合成

(1)α-(3,4-二甲氧基苯基)-3,4-二甲氧基肉桂酸(1)的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入3,4-二甲氧基苯甲醛1.7 g(10 mmol)， 3,4-二甲氧基苯乙酸1.9 g(10 mmol)，三乙胺3 mL和醋酸酐20 mL，攪拌下回流(140 ℃)反應(yīng)7 h。冷卻至室溫，加入水100 mL，回流30 min；冷卻至室溫，用乙酸乙酯(3×300 mL)萃取，合并萃取液，用飽和食鹽水洗滌至水層呈中性，有機相用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，用無水乙醇重結(jié)晶得深黃色粉末固體1 3.1 g，收率90%；1H NMRδ: 3.47(s, 3H, OCH3), 3.81(s, 3H, OCH3), 3.84(s, 3H, OCH3), 3.89(s, 3H, OCH3), 6.55(d,J=1.8 Hz, 1H, ArH), 6.70(d,J=1.8 Hz, 1H, ArH), 6.72(d,J=8.5 Hz, 1H, ArH), 6.84(dd,J=8.2 Hz, 1.8 Hz, 1H, ArH), 6.85(dd,J=8.5 Hz, 1.8 Hz, 1H, ArH), 6.92(d,J=8.2 Hz, 1H, ArH), 7.86(s, 1H, C=CH), 12.44(s, 1H, CO2H); ESI-MSm/z: 343{[M-H]-}。

(2) 2,3,6,7-四甲氧基-9-菲酸(2)的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入1 3.0 g(8.6 mmol)和無水二氯甲烷75 mL，攪拌使其溶解；氮氣保護，加入無水三氯化鐵5.8 g(36.7 mmol)，于室溫反應(yīng)8 h。加甲醇20 mL，攪拌10 min，減壓濃縮，加入甲醇20 mL，過濾，濾餅用甲醇(3×10 mL)洗滌，干燥得黃綠色固體2 2.1 g，收率70%；1H NMRδ: 3.90(s, 3H, OCH3), 3.91(s, 3H, OCH3), 4.06(s, 3H, OCH3), 4.11(s, 3H, OCH3), 7.55(s, 1H, ArH), 8.00(s, 1H, ArH), 8.03(s, 1H, ArH), 8.42(s, 1H, ArH), 8.55(s, 1H, ArH), 12.88(br s, 1H, CO2H)。

(3) 2,3,6,7-四甲氧基-9-菲醇(3)

冰鹽浴冷卻下，在2 1.78 g(5.2 mmol)的無水THF(100 mL)溶液中加入氫化鋰鋁1.19 g(31.2 mmol)，反應(yīng)30 min；回流(100 ℃)反應(yīng)2 h。冷卻至室溫，加入冰塊和飽和碳酸氫鈉溶液(100 mL)，攪拌10 min，分液，水相用THF(2×50 mL)萃取，合并有機相和萃取液，依次用飽和食鹽水(200 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：A=V(二氯甲烷) ∶V(甲醇)=20 ∶1]純化得白色固體3 1.19 g，收率70%；1H NMRδ: 3.97(s, 3H, OCH3), 4.03(s, 3H, OCH3), 4.08(s, 3H, OCH3), 4.10(s, 3H, OCH3), 5.05(s, 2H, CH2), 7.10(s, 1H, ArH), 7.47(s, 1H, ArH), 7.48(s, 1H, ArH), 7.68(s, 1H, ArH), 7.74(s, 1H, ArH)。

(4) 2,3,6,7-四甲氧基-9-菲醛(4)的合成

將干式變的冷卻方式由自然風(fēng)冷（AN）改為強迫空氣冷卻（AF），即通過風(fēng)機將空氣強迫吹進變壓器散熱氣道，增強氣道空氣對流。

在反應(yīng)瓶中加入無水二氯甲烷20 mL，丙酮-干冰浴冷卻，保持溫度在-78 ℃以下攪拌10 min，加入草酰氯1.6 mL(18.72 mmol)，反應(yīng)20 min；緩慢滴加二甲基亞砜3 mL(42 mmol)的無水二氯甲烷(20 mL)溶液，滴畢(20 min，保持溫度在-78 ℃)，反應(yīng)30 min；緩慢滴加3 1.0 g(3.04 mmol)的二氯甲烷(20 mL)/二甲基亞砜(1.5 mL)溶液，滴畢(30 min)，反應(yīng)30 min；滴入三乙胺11 mL(78 mmol)，滴畢(20 min)，繼續(xù)低溫反應(yīng)30 min。升至室溫，加入1 mol·L-1鹽酸100 mL，劇烈攪拌10 min，調(diào)節(jié)水層pH呈酸性，分出有機層，水層用二氯甲烷(2×50 mL)萃取，合并有機層和萃取液，用無水硫酸鈉干燥，蒸干，用甲醇重結(jié)晶得黃色固體4 0.70 g,收率70%；1H NMRδ: 4.06(s, 3H, OCH3), 4.10(s, 3H, OCH3), 4.12(s, 3H, OCH3), 4.15(s, 3H, OCH3), 7.28(s, 1H, ArH), 7.72(s, 1H, ArH), 7.74(s, 1H, ArH), 8.01(s, 1H, ArH), 8.94(s, 1H, CHO)。

(5)N-(2,3,6,7-四甲氧基菲基-9-亞甲基)-L-脯氨酸(5)的合成

將L-脯氨酸431 mg(3.75 mmol)溶于甲醇(10 mL)中，加入甲醇/甲醇鈉溶液，調(diào)至pH≈7，攪拌下緩慢滴加4 500 mg(1.5 mmol)的二氯甲烷(30 mL)溶液，滴畢，反應(yīng)30 min，加入NaBH3CN 300 mg(4.5 mmol)，于室溫反應(yīng)20 h。減壓蒸干，經(jīng)硅膠柱層析(梯度洗脫劑：A=50 ∶1~1 ∶1)純化得白色固體5 0.61 g,收率60%；1H NMRδ: 1.91(m, 2H, CH2), 2.12(m, 2H, CH2), 2.99(d,J=12.0 Hz, 1H, ArCH2N), 3.39(m, 1H, CH2N), 3.47(m, 1H, CH2N), 3.90(s, 3H, OCH3), 4.02(s, 3H, OCH3), 4.07(s, 3H, OCH3), 4.17(s, 3H, OCH3), 4.52(m, 1H, CHN), 4.97(d,J=12.0 Hz, 1H, ArCH2N), 7.12(s, 1H, ArH), 7.53(s, 1H , ArH), 7.59(s, 1H, ArH), 7.64(s, 1H, ArH), 7.65(s, 1H, ArH); ESI-MSm/z: 426{[M+H]+}。

(6) DCB-3501的合成

在反應(yīng)瓶中加入5 220 mg(0.5 mmol)，氮氣保護下于室溫加入多聚磷酸(PPA， 5 mL)，于105 ℃反應(yīng)5 h。冷卻至室溫，加入1 mol·L-1KOH溶液50 mL，調(diào)至pH 10，用二氯甲烷萃取，萃取液用等量飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑得黃褐色固體，用無水THF 10 mL溶解，攪拌下于室溫加入氫化鋰鋁50 mg(1.3 mmol)，反應(yīng)1 h。加入二氯甲烷(30 mL)和飽和碳酸鈉溶液(30 mL)，劇烈攪拌10 min，靜置，分離有機層，水相用二氯甲烷(2×50 mL)萃取，合并萃取液和有機相，用無水硫酸鈉干燥，蒸干后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=50 ∶1)純化得灰白色固體DCB-3501 40 mg，收率20%；1H NMRδ: 0.87(m, 1H, 12-H), 1.89(m, 1H, 13-H), 2.05(m, 1H, 12-H), 2.26(m, 1H, 13a-H), 2.34(m, 1H, 11-H), 2.40(m, 1H, 13-H), 3.00 (d,J=11.1 Hz, 1H, 9-H), 3.36(m, 1H, 11-H), 3.37 (d,J=11.1 Hz, 1H, 9-H), 3.80(s, 3H, OCH3), 4.08(s, 3H, OCH3), 4.10(s, 3H, OCH3), 4.14(s, 3H, OCH3), 4.86(br s, 1H, 14-H), 5.28(s, 1H, 14-OH), 6.08(s, 1H, ArH), 7.39(s, 1H, ArH), 7.59(s, 1H, ArH), 7.85(s,1H, ArH); ESI-MSm/z: 410{[M+H]+}。

1.3　體外細胞毒性測定

采用MTT法[10]測定DCB-3501對人結(jié)腸癌細胞HCT116、人胃癌細胞BGC-823、人肝癌細胞HepG-2、人宮頸癌細胞HeLa和人大細胞肺癌細胞H460的體外細胞毒性，阿霉素為對照藥物。用DMSO溶解DCB-3501，用培養(yǎng)基稀釋制得六個不同濃度[(1.0, 0.33, 0.10, 0.033, 0.010和0.0033) mmol·L-1]溶液，分別取六種濃度的溶液10 μL加至含有90 μL培養(yǎng)基(約5 000個細胞)的板孔中，于37 ℃孵育72 h，每孔加入10 μL 的MTT溶液 (5 mg·mL-1)，于37 ℃孵育4 h后，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，在570 nm處，用酶標(biāo)儀測量每個孔的OD值，根據(jù)公式計算抑制率和相應(yīng)的IC50。

2結(jié)果與討論

2.1　合成

在將二苯乙烯類衍生物合成菲環(huán)(即由1合成2)的過程中，我們首先使用三氟醋酸鉈介導(dǎo)二苯乙烯類衍生物1關(guān)環(huán)[11-12]，通過實驗條件的探索優(yōu)化， 2的收率85%左右，但會形成菲環(huán)的多聚體；文獻[13]報道m(xù)-CPBA/TFA系統(tǒng)能夠有效介導(dǎo)二苯乙烯類衍生物的氧化偶聯(lián)反應(yīng)，我們嘗試了該方法，沒有得到目標(biāo)關(guān)環(huán)產(chǎn)物。Wang等[14]采用過量的無水三氯化鐵介導(dǎo)二苯乙烯類衍生物合成菲環(huán)，反應(yīng)條件溫和，后處理簡便，本文選擇該方法合成2。

在嘗試將5應(yīng)用付克?；磻?yīng)合成吲哚里西丁時，本文分別使用路易斯酸無水AlCl3和無水FeCl3作為催化劑，但是均未得到目標(biāo)吲哚環(huán)關(guān)環(huán)產(chǎn)物(Scheme 2)，與Rapoport H等[6]的實驗結(jié)果一致。

多聚磷酸(PPA)是一種常用的?；噭珻hauncy B等[15]將N-菲-9-亞甲基-L-脯氨酸在PPA中加熱，L-脯氨酸的羧基與菲環(huán)發(fā)生付克?；磻?yīng)得到酮式中間體。參考該方法，我們通過摸索反應(yīng)條件使5在PPA的作用下反應(yīng)合成關(guān)鍵的酮式中間體。

Rapoport H等利用谷氨酸二異丙酯在菲環(huán)9-位引入N-谷氨酸二異丙酯側(cè)鏈，該側(cè)鏈經(jīng)環(huán)化后構(gòu)建DCB-3501的E環(huán)，再經(jīng)水解與付克?；磻?yīng)構(gòu)建D環(huán)，D、E環(huán)上的羰基分別經(jīng)過還原得到DCB-3501。本實驗通過2,3,6,7-四甲氧基-9-菲醛與L-脯氨酸反應(yīng)直接在菲環(huán)9-位引入E環(huán)，再經(jīng)付克?；磻?yīng)和一步羰基還原反應(yīng)得到DCB-3501，簡化了反應(yīng)步驟。

Scheme 2

CompIC50/μmol·L-1HCT116BGC-823HepG-2HeLaH460DCB-350120.050.92.165.830.8 Adriamycinhydrochloride1.41.50.51.01.0

2.2　體外細胞毒性

DCB-3501對五種腫瘤細胞的體外細胞毒性結(jié)果見表1。由表1可見，DCB-3501對HepG-2細胞的細胞毒性最強(IC50=2.1 μmol·L-1)，對HCT116等其他四種細胞具有一定的增殖抑制活性(IC50=20.0～65.8 μmol·L-1)，表明其對不同來源瘤株的敏感性存在差異，但對相應(yīng)細胞的細胞毒性均弱于對照藥物阿霉素(IC50=0.5～1.4 μmol·L-1)。

3結(jié)論

以取代苯甲醛與苯乙酸為原料，經(jīng)7步反應(yīng)全合成了娃兒藤堿類似物DCB-3501。體外細胞毒性實驗結(jié)果表明：DCB-3501對不同來源腫瘤細胞的敏感性存在差異，對HepG-2細胞的細胞毒性最強(IC50=2.1 μmol·L-1)。

該研究工作為娃兒藤堿及其類似物的抗腫瘤活性研究提供參考。

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·快遞論文·

Total Synthesis and Cytotoxicity of Tylophorine Analogue DCB-3501

LI Song-tao1*,LIU Jiang2,HUANG Xue-shi2

(1.Hebei Key Laboratory of Study and Exploitation of Traditional Chinese Medicine, Chengde Medical

University, Chengde 067000, China; 2. Institute of Metabolic Disease Research and Drug Development,

China Medical University, Shenyang 110122, China)

Abstract：The tylophorine analogue DCB-3501 was totally synthesized by a seven-step reaction including Perkin condensation, free radical oxidative coupling, Swern oxidation, reductive amination and Fridel-Crafts acylation, using 3,4-dimethoxy-benzaldehyde and 3,4-dimethoxy-phenylacetic acid as the raw materials. The structure was confirmed by1H NMR and ESI-MS. The in vitro cytotoxicity results showed that the IC50of DCB-3501 against human colon cancer cell HCT116, human gastric cancer cell BGC-823, human hepatic cancer cell HepG-2, human cervical cancer cell HeLa and human large-cell lung cancer cell H460 were 20.0 μmol·L-1, 50.9 μmol·L-1, 2.1 μmol·L-1, 65.8 μmol·L-1and 30.8 μmol·L-1, respectively.

Keywords：3,4-dimethoxy-benzaldehyde; 3,4-dimethoxy-phenylacetic acid; tylophorine analogue; DCB-3501; Perkin condensation; Swern oxidation; Fridel-Crafts acylation; total synthesis; cytotoxicity

中圖分類號：O621.3; O626

文獻標(biāo)志碼：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.01.15279

作者簡介：李松濤(1983-)，漢族，遼寧朝陽人，博士，助理研究員，主要從事有機合成化學(xué)研究。 Tel. 0314-2290640, E-mail: songtao-li@hotmail.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(30600783)； 承德醫(yī)學(xué)院博士基金資助項目(201303)

收稿日期：2015-07-27