廖捷敏， 覃麗娜， 彭 瀚， 吳 云， 劉光立*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 風景園林學(xué)院， 四川 成都 611130； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 研究生院， 四川 成都 611130)

不同溫度對全緣葉綠絨蒿種子萌發(fā)及抗氧化物酶活性的影響

廖捷敏1,2， 覃麗娜1,2， 彭 瀚1， 吳 云1,2， 劉光立1*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 風景園林學(xué)院， 四川 成都 611130； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 研究生院， 四川 成都 611130)

為進一步認識全緣葉綠絨蒿種子的生理特性，為后期綠絨蒿屬植物引種馴化提供指導(dǎo)，以全緣葉綠絨蒿成熟種子為試驗材料，經(jīng)過變溫層積處理，將其置于0℃、5℃、10℃、15℃和20℃恒溫條件下萌發(fā)，測定種子發(fā)芽率以及萌發(fā)過程中種子各類酶活性的變化。結(jié)果表明：除0 ℃外，全緣葉綠絨蒿種子均有不同程度的萌發(fā)，20℃條件下萌發(fā)率最高，發(fā)芽率達18.8%；萌發(fā)早期種子淀粉酶活性較高，后期POD、SOD、CAT活性較強，峰值分別達471 U/(g·min)、262.5 U/(g·min)和44.625 U/(g·min)。溫度對種子淀粉酶、POD、SOD、CAT活性均存在顯著影響(P<0.05)，在0～20℃，溫度越高，全緣葉綠絨蒿種子萌發(fā)能力越強。

全緣葉綠絨蒿； 種子萌發(fā)； 發(fā)芽率； 酶活性； 溫度

全緣葉綠絨蒿〔Meconopsisintegrifolia(Maxim.) Franch.〕系罌粟科綠絨蒿屬一年生或多年生草本[1]，生長于海拔2 500～5 000 m的草坡或林下，以種子進行繁殖[2]。主要分布于我國四川西部、西北部，西藏東南部，甘肅西南部，青海東南部以及緬甸東北部[3]。作為具有較高觀賞價值和藥用價值的野生花卉資源，全緣葉綠絨蒿可作城市花壇及小花坪的綠化材料，亦是盆栽佳品，也可作切花[1]。

種子是植物生活史的一個重要環(huán)節(jié)，與種群密切相關(guān)，對種子萌發(fā)特性的研究也是植物種群生物學(xué)特性研究的重要內(nèi)容[1]。目前，國內(nèi)對全緣葉綠絨蒿化學(xué)成分及藥理活性方面的研究較多，對其萌發(fā)特性方面的研究相對較少。在植物種子萌發(fā)過程中，受內(nèi)外多種因素的影響。其中，溫度是影響種子成熟期間休眠誘導(dǎo)和種子萌發(fā)期間休眠表達的最重要環(huán)境因子之一，且在高寒草甸地區(qū)，溫度也是種子萌發(fā)最主要的調(diào)節(jié)因子。石慧珍等[1]研究了溫度對全緣葉綠絨蒿種子的萌發(fā)率、萌發(fā)速率和萌發(fā)時滯的影響，但對萌發(fā)過程中，缺乏不同溫度對各種酶活性變化的影響研究。碳水化合物代謝過程中能量貯藏與分解是綠絨蒿種子萌發(fā)的基礎(chǔ)；同時超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等保護酶對活性氧的清除，可一定程度削弱綠絨蒿種子萌發(fā)過程中不利環(huán)境因子的影響。因此，筆者對不同溫度條件下全緣葉綠絨蒿種子發(fā)芽率及酶活性變化進行研究，以探討溫度對種子萌發(fā)的影響，以期為進一步認識全緣葉綠絨蒿種子的生理特性，本屬植物的引種、馴化及保護提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 種子的收集與處理

于2013年8月在四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣巴郎山陽坡(102°53.850′～102°56.806′E，30°52.828′～30°54.671′N)采集成熟的全緣葉綠絨蒿果實，帶回實驗室，取出種子并風干；將風干36 h的種子置于牛皮紙信封后裝入塑料袋中，于4℃冰箱層積30 d后，將其放入-20 ℃冰箱層積30 d后再放入4℃冰箱層積30 d，如此循環(huán)層積處理7個月后取出待用。

1.2 種子的培養(yǎng)、發(fā)芽及指標測定

培養(yǎng)：將層積處理后的種子用清水浸泡3 h后，置于0℃、5℃、10℃、15℃和20℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，各處理1 000粒種子，3次重復(fù)，共計15 000粒種子。

發(fā)芽：發(fā)芽床均為150 mm的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿下墊3層濾紙，蓋上皿蓋保濕，將培養(yǎng)皿放置于GXZ型智能光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)中進行發(fā)芽試驗。發(fā)芽當天測定各類處理種子的酶活性，并統(tǒng)計當日發(fā)芽率，各項測定均3次重復(fù)；此后每隔5 d測定1次各項指標，共40 d。

指標測定：淀粉酶活性采用3,5-二硝基水楊酸法[4]測定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法[5]測定，SOD活性采用氮藍四唑(NBT)光化學(xué)還原法[6]測定，CAT活性采用紫外分光光度法[7]測定。統(tǒng)計種子發(fā)芽粒數(shù)以根長為種子1/2長度作為發(fā)芽標準，根長等于或大于種子1/2長度時視為發(fā)芽。

發(fā)芽率(G)= (n/N)×100%

式中，n為發(fā)芽種子數(shù)，N為試驗種子總數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Excel軟件進行試驗數(shù)據(jù)的錄入和數(shù)據(jù)圖表的制作，采用 SPSS 19.0 數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度全緣葉綠絨蒿種子的萌發(fā)率

由圖1可知，隨著溫度的升高，全緣葉綠絨蒿種子的萌發(fā)率也隨之升高。在20℃時種子萌發(fā)率最高，為18.8%；5℃和10℃溫度下，有少量的種子萌發(fā)，且顯著低于15℃和20℃處理。同時，15℃和20℃處理下的種子也比5℃和10℃條件下種子早萌發(fā)10～15 d，也更早到達發(fā)芽率上限。雖然20℃處理下種子發(fā)芽率最高，但在整個發(fā)芽過程中發(fā)現(xiàn)，20℃處理下萌發(fā)的種子易伴有爛根現(xiàn)象。由此說明，溫度是影響全緣葉綠絨蒿種子發(fā)芽的重要因素。此外，0℃處理40 d，全緣葉綠絨蒿種子均沒有萌發(fā)，說明低溫對該種植物種子的萌發(fā)有抑制作用。

注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

Note: Different lowercase letters indicated significant difference atP<0.05. The same below.

圖 1 不同溫度處理下全緣葉綠絨蒿種子的發(fā)芽率

Fig.1 Germination rate ofM.integrifoliaunder different temperature

2.2 全緣葉綠絨蒿種子萌發(fā)過程中淀粉酶及抗氧化物酶的活性

由圖2可知不同溫度處理下全緣葉綠絨蒿種子萌發(fā)過程中淀粉酶、POD、SOD及AT的活性變化。

1)淀粉酶。在種子萌發(fā)過程中起重要作用，其活性的高低直接反映種子代謝水平。淀粉酶在種子萌發(fā)過程中對淀粉的水解起主要作用，特別是在萌發(fā)初期以α-淀粉酶的作用最為明顯[8]。全緣葉綠絨蒿的種子萌發(fā)過程中，在0～20℃，淀粉酶活性基本保持先迅速上升后迅速下降的變化趨勢。方差分析可知，不同溫度對淀粉酶活性影響顯著。在0～20℃，5 d時，除0℃外，淀粉酶活性均升至最大峰值，溫度越高，峰值越大，20℃條件下上升至0.281 mg/(g·min)；5 d后5～20 ℃條件下淀粉酶活性均開始不同程度下降，溫度越高，下降幅度越大；15 d時20℃處理的種子淀粉酶活性已迅速降至0.032 mg/(g·min)，此后基本維持在該值。與之相比， 5℃處理下種子淀粉酶活性先緩慢下降，20 d后開始迅速下降，25 d時降至0.021 mg/(g·min)。0℃作為特殊的處理條件，從種子放入培養(yǎng)皿后，水就以固液混合體的形式存在，這不利于種子對水分的吸收，在這種極端條件下淀粉酶活性變化幅度也較大，10 d時淀粉酶活性上升至0.157 mg/(g·min)，10 d后迅速下降，20 d后淀粉酶活性在0.036 mg/(g·min)左右。

2) POD。POD與植物細胞的生長及分化密切相關(guān)，其活性變化反映了細胞的生長情況[9]。在種子萌發(fā)過程中，POD影響內(nèi)源激素水平，參與結(jié)構(gòu)分子的合成調(diào)節(jié)，從而對細胞分化起到重要作用。POD活性伴隨溫度的升高而逐漸增強，20℃處理30 d時，POD活性不變。在萌發(fā)啟動至5 d時，POD呈上升趨勢，此階段溫度對POD活性影響顯著；5 d后10～20℃處理種子POD活性逐漸下降，溫度越高越早達POD活性峰值；20℃處理下25 d時達POD活性的峰值471 U/(g·min)，25 d后開始下降；15℃處理下種子POD活性從20 d后迅速增強，30 d時活性達峰值984 U/(g·min)；10℃處理下30 d時POD活性開始迅速增強， 35 d時升至228 U/(g·min)后開始下降。各溫度下POD活性變化趨勢相似，即在胚根尚未突破種皮前POD活性上升緩慢，隨著種子萌發(fā)率的增高POD活性亦迅速升高，待種子基本完成萌發(fā)其POD活性呈下降趨勢，萌發(fā)完成后呈下降趨勢。說明，在全緣葉綠絨蒿種子萌發(fā)過程中啟用參與活性氧代謝的POD比萌發(fā)完成后參與其他功能的POD過量[10]。

經(jīng)方差分析，全緣葉綠絨蒿種子萌發(fā)過程中不同溫度對POD活性影響顯著。5℃與0℃處理下的種子POD活性變化趨勢最為接近，差異不顯著。

圖2 不同溫度下全緣葉綠絨蒿種子萌發(fā)過程中淀粉酶及抗氧化物酶的活性變化

15℃和20℃處理與其他溫度下的POD活性均差異顯著。

3) SOD。植物細胞中的SOD可以將細胞內(nèi)積累的有毒物質(zhì)清除，以保護膜系統(tǒng)不受自由基的傷害。經(jīng)方差分析，全緣葉綠絨蒿種子萌發(fā)過程中不同溫度條件對SOD活性影響顯著。各溫度處理下，種子SOD活性的變化趨勢相近，萌發(fā)開始時SOD活性迅速增強，于5 ～10 d時上升至第1個峰值后下降，于25 d時再次上升至第2個峰值而后再次下降，如此反復(fù)使SOD活性維持在一個較高水平。從萌發(fā)初期開始，除20℃外，其余各溫度下SOD活性均與溫度高低成正比。與POD活性變化不同，各時間段SOD活性均與溫度相關(guān)。

4) CAT。CAT作為種子中重要的保護酶之一，是氧自由基的清除劑，在種子萌發(fā)過程中對細胞膜起到保護作用。CAT普遍存在于植物的所有細胞與組織中，其活性與植物代謝強度、抗病及抗旱能力有關(guān)，CAT的增加對種子休眠的解除具有極其重要的意義[11]。種子萌發(fā)初期，CAT活性迅速上升，溫度越高其活性上升速度越快。20℃條件下種子萌發(fā)至10 d時CAT升至峰值58.625 U/(g·min)，15℃條件下在15 d時上升至峰值44.625 U/(g·min)，20℃和15℃處理下，種子的CAT在達到峰值后開始下降。而5℃和10℃條件下，種子的CAT活性于初期迅速上升至較高值，之后穩(wěn)定一段時間，在到達發(fā)芽率最高前5 d時開始迅速上升，并在發(fā)芽率最高時間(35 d)時最強，之后開始迅速下降。0℃條件下種子CAT活性出現(xiàn)反復(fù)波動。不同時間段，20℃處理下的全緣葉綠絨蒿種子CAT活性與其他溫度處理的差異顯著，0℃處理下種子CAT活性最低。

3 結(jié)論與討論

3.1 全緣葉綠絨蒿萌發(fā)過程中淀粉酶活性的變化

種子萌發(fā)期間需要的養(yǎng)料和能源的主要來源是自身儲藏物質(zhì)的利用與轉(zhuǎn)化，淀粉和脂肪的分解為種子萌發(fā)提供主要的能量和碳。全緣葉綠絨蒿種子在萌發(fā)前期淀粉酶的活性高且變化幅度大，表明種子萌發(fā)前期的代謝活性較高。在高原極端環(huán)境下全緣葉綠絨蒿種子通過短時間內(nèi)迅速分解胚乳中養(yǎng)分，提供大量能量以保證種子萌發(fā)。試驗結(jié)果表明，全緣葉綠絨蒿種子萌發(fā)過程中的淀粉酶活性受不同溫度的影響顯著(P<0.05)，溫度越高淀粉酶活性變化越大。全緣葉綠絨蒿淀粉酶活性較低，與低海拔地區(qū)植物種子萌發(fā)時淀粉酶逐漸上升的趨勢不同，全緣葉綠絨蒿淀粉酶活性于萌發(fā)前期迅速上升，并在萌發(fā)過程中不斷被消耗。這種生殖投資策略有助于全緣葉綠絨蒿應(yīng)對嚴苛的高山環(huán)境，使其較好選擇適宜繁殖的時機，但亦伴隨著較高的繁殖風險。

3.2 全緣葉綠絨蒿種子萌發(fā)過程中抗氧化酶活性的變化

隨著生物膜理論的發(fā)展和技術(shù)的進步，衰老與膜間的關(guān)系受到人們的重視，而在各項理論中膜脂過氧光氧化成為最具說服力的理論。大量研究表明，植物在逆境脅迫和衰老過程中，細胞內(nèi)自由基的平衡被破壞從而有利于自由基的產(chǎn)生，過剩的自由基引發(fā)或加劇膜脂過氧化，造成膜系統(tǒng)的損傷，嚴重時會導(dǎo)致植物細胞死亡[12]。自由基一方面供給其他脂肪酸和蛋白質(zhì)分子，另一方面自身進一步氧化為最終產(chǎn)物丙二醛(MDA)、碳氫化合物及揮發(fā)性醛類，而這些最終產(chǎn)物又會毒害細胞膜系統(tǒng)、蛋白質(zhì)和DNA，最終導(dǎo)致細胞膜的降解和細胞功能的喪失[13-16]。試驗結(jié)果表明，溫度差異對POD、SOD和CAT活性變化的影響顯著(P<0.05)，且隨溫度升高抗氧化酶活性升高和變化幅度增大。說明，在0～20℃，隨著溫度的升高，全緣葉綠絨蒿種子抵抗逆境脅迫的能力越強。

POD活性在到達種子最大發(fā)芽率時開始大幅度上升，說明萌發(fā)完成后除參與活性氧的代謝外，其他功能亦需要POD的參與[10]。各溫度下接近發(fā)芽率最高時，SOD活性降至谷底，說明參與萌發(fā)過程的SOD比完成萌發(fā)后參與其他功能的SOD活性高，萌發(fā)過程中將SOD活性維持在較高水平有利于種子抗逆性，以對抗不利環(huán)境。由于SOD活性的維持不具有持續(xù)性，且與溫度和發(fā)芽速度無關(guān)，這種間斷的折線形升降可能是種子對惡劣環(huán)境的一種風險平攤機制，犧牲部分能量從而保證萌發(fā)過程中的種子活性。CAT活性在胚根突破種皮前緩慢增強，待發(fā)芽率最高時，CAT活性亦達到峰值。與大部分低海拔植物相比[17]，全緣葉綠絨蒿種子在萌發(fā)過程中抗氧化酶總活性較高，這反應(yīng)了其在極端環(huán)境下保證發(fā)芽率的一種適應(yīng)策略。

3.3 不同溫度下全緣葉綠絨蒿種子的萌發(fā)情況

全緣葉綠絨蒿種子萌發(fā)屬于緩萌型。惡劣的高原環(huán)境下，大多數(shù)物種通過選擇較低的萌發(fā)率來避免環(huán)境驟變而導(dǎo)致的死亡風險[18]。大多數(shù)植物種子的這種試探性萌發(fā)，在萌發(fā)策略上表現(xiàn)為萌發(fā)方式的風險分擔，這減少了隨機性災(zāi)害導(dǎo)致的物種滅絕，具有相對更高的適合度[19]，是對高寒氣候適應(yīng)的必然結(jié)果[20]。

試驗結(jié)果表明，在0～20℃(0℃除外)，全緣葉綠絨蒿種子均有種子萌發(fā)。這種具有較寬萌發(fā)溫幅、在較低溫度下仍具有相對較高萌發(fā)率的現(xiàn)象是罌粟科植物面對高海拔多變的環(huán)境條件而進化出的萌發(fā)策略[1,21]。在該溫度范圍內(nèi)，溫度越高發(fā)芽率越高，發(fā)芽速度也越快。15～20℃處理下，全緣葉綠絨蒿種子萌發(fā)效果較好，20℃條件下最為理想，20℃亦被認為是全緣綠絨蒿種子的最理想萌發(fā)溫度。與石慧珍[1]關(guān)于全緣葉綠絨蒿及其他綠絨蒿種子需要在較低溫度下萌發(fā)的研究結(jié)果存在差異，這可能是采樣地點、海拔高度不同所致。

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(責任編輯： 孫小嵐)

Effect of Different Temperature on Seed Germination and Anti-oxidant Enzyme Activity ofMeconopsisintegrifolia

LIAO Jiemin1,2, QIN Lina1,2, PENG Han1, WU Yun1,2, LIU Guangli1*

(1.CollegeofLandscapeArchitecture,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu,Sichuan611130; 2.GraduateUniversity,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu,Sichuan611130,China)

To further explore the physiological property ofM.integrifolia, and provide guidance for introduction and domestication ofMeconopsisplants in later period, taking the mature seeds ofM.integrifoliaas the experimental material. After temperature stratification, the seeds were placed in the condition of constant temperature including 0℃, 5℃, 10℃, 15℃ and 20℃. The authors measured the germination rate and the changes of enzyme activity. Results:M.integrifoliaseeds germinated in varying degrees except 0℃, 20℃ was of the highest germination rate(18.8%). Activity of amylase was higher in early stage, but activity of POD, SOD and CAT were higher in the middle and late stage, the peak values of which were respectively 471 U/(g·min), 262.5 U/(g·min) and 44.625 U/(g·min). Temperature had significant effects on the activity of amylase, POD, SOD and CAT. In the range of 0～20℃, the higher the temperature, the stronger the seed germination ability.

Meconopsisintegrifolia; seed germination; germination percentage; enzyme activity; temperature

2015-10-29； 2016-05-11修回

國家自然科學(xué)基金項目“兩性花植物個體大小依賴的性分配：假說和實驗論證”(31370436)

廖捷敏(1988-)，女，在讀碩士，研究方向：園林植物栽培應(yīng)用。E-mail: 179561039@qq.com

*通訊作者:劉光立(1976-)，副教授，博士，從事園林植物栽培應(yīng)用及野生植物資源保護與利用研究。E-mail:liugl_@163.com

1001-3601(2016)06-0237-0017-04

S567.21

A

生理生化·耕作栽培

Physiology and Biochemistry·Tillage and Cultivation