鄭潔　王瑞輝　寇久社　羅浩

摘要：目的 觀察青藤堿關(guān)節(jié)腔注射對兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型軟骨及滑膜血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和神經(jīng)生長因子（NGF）表達(dá)的影響，探討其相關(guān)機制。方法 采用木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔注射法誘導(dǎo)膝骨關(guān)節(jié)炎模型。40只新西蘭大白兔隨機分為空白組、模型組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組，空白組不予任何處理，模型組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組分別給予生理鹽水、玻璃酸鈉注射液和正清風(fēng)痛寧注射液干預(yù)30 d，免疫組化檢測兔關(guān)節(jié)軟骨及滑膜VEGF、NGF的表達(dá)。結(jié)果 與空白組比較，模型組軟骨及滑膜VEGF、NGF表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，青藤堿組軟骨及滑膜VEGF、NGF表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01）；青藤堿組軟骨及滑膜VEGF、NGF表達(dá)低于透明質(zhì)酸鈉組（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 青藤堿膝關(guān)節(jié)腔注射可下調(diào)VEGF和NGF在膝骨關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)軟骨及滑膜的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：青藤堿；骨關(guān)節(jié)炎；血管內(nèi)皮生長因子；神經(jīng)生長因子；兔

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.011

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）03-0038-04

Abstract： Objective To observe the effects of intra-articular injection of sinomenine on the expressions of vascular endothelial growth factor （VEGF） and nerve growth factor （NGF） in articular cartilage and synovium of rabbit knee osteoarthritis models； To discuss its mechanism of action. Methods Totally 40 New Zealand white rabbits were randomly divided into 4 groups： control group， model group， hyaluronate group and sinomenine group. Model group， hyaluronate group and sinomenine group established knee osteoarthritis model by using intra-articular injection of papain enzyme and were treated with saline， sodium hyaluronate and sinomenine respectively for 30 d， except for the control group. After treatment， method of immunohistochemistry was used to detect the expressions of VEGF and NGF in rabbit articular cartilage and synovium. Results Compared with the control group， the expressions of VEGF and NGF in articular cartilage and synovium of model group significantly increased （P<0.01）； compared with the model group， the expressions of VEGF and NGF in articular cartilage and synovium of sinomenine group significantly decreased （P<0.05， P<0.01）； the expressions of VEGF and NGF in articular cartilage and synovium in sinomenine group were lower than hyaluronate group （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Intra-articular injection of sinomenine can down-regulate the expressions of VEGF and NGF in articular cartilage and synovium of rabbit knee osteoarthritis.

Key words： sinomenine； osteoarthritis； vascular endothelial growth factor； nerve growth factor； rabbits

血管生成對于組織的生長、發(fā)育、再生循環(huán)及修復(fù)等生理過程極為重要，在一些疾病的病理改變中也發(fā)揮了不可忽視的作用。近年來發(fā)現(xiàn)，組織血管生成參與了骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）病理進程，與OA關(guān)節(jié)軟骨退變及關(guān)節(jié)疼痛密切相關(guān)。膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）患者骨贅、關(guān)節(jié)軟骨、滑膜及半月板等結(jié)構(gòu)均有血管生成或新生血管增多。血管生成與神經(jīng)生長是一個緊密聯(lián)系的過程，OA關(guān)節(jié)骨軟骨連接處、骨贅及半月板內(nèi)新生血管形成的同時還伴隨著感覺神經(jīng)的生長，這是造成關(guān)節(jié)疼痛的一個不可忽視的重要因素，近年來逐漸受到關(guān)注。青藤堿是從青風(fēng)藤中提取的一種生物堿，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用。臨床觀察發(fā)現(xiàn)青藤堿對改善OA疼痛癥狀具有明顯作用[1]。我們前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿關(guān)節(jié)腔注射可緩解KOA兔滑膜炎性反應(yīng)，降低關(guān)節(jié)液軟骨降解標(biāo)志物含量，對軟骨具有保護作用[2]。本實驗觀察青藤堿關(guān)節(jié)腔注射對KOA兔關(guān)節(jié)軟骨及滑膜組織中促血管生成因子血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和神經(jīng)生長因子（NGF）表達(dá)的影響，進一步探討青藤堿緩解OA關(guān)節(jié)痛及軟骨保護作用的機制。

1 實驗材料

1.1 動物

新西蘭大白兔40只，雌雄各半，4～6月齡，體質(zhì)量1.8～2.2 kg，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，合格證號SCXK（陜）2008-008。單籠、標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，室溫20～25 ℃，相對濕度45%～60%，每日正常光照，空氣流通，自由攝食、飲水。

1.2 藥物

正清風(fēng)痛寧注射液，湖南正清制藥集團股份有限公司，批號1304402-003；玻璃酸鈉注射液，山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司，批號130308011。

1.3 主要試劑與儀器

VEGF和NGF一抗，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒和辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG二抗，武漢博士德生物工程有限公司；木瓜蛋白酶，Merck公司。超薄切片機，德國LEICA公司；TKY-TKA型攤片烤片機，湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司；ZEISS研究級正置數(shù)碼顯微鏡，德國ZEISS公司。

2 實驗方法

2.1 造模、分組與給藥

40只兔分為空白組8只和造模組32只，采用木瓜蛋白酶注射法于實驗第1、4、7日對造模組兔右膝關(guān)節(jié)腔注射4%木瓜蛋白酶溶液0.5 mL（20 mg），首次注射4周后隨機處死2只兔，病理學(xué)觀察出現(xiàn)典型軟骨退變表現(xiàn)，同時兔右膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹、跛行，表明造模成功。將成模兔隨機分為模型組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組，每組10只。根據(jù)成人用藥劑量（玻璃酸鈉和青藤堿均為2 mL/次）按Meeh-Rubner公式計算人兔等效劑量。除空白組外，其余各組兔造模側(cè)膝關(guān)節(jié)行關(guān)節(jié)腔注射，青藤堿組膝關(guān)節(jié)腔注射正清風(fēng)痛寧注射液0.2 mL（5 mg），每3 d注射1次，共10次；透明質(zhì)酸鈉組膝關(guān)節(jié)腔注射玻璃酸鈉注射液0.2 mL，每6 d注射1次，共5次；模型組膝關(guān)節(jié)腔注射生理鹽水0.2 mL，注射次數(shù)同青藤堿組。干預(yù)30 d。實驗過程中，模型組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組兔各死亡1只，各組實驗兔最終為空白組8只，其余3組各9只。

2.2 取材及標(biāo)本處理

2.2.1 關(guān)節(jié)液采集 干預(yù)結(jié)束后，生理鹽水沖洗收集關(guān)節(jié)液。于兔右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入生理鹽水1 mL，充分活動膝關(guān)節(jié)使生理鹽水與關(guān)節(jié)液充分混合，再抽取關(guān)節(jié)腔生理鹽水0.6～1 mL至EP管，4000 r/min離心10 min，取上清液，-80 ℃保存?zhèn)錂z。

2.2.2 滑膜采集 關(guān)節(jié)液標(biāo)本采集完畢后，耳源靜脈空氣栓塞法處死全部實驗動物。采用髕旁內(nèi)外并橫斷骸韌帶的聯(lián)合切口，將軟組織瓣包括髕骨一起向上翻起，并極度屈膝以充分顯露膝關(guān)節(jié)腔，肉眼觀察滑膜、軟骨等大體情況并記錄，取右膝髕骨下滑膜組織，以冰生理鹽水沖洗后置10%中性甲醛中固定48 h，石蠟包埋，常規(guī)切片備用。

2.3 軟骨血管內(nèi)皮生長因子和神經(jīng)生長因子表達(dá)檢測

干預(yù)結(jié)束后第2日，切取兔右膝內(nèi)側(cè)脛骨平臺約5 mm厚帶有軟骨下骨質(zhì)的軟骨組織，修成0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm，經(jīng)蒸餾水沖洗后置于10%中性甲醛溶液固定48 h，乙二胺四乙酸脫鈣，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，免疫組化檢測VEGF及NGF的表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)呈棕褐色為陽性結(jié)果，應(yīng)用顯微圖像分析系統(tǒng)采集圖像。隨機選取3個視野，注意選取臨近退變?nèi)睋p部位，對具有完整4層軟骨結(jié)構(gòu)的區(qū)域進行觀測；計算每個視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計算細(xì)胞分?jǐn)?shù)（陽性細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)×100%），用百分比表示VEGF和NGF的表達(dá)量；每張切片細(xì)胞計數(shù)分別由3個獨立觀察者進行，其評分誤差率≤5%，取其均值。

2.4 滑膜血管內(nèi)皮生長因子和神經(jīng)生長因子表達(dá)檢測

取右膝髕骨下滑膜組織，經(jīng)蒸餾水沖洗后置10%中性甲醛中固定48 h，石蠟包埋，常規(guī)切片，免疫組化檢測VEGF和NGF的表達(dá)，細(xì)胞漿被染成棕褐色為陽性表現(xiàn)。應(yīng)用積分光密度值反映VEGF和NGF陽性表達(dá)的數(shù)量及強度。每張切片隨機選取3個視野，用Image-Pro Plus 6.0免疫組化圖像分析系統(tǒng)測定每視野各陽性區(qū)平均光密度值。每例標(biāo)本被檢區(qū)測3張切片，取其均值。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，多組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 青藤堿對膝骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨血管內(nèi)皮生長因子和神經(jīng)生長因子表達(dá)的影響

空白組軟骨細(xì)胞可見極少量VEGF表達(dá)；模型組陽性軟骨細(xì)胞顯著增多，各層均可見到，多集中于淺層和中層，陽性軟骨細(xì)胞數(shù)與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；青藤堿組和透明質(zhì)酸鈉組陽性細(xì)胞數(shù)較模型組明顯降低（P<0.05，P<0.01），且多集中于軟骨淺層；青藤堿組陽性軟骨細(xì)胞數(shù)低于透明質(zhì)酸鈉組（P<0.05）?？瞻捉M表層軟骨散見數(shù)個NGF陽性軟骨細(xì)胞；模型組軟骨全層陽性軟骨細(xì)胞較空白組明顯著增多（P<0.01）；青藤堿組和透明質(zhì)酸鈉組陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)較模型組明顯低少（P<0.05，P<0.01）；青藤堿組陽性軟骨細(xì)胞分?jǐn)?shù)低于透明質(zhì)酸鈉組（P<0.05）。結(jié)果見表1、圖1、圖2。

4.2 青藤堿對膝骨關(guān)節(jié)炎兔滑膜血管內(nèi)皮生長因子和神經(jīng)生長因子表達(dá)的影響

模型組和透明質(zhì)酸鈉組VEGF平均光密度值較空白組顯著升高（P<0.01）；青藤堿組VEGF平均光密度值顯著低于模型組和透明質(zhì)酸鈉組（P<0.01）；青藤堿組VEGF平均光密度值與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。模型組NGF平均光密度值較空白組顯著升高（P<0.01）；青藤堿組和透明質(zhì)酸鈉組NGF平均光密度值顯著低于模型組（P<0.01）；青藤堿組NGF平均光密度值顯著低于透明質(zhì)酸鈉組（P<0.05）。結(jié)果見表2、圖3、圖4。

5 討論

血管生成與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)已是公認(rèn)的事實，其在OA軟骨退變中也發(fā)揮了重要作用。據(jù)報道，OA患者骨贅、關(guān)節(jié)軟骨、滑膜及半月板等結(jié)構(gòu)均伴有血管生成或新生血管增多[3-6]。OA常常伴有慢性滑膜炎癥，并以巨噬細(xì)胞浸潤為主要特征，后者可分泌VEGF[7]。研究發(fā)現(xiàn)，OA患者及動物模型軟骨中VEGF表達(dá)量顯著上調(diào)[8-9]。血管與伴行神經(jīng)的生長是一個緊密聯(lián)系的過程，OA關(guān)節(jié)軟骨連接處、骨贅及半月板內(nèi)血管新生的同時也伴隨著感覺神經(jīng)的生長[10]。NGF也是一種重要的促血管生成因子，NGF及其受體高親和性受體TrkA和低親和性p75受體在正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞有少量表達(dá)[11-12]，而在OA軟骨的表達(dá)量顯著升高[13-14]。機械壓力、炎性刺激及內(nèi)脂素均可誘導(dǎo)人、小鼠軟骨細(xì)胞表達(dá)NGF，構(gòu)成OA關(guān)節(jié)痛的機制之一[15]。研究發(fā)現(xiàn)，OA患者關(guān)節(jié)液中NGF含量顯著升高[16]，且與軟骨退變程度密切相關(guān)[13-14]；關(guān)節(jié)腔注射NGF可增強OA大鼠痛性行為反應(yīng)[17]。本實驗免疫組化檢測結(jié)果顯示，VEGF和NGF在正常兔軟骨及滑膜均有少量表達(dá)，在KOA兔軟骨及滑膜均呈高表達(dá)，與文獻(xiàn)報道一致；青藤堿關(guān)節(jié)腔注射可顯著降低KOA兔軟骨及滑膜中VEGF和NGF的表達(dá)量，效果優(yōu)于玻璃酸鈉關(guān)節(jié)腔注射。血管生成是炎性反應(yīng)尤其是慢性炎性反應(yīng)的重要特征，本實驗結(jié)果顯示，青藤堿可下調(diào)促血管生成因子在KOA兔軟骨及滑膜中的表達(dá)，與本研究前期觀察到的青藤堿抑制KOA兔滑膜炎性反應(yīng)是一致的，但具體是通過何種機制，涉及哪些信號通路尚未清楚，有待深入研究。OA關(guān)節(jié)內(nèi)新生血管形成通常伴有感覺神經(jīng)的生長，構(gòu)成OA關(guān)節(jié)疼痛的重要因素。青藤堿緩解OA關(guān)節(jié)疼痛已得到臨床廣泛證實，本研究結(jié)果提示抑制關(guān)節(jié)內(nèi)血管神經(jīng)的生長可能是青藤堿減輕OA疼痛作用的一個重要機制。

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（收稿日期：2015-06-30；編輯：華強）