楊立軍　鄭文武　周安傳　蘇曉哲　吳亞東　李珅

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Livin和Bcl-2蛋白生物學特性及與膀胱移行細胞癌關系的研究進展

楊立軍鄭文武周安傳蘇曉哲吳亞東李珅

Livin與Bcl-2均為凋亡蛋白抑制因子，二者表達水平升高會打破細胞增殖凋亡平衡，二者可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。本文對Livin和Bcl-2蛋白生物學特性、細胞凋亡的調(diào)控作用，二者與膀胱移形細胞癌的關系進行探討。對臨床指導治療、判斷預后提供理論依據(jù)。

Livin；Bcl-2；腫瘤，膀胱

細胞增殖和凋亡因子的失衡是導致腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要原因，其中細胞凋亡還與腫瘤患者治療和預后有密切關系，同時也是腫瘤藥物開發(fā)的研究熱點。Livin與Bcl-2均為凋亡蛋白抑制因子，二者表達水平升高會打破細胞增殖凋亡平衡，其在不同腫瘤中均有不同程度的高水平表達，這可能與Livin與Bcl-2參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程有關。膀胱移行細胞癌在男性患者中高發(fā)，且病因不明。本文對Livin與Bcl-2的生物學特性及其蛋白表達與膀胱移行細胞癌的關系進行闡述。

1　Livin與膀胱移行細胞癌

1.1Livin基因及蛋白結構 Livin是由 4個不同的實驗小組采用IAP同源序列(BIR或RING)尋找的方法,分別從人類基因組cDNA文庫中克隆得到[1]。Kasof等[2]將該基因命名為Livin ;Lin等[3]由人胎腎cDNA文庫中分離到該基因 ,故將其稱為KIAP(kidneyIAP);Vucic等[4]因發(fā)現(xiàn)該基因在人黑色素瘤細胞中表達較高,所以稱之為ML-IAP(melanoma IAP);Ashhab等[5]發(fā)現(xiàn)了該基因存在2個剪接變異體,分別命名為Livin α和Livin β，我們將其統(tǒng)稱為Livin。Livin基因位于人染色體20q13.3,全長4.6 kb,包含7個外顯子。基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA長1.4 kb,這與Livin全長cDNA大小一致。此外還發(fā)現(xiàn)存在長約2.2 kb、2.8 kb和4.0 kb的轉(zhuǎn)錄子,這可能與mRNA3′端非翻譯區(qū)多腺苷酸化或存在未剪接加工成熟的前體RNA有關。Livin蛋白N端僅包含1個BIR結構,C端含1個RING環(huán)指結構。Livinα和Livinβ分別由298和280個氨基酸組成,二者相差的18個氨基酸由介于BIR和RING結構之間的第6外顯子5′端54bp的基因序列編碼。Livin氨基酸殘基C124、C127、H44及C151與鋅原子結合，以穩(wěn)定整個重疊結構。Livin α和Livin β蛋白分子量分別為39 000和37 000[2-5]。

1.2Livin的細胞和組織分布Kasof等[2]用含有Livin基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細胞并檢測其表達產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)細胞核與胞漿內(nèi)同時成纖維細絲樣染色，由此可知Livin同時呈絲狀表達與胞質(zhì)和胞核。Hariu等[6]用免疫組織化學染色檢測肺癌細胞顯示Livin蛋白在胞核和胞漿內(nèi)均有顯色。Vuvic等[7]通過研究乳腺癌細胞發(fā)現(xiàn)，Livin C末端RING結構與細胞內(nèi)微絲結構結合，主要定位在細胞質(zhì)中，而不在紡錘體上。而Ka等[8]對不同時期的胎盤、滋養(yǎng)層細胞和絨毛膜癌細胞系以免疫組織化學法染色，陽性染色僅位于胞核。目前，Livin在細胞內(nèi)的定位尚無定論。Livin兩種亞型的組織分布不同，Livin α主要表達于腦、骨骼肌及外周血淋巴細胞，Livin β主要表達于胎兒的心、胸腺以及成人和胎兒的腎[5]，Livin在正常組織中的表達分布仍需進一步研究。

1.3Livin抗細胞凋亡作用和機制

1.3.1Livin抗細胞凋亡作用:①抗死亡受體介導的細胞凋亡作用 :Vucic等[4]將Livin基因轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF7細胞,證實轉(zhuǎn)染細胞對Fas, TNFR1(tumor necrosis factor receptor 1),DR4(death receptor 4)及DR5介導的細胞凋亡具有顯著的抑制作用。Kasof等[2]將Livin基因轉(zhuǎn)染HeLa細胞,結果顯示轉(zhuǎn)染細胞可有效阻斷由FADD (fas-asociated protein with death domain),Bax、RIP、RIP3及DR6誘導的細胞凋亡，在Jurkat人T淋巴細胞株中,Livin可明顯抑制由TNF-α及抗CD95抗體誘導的細胞凋亡,其抗細胞凋亡作用強于Bcl-2[5]。進一步研究表明BIR結構的完整在Livin抗細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[2,4]。②抗線粒體介導的細胞凋亡作用:星狀孢子素(staurosporine,STS)是一種蛋白激酶C(PKC)抑制劑,可誘導線粒體釋放細胞色素C,后者可進一步激活細胞凋亡的下游通路。Livin α對STS誘導的Jurkat細胞凋亡表現(xiàn)出一定的抑制作用,但作用弱于Bcl-2;而Livin β則無此作用,顯示了Livin α和Livin β的抗細胞凋亡作用存在不同[5]。③抗化療藥物介導的細胞凋亡作用:許多化療藥物可引起細胞DNA的損傷而誘導細胞凋亡。轉(zhuǎn)染Livin基因的MCF7細胞可有效對抗阿霉素,4TBP4(4 terttiarybutyiphenol)誘導的細胞凋亡[4]。Livinβ可明顯抑制依托泊苷(etoposide)誘導的Jurkat細胞凋亡[5]。

1.3.2Livin抗細胞凋亡凋節(jié)機制:①抑制Caspase途徑:Livin可與激活形式的Caspase 3和Caspase 7結合,并抑制其生物活性。Livin還可與未加工的或斷裂形式存在的Caspase 9結合,抑制由Apaf1(apoptosis protein activating factor 1),細胞色素C及dATP誘導的Caspase 9激活作用。Livin與Cspase的結合抑制作用具有高度的特異性和親和性,這有賴于其BIR結構域的完整,BIR結構域內(nèi)單個氨基酸的突變即可影響Livin與Caspase的結合并使Livin抗細胞凋亡作用明顯降低甚至完全喪失[2,4]。②激活TAK1/JNK1信號傳導途徑:Livinβ可激活MAP(mitogen activated protein)激酶JNK1和JNK2,而Livin對JNK1的激活作用遠遠強于JNK2,并且是Livin對抗TNFα和ICE介導的細胞凋亡作用的一條重要途徑。JNK蛋白家族可直接由MKK4/MKK7激活,但Livin對JNK1的激活并不依賴于MKK4/MKK7信號途徑,而是通過TAB1/TAK1途徑實現(xiàn)。TAK1是一上游MAP3激酶,在TGFβ1的刺激下可激活JNK1。TAB1是TAK1的共反應子(coactivator),TAB1本身對于JNK1無激活作用,但可促進TAK1介導的JNK1激活作用。Livinβ可與TAB1結合,并進一步激活TAK1[9]。此外,SMAC(second mitochondrial activator of caspases)及活性肽片段可與Livin的BIR結構域特異性結合,抑制Livin與caspase的結合及其抗細胞凋亡作用。因此存在著由SMAC介導的對Livin抗細胞凋亡作用的負性凋節(jié)機制[10]。

1.4Livin與人腫瘤的關系Livin對細胞凋亡有明顯的抑制作用，因此探討其余腫瘤產(chǎn)生的關系成為研究熱點。采用Northernblot或RT-PCR方法,證實LivinmRN在人多種類型的腫瘤細胞系中高表達,包括黑色素瘤(MeWo,A375,G361,SK Mel29),淋巴瘤(Ramos,Raji)、大腸癌(HT29,HT29MTX),前列腺癌(PC3,DU145),白血病(K562,HL60,Jurkat,MOLT4)及頭頸部肉瘤(HeLa)等[2,4,5]。特別是Vucic等[4]采用RT PCR方法檢測了35株黑色素瘤細胞系,發(fā)現(xiàn)均存在LivinmRNA高表達,而正常的黑色素細胞則無LivinmRNA表達。以上研究結果提示Livin的高表達可能與人某些類型腫瘤的形成存在密切關系。但LivinmRNA在人乳腺癌細胞系MCF7及MDAMB435中僅有少量表達,而在肺癌細胞系A549中無表達。Yagihashi等[11]研究表明，Livin在胃腸癌患者中呈現(xiàn)高水平表達，提示其與胃腸癌的產(chǎn)生有一定聯(lián)系。Schmollinger等[12]提示Livin的表達缺失可以是腫瘤逃避機體免疫功能的識別的共計，因此其可作為治療靶點。Ashhab等[5]用RT- PCR檢測發(fā)現(xiàn)Livin在前列腺癌細胞系(PC3,DU145)及白血病瘤株K562,HL60中Livin兩種異構體均高表達。國內(nèi)鞠文等[13]第一次報道了Livin基因在良性前列腺增生中的表達及Livin基因與前列腺癌分級的關系。細胞凋亡抑制因子Livin在BPH及前列腺腺癌組織中表達上調(diào)，提示Livin基因可能通過抑制細胞的凋亡對BPH及前列腺腺癌的發(fā)生、發(fā)展起重要作用。

目前，以Livin基因作為靶點的免疫治療在不斷研究中。一組臨床Ⅰ期實驗研究顯示，對黑色素瘤腸轉(zhuǎn)移的患者給予腫瘤免疫治療，取得了一定的臨床療效。Livin基因可以通過免疫調(diào)節(jié)導致腫瘤細胞的破壞[12]。有文獻報道以Livin基因為靶點的RNAi技術也可以有效的特異性阻斷內(nèi)源性Livin基因的表達，使得caspase-3活化，明顯增強各種促凋亡因素(如阿霉素、紫外線照射、TNF-α)導致的細胞凋亡率[14]。用Livin基因的反義核酸和Smac肽反向調(diào)節(jié)Livin基因的抗凋亡活性也收到明顯的效果，包括促進化療藥物的促凋亡作用[2,10]。

1.5Livin在膀胱移行細胞癌中的表達與關系Gazzaniga等[15]結果顯示Livin α和Livin β在正常膀胱組織中均無表達,Livin β在膀胱癌組織中也無表達,而Livin α表達陽性率為23%。進一步研究顯示Livin α表達陽性的患者術后腫瘤平均復發(fā)時間為3.5月,而Livin α表達陰性的患者則延長至27.2月,差異顯著，提示Livin α表達與膀胱癌患者預后密切相關。國內(nèi)何遠橋等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Livin在正常膀胱組織中未表達，而膀胱移行細胞癌中呈現(xiàn)高水平表達，二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),同時研究還發(fā)現(xiàn)Livin的表達在不同病理分級、臨床分期和是否復發(fā)間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Livin在BTCC中高表達，提示Livin可通過抑制細胞凋亡，對BTCC的發(fā)生發(fā)展起重要作用;Livin在膀胱癌中有望成為一種有效、敏感的腫瘤標志物，并為BTCC的基因治療提供新的方向。有研究發(fā)現(xiàn)，Livin與腫瘤的復發(fā)關系密切，可作為膀胱癌復發(fā)的早期監(jiān)測指標[2]。

2　BCL-2與膀胱移行細胞癌

線粒體是參與細胞凋亡的最重要的超微結構，凋亡過程中電子傳遞鏈的變化,線粒體膜電位的異常去極化,超常的細胞氧化-還原反應都需依賴線粒體。線粒體膜上具有凋控凋亡的Bcl-2家族蛋白,該家族蛋白的結合狀態(tài)將凋節(jié)線粒體膜電位的變化,改變細胞色素C、Smac/DIABLO蛋白以及凋亡誘導因子(AIF)等的釋放。從而通過激活caspases通路導致細胞凋亡,或直接作用于細胞核引起細胞凋亡。由此可見,線粒體除了具有經(jīng)典的生物學效應外,還具有凋控細胞存亡的重要作用[17]。

2.1BCL-2基因家族與蛋白家族Bcl-2基因是一種原癌基因，研究發(fā)現(xiàn)許多基因結構與Bcl-2相似，參與細胞凋亡的調(diào)解，因此將這些基因統(tǒng)稱為Bcl-2基因家族。Bcl-2基因是t(14∶18)染色體異位斷點處發(fā)現(xiàn)的一種癌基因。Bcl-2家族迄今為止發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族同源蛋白不少于15種,均含有一種以上Bcl-2家族共有同源序列(BH1-BH4)。按結構功能不同分前凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。前凋亡蛋白均含BH3結構域,多數(shù)抗凋亡蛋白含BH1和BH2區(qū),與Bcl-2高度同源的含1～4四個區(qū)[18]。前凋亡蛋白主要有Bax,Bcl-XS,Bak, Bad,Bik, Bim,Bid,Hrk和Bok;抗凋亡蛋白主要有Bcl-2,Bcl-XL,Mcl-1,A1/Bfl-1和Bcl-W。前凋亡蛋白之間、抗凋亡蛋白之間及這兩類蛋白之間可相互作用形成同源或異二聚體,形成一個復雜的凋控網(wǎng)絡,前凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的相對比值在決定細胞生存抑或死亡中可能起關鍵作用。Bcl-2蛋白是抗凋亡蛋白之一，位于線粒體內(nèi)膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，分子量為26 000，它是人類濾泡狀淋巴瘤的細胞遺傳學標志。目前，關于Bcl-2抑制細胞凋亡的研究很多，Bcl-2的高表達可保護各種凋亡刺激，因此Bcl-2低表達或缺失的細胞死亡率明顯增加。

2.2BCL-2蛋白家族對細胞凋亡的凋控作用

2.2.1Bcl-2家族對線粒體通路的凋控：該通路的線粒體滲透性改變形成的PT孔 (permeability transitionpore)開放和線粒體內(nèi)致凋亡的多種蛋白釋放均受Bcl-2家族凋控。Bcl-2或其它抗凋亡蛋白過表達使許多本可致PT孔開放、細胞色素C及凋亡誘導因子 (apoptosis inducing factor,AIF)釋放的刺激失效，從而抑制細胞凋亡;而前凋亡蛋白Bax過表達導致線粒體跨膜電位丟失及細胞色素C釋放[19]導致細胞凋亡。Shimizu等[20]發(fā)現(xiàn)重組前凋亡蛋白Bax和Bak能加速電壓依賴的陰離子通道(voltage dependent anion channel,VDAC)開放,而Bcl-XL則通過直接與之結合關閉VDAC,提示Bcl家族蛋白可通過VDAC凋節(jié)線粒體膜的通透性,影響膜電位及細胞色素C釋放,從而促進或抑制凋亡。

2.2.2Bcl-2家族對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路的凋控：鈣濃度變化在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路中是很關鍵的凋亡信號,越來越多的證據(jù)表明Bcl-2家族除存在于線粒體膜表面外,也存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,能阻斷多種致使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放儲存鈣的凋亡刺激。Foyouzi等[21]發(fā)現(xiàn)Bcl-2的通過增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜對鈣離子通透性而減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)可釋放的游離鈣離子濃度。

2.2.3Bcl-2家族對死亡受體通路的凋控:死亡受體通路通過Fas,TNFR激活Caspase8直接激活Caspase3引起凋亡,主要存在于線粒體表面的Bcl-2應該對此通路無影響。但在另一些情況下Bcl-2可抑制死亡受體通路誘發(fā)的凋亡。

2.3Bcl-2與膀胱移行細胞癌及癌旁組織生物學行為的關系王養(yǎng)民等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2在膀胱正常黏膜組織中無表達，而在膀腫腫瘤中有表達，且表達水平與腫瘤分級有關，呈現(xiàn)分級越高表達水平越高，但Bcl-2蛋白的表達能否作為膀胱腫瘤標志物及與膀胱腫瘤患者存活有否關系仍需進一步深入的研究。Shiina等[23]用免疫組化的方法,結果發(fā)現(xiàn)Bcl-2 在膀胱移行細胞癌中表達為24.7%,在癌旁移行上皮中為96.1%?？翟系萚24]在膀胱膀胱癌及癌旁組織p53、Bcl-2表達的初步研究的結果顯示：腫瘤上皮中表達為31.1%,而在癌旁組織中為53.3%～75.5%。說明Bcl-2在表淺性BTCC及癌旁組織的基底及基底下層高表達。癌組織與癌旁組織Bcl-2的表達差異有顯著性(P<0.01)。羅旭等[25]報道，非浸潤性膀胱癌的Bcl-2陽性率低于浸潤性膀胱癌，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明Bcl-2蛋白表達與膀胱癌的臨床分期無關。復發(fā)性膀胱癌Bcl-2陽性率高于初發(fā)性膀胱癌，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明Bcl-2蛋白表達與膀胱癌的復發(fā)有關，可作為膀胱癌術后預測腫瘤復發(fā)的監(jiān)測指標之一。國內(nèi)習小慶等[26]報告的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級膀胱癌的陽性率分別為18.8%、52.0%和60.0%,表明其表達與癌組織的惡性程度有相關關系。有文獻報道,在子宮內(nèi)膜增生、胃腸上皮發(fā)育異常、皮膚組織病中Bcl-2表達明顯增高,在前列腺、胃腸道癌旁組織中Bcl-2的表達亦明顯增高[27-30]。癌旁組織Bcl-2表達的增高,說明Bcl-2基因可能是腫瘤發(fā)生與進展的早期。

綜上所述,正常膀胱黏膜中Bcl-2呈現(xiàn)低表達或無表達，在移行細胞癌及其他膀胱腫瘤中有表達，且表達水平隨腫瘤分級升高而升高，同時與復發(fā)也有一定關系，可作為早期預測指標，但與臨床分期無關。Bcl-2蛋白的表達能否作為膀胱腫瘤標志物及與膀胱腫瘤患者的存活率是否有關系仍需進一步深入研究。

3　Livin與Bcl-2表達的關系

Livin抗細胞凋亡凋節(jié)機制之一是抑制Caspase途徑: Livin可與激活形式的Caspase 3和Caspase 7結合,并抑制其活性。Livin還可與未加工的或斷裂形式的Caspase 9結合,可抑制由Apaf1(apoptosis protein activating factor 1),細胞色素C及dATP誘導的Caspase 9激活作用。Livin與Caspase的結合抑制作用具有高度的特異性和親和性,這于其BIR結構域的完整密切相關,BIR結構域內(nèi)單個氨基酸的突變即可導致Livin抗細胞凋亡作用的明顯降低甚至完全喪失[2,4]。越來越多的研究表明，Caspase-3與Bcl-2在凋亡過程中的密切相關。一方面,Bcl-2的高表達可防止細胞色素C從線粒體中釋放，從而抑制Caspase-3的激活；同時Bcl-2還可以直接將胞漿中與Caspase 9結合的Apaf1結合于線粒體外膜，形成四聚體復合物，使Apaf1失去對Caspase-3酶的活化能力。另一方面，激活的Caspase-3能切割Bcl-2蛋白環(huán)狀區(qū)域的Asp34處，導致Caspase-3級聯(lián)反應的放大。并且，由激活的Caspase-3所凋控的酪氨酸激酶對Bcl-2轉(zhuǎn)錄有抑制作用[31]。Woo等[32]用Western blot證明了在爆發(fā)性肝炎的Caspase-3缺乏的小鼠肝細胞中有完整的Bcl-2蛋白的表達。由此可見，抑制Caspase途徑可能是Livin和Bcl-2的共同抗細胞凋亡凋節(jié)機制，二者在細胞凋亡的調(diào)控方面起協(xié)同作用。

關于Livin與Bcl-2在膀胱移行細胞癌的表達的相關性，膀胱移行細胞癌分化程度越差,Livin與Bcl-2表達水平越高，Livin與Bcl-2在細胞凋亡調(diào)控方面有協(xié)同作用，可能是二者共同抑制Caspase途徑從而抑制細胞的凋亡，促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。在膀胱移行細胞癌中，Livin與Bcl-2發(fā)揮重要作用，與膀胱移行細胞癌的生物學行為密切相關，深入研究Livin與Bcl-2在膀胱移行細胞癌中的蛋白表達及與其生物學行為的關系，對臨床指導治療、判斷預后提供理論依據(jù)。

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2015-12-29)

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.15.033

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