隋小芳，李雪杰，王鳳玲*，索樹珍，楊　軍，董天崴，張磊藝

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 老年病科；2.佳木斯大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究生;

3.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，黑龍江 佳木斯154002)

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過表達(dá)miRNA-291b-3p誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞胰島素抵抗

隋小芳1，李雪杰2，王鳳玲1*，索樹珍2，楊軍3，董天崴3，張磊藝3

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 老年病科；2.佳木斯大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究生;

3.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，黑龍江 佳木斯154002)

摘要：目的研究過表達(dá)miRNA-291b-3p對(duì)誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞胰島素抵抗的影響。方法①用10 ng/ml TNF-α處理心肌細(xì)胞系H9C2細(xì)胞24 h，通過Real time PCR檢測(cè) miR-291b-3p表達(dá)水平，Western blot 分析AKT/GSK信號(hào)通路活性，用蒽酮法檢測(cè)細(xì)胞糖原水平；②構(gòu)建miR-291b-3p mimics 腺病毒載體，感染H9C2細(xì)胞48 h，分析miR-291b-3p水平、AKT/GSK 信號(hào)通路活性和糖原水平的變化。結(jié)果①TNF-α處理H9C2細(xì)胞24 h，miR-291b-3p 的表達(dá)水平明顯升高，同時(shí)AKT/GSK信號(hào)通路活性受到抑制，心肌細(xì)胞糖原水平升高；②miR-291b-3p mimics腺病毒感染H9C2細(xì)胞48 h，miR-291表達(dá)水平升高，AKT/GSK信號(hào)通路活性降低，心肌細(xì)胞糖原水平升高。結(jié)論H9C2細(xì)胞中TNF-α或過表達(dá)miR-291b-3p可抑制AKT/GSK 信號(hào)通路活性，出現(xiàn)胰島素抵抗。

關(guān)鍵詞：心肌細(xì)胞；胰島素抵抗；miR-291b-3p；TNF-α

(ChinJLabDiagn,2016,20:0182)

近幾年研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗(I R)在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生和進(jìn)展過程中起到至關(guān)重要的作用,是連結(jié)多種代謝性異常和心血管疾病的中心環(huán)節(jié)[1]。隨著對(duì)miRNAs的深入研究，越來越多的結(jié)果表明，miRNAs廣泛參與人類疾病的發(fā)生過程[2]。最近研究表明，miRNA 參與調(diào)控心血管系統(tǒng)的發(fā)育和疾病發(fā)生過程。在心肌胰島素抵抗中miRNAs發(fā)揮的作用及其機(jī)制尚不明確。深入探討這些miRNA在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，將有助于我們對(duì)疾病的認(rèn)知，并為疾病的治療提供新的治療思路及靶點(diǎn)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞及主要材料來源

實(shí)驗(yàn)用H9C2大鼠心肌細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫。H-DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司； 胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；TNF-α 購(gòu)于美國(guó)Epitomics公司；AKT抗體、Ser473磷酸化AKT抗體、GSK抗體、Ser9磷酸化 GSK抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。miR-291b-3p 過表達(dá)腺病毒載體(AD-291b-3p mimic)構(gòu)建與純化交由上海吉?jiǎng)P科技有限公司完成。肌/肝糖原檢試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)

H9c2細(xì)胞用含10%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)液一次，細(xì)胞達(dá)約80%-90%豐度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3比例接種于新培養(yǎng)瓶中傳代或六孔板中用于實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞模型的建立

將狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于6孔板中，隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組，未進(jìn)行處理；TNF-α處理組，10 ng/ml TNF-α處理24 h；miR-291b-3p 表達(dá)的對(duì)照組(NC 組)，miR-291b-3p 表達(dá)組(Ad-291m組)。

1.4miR-291b-3p表達(dá)檢測(cè)

收集上述細(xì)胞模型，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PT-PCR檢測(cè)。采用Trizol試劑提取細(xì)胞RNA，取1μgRNA逆轉(zhuǎn)錄 miRNA合成cDNAR，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用SYBR Green熒光定量試劑盒和熒光定量PCR儀行PCR。PCR 反應(yīng)完畢后分析產(chǎn)物融解曲線判斷反應(yīng)的特異性，采用△循環(huán)閾值(Ct)法處理結(jié)果，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量即2-△△ct。引物設(shè)計(jì)如下：

引物名稱反轉(zhuǎn)錄引物序列5’-3’miR-291b-3pGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACACAAACU6GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACAAATATG

引物名稱PCR引物序列5’-3’miR-291b-3pGCAAAGTGCATCCATTTTGTTTGTU6GCGCTCGTGAAGCGTTCUniverseprimerGTGCAGGGTCCGAGGT

1.5觀察miR-291b-3p水平變化對(duì)胰島素抵抗的影響

應(yīng)用AD-291b-3p mimic及其陰性對(duì)照，分別感染H9C2細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，用TRIzol提取總RNA，用特異性microRNA 反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄1 μg RNA；應(yīng)用real time PCR檢測(cè)miR-291b-3p水平；用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)p-AKT、AKT、p-GSK、GSK水平；按肌、肝糖原檢試劑盒說明操作，檢測(cè)心肌細(xì)胞中糖原水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1TNF-α上調(diào)H9C2細(xì)胞中miR-291b-3p的表達(dá)水平，引起心肌胰島素抵抗

10 ng/ml TNF-α處理H9C2細(xì)胞24 h，構(gòu)建心肌胰島素抵抗模型。根據(jù)Real time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TNF-α處理組中miR-291b-3p表達(dá)水平(圖1A)升高2.8倍左右。同時(shí)，western blot的結(jié)果顯示，TNF-α處理組中，AKT和GSK的磷酸化水平降低(圖1C)，糖原水平明顯升高(圖1B)。上述結(jié)果提示，TNF-α 能夠抑制胰島素信號(hào)活性，引起H9C2細(xì)胞胰島素抵抗；miR-291b-3p可能參與其中。

A.miR-291b-3p的表達(dá)水平；B.糖原水平；C.western blot檢測(cè)AKT/GSK通路的蛋白水平(n=3,*P<0.5,**<0.01)

圖1TNF-α處理H9C2細(xì)胞引起胰島素抵抗

2.2過表達(dá)miR-291b-3p 抑制細(xì)胞AKT/GSK 信號(hào)通路活性

在H9C2細(xì)胞中，我們用AD-291b-3p mimics腺病毒感染H9C2細(xì)胞 48 h。結(jié)果顯示miR-291b-3p表達(dá)水平明顯升高(圖2A)，AKT和GSK磷酸化水平降低，細(xì)胞中糖原水平顯著升高(圖2B，C)。由此可見，過表達(dá)miR-291b-3p能夠抑制AKT/GSK信號(hào)通路活性，引起胰島素抵抗。

A.miR-291b-3p的表達(dá)水平；B.糖原合成水平；C.western blot檢測(cè)AKT/GSK通路的蛋白水平(n=3,*P<0.5,**<0.01，***<0.001)

3討論

胰島素抵抗是指機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性和反應(yīng)性下降，導(dǎo)致正常量的胰島素產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)低于正常水平，可表現(xiàn)為葡萄糖攝取減少、糖原合成能力下降[3]。胰島素抵抗不僅是2型糖尿病的主要發(fā)病機(jī)制，也是心血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在糖尿病患者患有心血管疾病的大約占50%，且大部分死于心血管相關(guān)疾病[4]。目前，研究者主要關(guān)注肝臟、骨骼肌和脂肪在全身胰島素抵抗中的作用，對(duì)心肌細(xì)胞胰島素抵抗研究尚少。

炎癥因子是誘發(fā)胰島素抵抗的重要因素[5]。在骨骼肌細(xì)胞中，TNF-α可通過抑制胰島素刺激葡萄糖吸收時(shí)多種相關(guān)蛋白，誘發(fā)胰島素抵抗，如胰島素受體底物-1(IRS-1)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋Et4(GLUT4)。胰島素主要通過激活 PI3K信號(hào)通路[6]促進(jìn)心肌細(xì)胞內(nèi) GLUT-2及 GLUT-4 表達(dá)增加而使心肌細(xì)胞葡糖攝取增加[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α處理能夠降低H9C2細(xì)胞中AKT/GSK信號(hào)通路活性，升高細(xì)胞中糖原水平。說明TNF-α能夠?qū)е滦募〖?xì)胞發(fā)生胰島素抵抗。同時(shí)，TNF-α能夠降低miR-291b-3p表達(dá)水平。提示，miR-291b-3p可能參與TNF-α引起的心肌細(xì)胞胰島素抵抗。目前，越來越多的研究表明miRNA 能夠廣泛參與到胰島素信號(hào)通路的調(diào)控以及葡萄糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)控中[2]。例如，miR-122[8]、miR-103和 miR-107[9]均參與調(diào)節(jié)機(jī)體胰島素敏感性及糖脂代謝穩(wěn)態(tài)。miR-291b-3p[10]屬于miR-290家族，已有研究證實(shí)其參與肝臟胰島素抵抗的AKT/GSK信號(hào)通路，該家族包括miR-290-3p、miR-291a-3p、miR-291b-3p、miR-292-3p、miR-291b-5p、miR-294以及miR-295，位于染色體7上的2200 bp的堿基片段，可以調(diào)控各種細(xì)胞信號(hào)通路[11]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在H9C2細(xì)胞中過表達(dá)miR-291b-3p能夠抑制AKT/GSK信號(hào)通路活性，升高細(xì)胞糖原水平。說明miR-291b-3p能夠調(diào)節(jié)H9C2細(xì)胞發(fā)生胰島素信號(hào)敏感性,其作用與TNF-α一致。

綜上所述，過表達(dá) miR-291b-3p，可抑制AKT/GSK信號(hào)通路活性，降低細(xì)胞中糖原合成水平。由于miRNA具有特定基因調(diào)節(jié)的重要功能，有希望為臨床疾病的診斷及治療提供靶點(diǎn)。但是，今后我們還需進(jìn)一步探討miR-291b-3p調(diào)控胰島素信號(hào)通路的分子機(jī)制及其下游靶基因。

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MiR-291b-3p regulates activation of insulin signal pathway in H9C2 cellSUIXiao-fang1,LIXue-jie2,WANGFeng-ling1,etal.(1.DepartmentofGeriatrics,theFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity；2.Geriatrics,theFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Postgraduatestudent,Jiamusi154002，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effecte of miRNA-291b-3p on the insulin resistance in H9C2 cells.Methods①H9C2 cells were treated with 10 ng/ml TNF-α for 24 h to induce insulin resistance.And the level of miR-291b-3p,activation of AKT/GSK pathway and the level of glycogen were analyzed.②In order to over-express miR-291b-3p,H9C2 was infected with AD-291b-3p mimices for 48 h.And the level of miR-291b-3p,activation of AKT/GSK pathway and the level of glycogen were analyzed.Results①TNF-α treatment significantly up-regulated miR-291b-3p expression and glycogen level,accompanied by decreased activation of AKT/GSK pathway.②In H9C2 cells Infected with AD-miR-291b-3p mimics,the levels of miR-291b-3p and glycogen level were increased and activation of AKT/GSK pathway was inhibited.ConclusionIn H9C2 clls,TNF-α treatment or over-expression of miR-291b-3p inhibited activation of AKT/GSK pathway.

Key words:Myocardial cell,insulin resistance,miR-291b-3p,TNF-α

(收稿日期：2015-11-20)

作者簡(jiǎn)介：隋小芳(1976-)，女，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事老年心血管疾病的臨床與基礎(chǔ)研究；王鳳玲，女(1963-)，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)脈硬化的臨床與基礎(chǔ)研究。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：Q786

文章編號(hào)：1007-4287(2016)02-0182-04

*通訊作者

基金項(xiàng)目:黑龍江省自然基金面上項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：H2015076)；黑龍江省中醫(yī)藥中青年科技攻關(guān)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：ZQG-055)；佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：LM2015_013)