李　娜，蔣志宏，代　玥，馬　強(qiáng)

(大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連116001)

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雌激素受體β通過非激素配體途徑減輕β淀粉樣蛋白對PC12細(xì)胞的毒性作用

李娜，蔣志宏，代玥，馬強(qiáng)*

(大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連116001)

摘要：目的研究在無雌激素作用下雌激素受體β過表達(dá)對PC12細(xì)胞在β淀粉樣蛋白刺激下抗炎、抗凋亡能力的影響。方法取普通PC12細(xì)胞為對照組，Ad-EGFP空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞為空白組，Ad-ERβ-EGFP轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞為轉(zhuǎn)染組，western blot法檢測3組中ERβ蛋白的表達(dá)。隨機(jī)選取未感染的PC12細(xì)胞為對照組，轉(zhuǎn)染ERβ后的PC12細(xì)胞分為過表達(dá)組和ABI-2組，3組均加入培養(yǎng)液及Aβ，ABI-2組還加入Akt特異性抑制物ABI-2。實(shí)時(shí)定量PCR法測定3組在β淀粉樣蛋白刺激作用下炎癥因子TNF-α和IL-1β mRNA的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)測定3組在β淀粉樣蛋白刺激作用下的凋亡情況。結(jié)果ERβ在轉(zhuǎn)染后PC12細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)。過表達(dá)組TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表達(dá)明顯低于對照組及ABI-2組。過表達(dá)組PC12細(xì)胞凋亡率明顯低于對照組及ABI-2組。結(jié)論ERβ在不依賴雌激素受體的情況下，通過Akt途徑發(fā)揮其抗炎、抗凋亡及減輕Aβ細(xì)胞毒性的作用。

關(guān)鍵詞：雌激素；雌激素受體；阿爾茨海默??；β淀粉樣蛋白；PPAR-γ

(ChinJLabDiagn,2016,20:0198)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，臨床缺乏有效的藥物治療。與男性相比，女性在80-85歲后AD的發(fā)病率明顯增加，因此認(rèn)為雌激素在AD的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要的作用[1]。研究表明，雌激素可通過與神經(jīng)細(xì)胞膜表面或核雌激素受體(estrogen receptor,ER)結(jié)合，發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡能力，并拮抗β淀粉樣蛋白的毒性作用，從而延緩AD的病程[2]。但雌激素替代性治療可大大絕經(jīng)后女性增加患乳腺癌及子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)，因而限制了其用于治療AD的臨床價(jià)值。

ER主要包括α和β兩種亞型，除了經(jīng)典的雌激素-雌激素受體途徑，ERβ在無雌激素結(jié)合情況下以不依賴配體的形式激活胞內(nèi)通路，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用[3]。因此，在不應(yīng)用有潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)的雌激素的情況下，是否可以通過單純調(diào)控ERβ表達(dá)發(fā)揮其對AD的神經(jīng)保護(hù)作用呢？本研究利用腺病毒(adenovirus,Ad)為載體，將ERβ基因?qū)隤C12細(xì)胞并使其在PC12細(xì)胞中過表達(dá)。并以普通PC12細(xì)胞為對照，研究在無雌激素作用下ERβ過表達(dá)對PC12細(xì)胞在β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)刺激下抗炎、抗凋亡能力的影響。

1材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)器材與試劑

腺病毒基因載體Ad-ERβ-EGFP由吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司(上海)代為構(gòu)建。BSA、TBST購自博士徳公司(武漢，中國)。ERβ一抗IgG和二抗IGM均購自santa cruz公司。Superscript III Reverse Transcriptase試劑盒購自Invitrogen公司。PCR試劑盒購自北京Transgene生物技術(shù)有限公司。TNF-α和IL-1β mRNA特異性引物由上海生物工程研究所合成。AnnexinV-FITC、PropidiumIodide購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。Calibur流式細(xì)胞儀購自BD公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Ad-ERβ-EGFP轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞將PC12細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，加入24孔板(2×105/孔)中。以5×107，1×108，5×108，1×1094個(gè)不同滴度將Ad-ERβ-EGFP病毒加入孔中，然后將細(xì)胞放入37℃，含5 % CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h，在不同時(shí)間點(diǎn)于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中綠色熒光表達(dá)情況。利用同樣方法構(gòu)建Ad-EGFP空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞。通過顯微鏡下觀察挑選綠色熒光表達(dá)最強(qiáng)的細(xì)胞，消化后進(jìn)一步擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.2.2Western blot檢測PC12細(xì)胞中ERβ的表達(dá)取普通PC12細(xì)胞為對照(Control)組，Ad-EGFP空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞為Vector組，Ad-ERβ-EGFP轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞為ERβ組，檢測3組中ERβ蛋白的表達(dá)，其具體過程如下：RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采取BCA法測定總蛋白濃度?？偟鞍仔?0% SDS-PAGE不連續(xù)凝膠電泳，濕法電轉(zhuǎn)膜，BSA封閉2 h，TBST洗脫后加一抗 1∶1 000于4度孵育過夜，TBST洗脫，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h后行ECL化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果。

1.2.3構(gòu)建AD細(xì)胞模型并分組隨機(jī)選取未感染的PC12細(xì)胞為 Model組，加入培養(yǎng)液以及Aβ至終濃度為20 μM。隨機(jī)選取轉(zhuǎn)染ERβ后的PC12細(xì)胞分為Aβ組和ABI-2組，ERβ組中加入培養(yǎng)液及Aβ至終濃度為20 μM；ABI-2組中除培養(yǎng)液和Aβ外，還加入Akt特異性抑制物ABI-2至終濃度20 μM。將3組細(xì)胞放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后待測。

1.2.4實(shí)時(shí)定量PCR取3組細(xì)胞懸液離心(5 min，800 g)后徹底棄上清，按照說明書方法通過Trizol提取總RNA，使用Superscript III Reverse Transcriptase試劑盒進(jìn)行cDNA合成。將2.5 μl合成的cDNA、1 μl特異性引物與TransStartTM SYBR Green qPCR Supermix充分混合后，在ABI 7500 PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR測定，以GAPDH mRNA內(nèi)參，定量產(chǎn)物濃度。

1.2.5檢測PC12細(xì)胞凋亡取3組PC12細(xì)胞，通過PI和Annexin V-FITC測定凋亡率，具體步驟如下：將待測細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，每個(gè)樣品加入5 μl AnnexinV-FITC，混勻后避光4攝氏度下孵育30 min，再加入5 μl PropidiumIodide(PI)，充分混勻，室溫下避光反應(yīng)15 min，使用BD流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定，Annexin V表達(dá)陽性的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，分組資料以相對數(shù)表示。組間比較采用方差分析及q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1Ad-ERβ-GFAP可有效轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞

由左至右分別為病毒滴度為5×107，1×108，5×108，1×109時(shí)轉(zhuǎn)染的PC12細(xì)胞。

圖1Ad-ERβ-GFAP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞

PC12細(xì)胞經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)染24 h后即出現(xiàn)熒光表達(dá)，48 h后表達(dá)最強(qiáng)，病毒濃度梯度不同，表達(dá)效果不一樣。PC12細(xì)胞熒光表達(dá)量隨病毒濃度增高而增加，病毒濃度為5×108/孔時(shí)熒光表達(dá)達(dá)到頂峰，病毒濃度為1×109/孔時(shí)熒光表達(dá)量并無明顯增加，因此選取5×108/孔時(shí)感染的PC12行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn) (如圖1)。

2.2ERβ在轉(zhuǎn)染后PC12細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示：ERβ蛋白在各組PC12細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，其中轉(zhuǎn)染組ERβ蛋白含量明顯高于對照組與空白組(P<0.01)；與對照組及空白組相比， ERβ蛋白表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，見圖2。表明ERβ基因可成功導(dǎo)入PC12細(xì)胞中并過表達(dá)，空白Ad質(zhì)粒對PC12細(xì)胞ERβ表達(dá)無影響。

圖2PC12細(xì)胞中ERβ的表達(dá) 可見轉(zhuǎn)染組ERβ表達(dá)顯著高于對照組和空白組(*P<0.01 vs 空白組，**P<0.01 vs 對照組)；空白組和對照組ERβ表達(dá)無明顯差異。

2.3過表達(dá)ERβ減輕Aβ對PC12細(xì)胞的致炎作用

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)：過表達(dá)組TNF-α mRNA表達(dá)明顯低于對照組(P<0.01)，低于ABI-2組(P<0.05)；過表達(dá)組IL-1β mRNA含量低于對照組(P<0.05)，低于ABI-2組(P<0.05)，具體數(shù)值見表1。

表1　PC12細(xì)胞中TNF-α mRNA和IL-1 mRNA表達(dá)量

可見轉(zhuǎn)染組PC12細(xì)胞中TNF-α mRNA表達(dá)明顯低于對照組(*P<0.01)，低于ABI-2組(**P<0.01)；轉(zhuǎn)染組PC12細(xì)胞中IL-1 mRNA表達(dá)低于對照組和ABI-2組(*P<0.05，**P<0.05)

2.4過表達(dá)ERβ減輕Aβ對PC12細(xì)胞的凋亡作用

經(jīng)Annexin V/PI標(biāo)記法流式細(xì)胞術(shù)對對照組、過表達(dá)組和ABI-2組3組PC12細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)組PC12細(xì)胞凋亡率為 (11.27±2.14)%，明顯低于對照組(21.14±4.13)%(P<0.01)，低于ABI-2組(15.33±4.21)%(P<0.05)，見圖3。

由左向右分別代表對照組、過表達(dá)組和ABI-2組中凋亡細(xì)胞百分比，結(jié)果可見過表達(dá)組PC12細(xì)胞凋亡率明顯低于對照組，低于ABI-2組。

3討論

腺病毒載體可以轉(zhuǎn)染不同類型的真核細(xì)胞，不受靶細(xì)胞是否為分裂細(xì)胞的限制，且轉(zhuǎn)基因效率高，體外實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率通常接近100%，容易制得高滴度病毒載體。另外，Ad進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并不整合到宿主細(xì)胞基因組，僅瞬間表達(dá)，安全性高[4]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ERβ在普通PC12細(xì)胞中表達(dá)量極低，ERβ基因可被有效轉(zhuǎn)導(dǎo)入PC12細(xì)胞并在細(xì)胞中過表達(dá)。且通過與對比普通PC12細(xì)胞相比發(fā)現(xiàn)，空白Ad載體轉(zhuǎn)染PC12對細(xì)胞中ERβ的表達(dá)并無影響，可以用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

AD的病理特征為神經(jīng)元數(shù)量減少、細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)和細(xì)胞外β樣淀粉蛋白沉積，因此認(rèn)為β樣淀粉蛋白是誘導(dǎo)AD的發(fā)生、發(fā)展的重要致病物質(zhì)[5,6]。Aβ可刺激小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子，誘發(fā)氧化應(yīng)激，損害膽堿能神經(jīng)以及誘導(dǎo)凋亡。本研究利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在加入Aβ后，PC12細(xì)胞中重要炎癥因子TNF-α和IL-1β表達(dá)量明顯增加，且通過流式細(xì)胞儀發(fā)現(xiàn)PC12細(xì)胞的凋亡率也明顯增加，驗(yàn)證了Aβ對細(xì)胞的毒性作用。通過與普通PC12細(xì)胞的對比，轉(zhuǎn)染ERβ的PC12細(xì)胞在無雌激素的環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的表達(dá)明顯減少，且凋亡率也有所下降，說明ERβ可以通過非結(jié)合雌激素的方式減輕Aβ對細(xì)胞的毒性以及抗凋亡作用。

Akt又被稱為蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)，是一種分子量約為 60 kDa的絲/蘇氨酸蛋白激酶，處于多條信號通路的重要交叉點(diǎn)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化及凋亡的關(guān)鍵作用[7]。通過對AD患者額葉及顳葉標(biāo)本檢測發(fā)現(xiàn)，Akt的活性和磷酸化濃度明顯降低，并有研究發(fā)現(xiàn)激活A(yù)kt途徑能在體外減輕Aβ對細(xì)胞的毒性作用[8]。另外，當(dāng)雌激素受體與配體結(jié)合后，可通過Akt途徑發(fā)揮生物學(xué)作用[9]，但尚無ERβ是否可以以非配體依賴方式與Akt途徑相互作用的報(bào)道。本研究在無雌激素存在的情況下，向轉(zhuǎn)染ERβ的PC12細(xì)胞中加入Akt的特異性抑制物API-2后發(fā)現(xiàn)，ERβ的抗炎、抗凋亡能力受到抑制。結(jié)果充分說明了ERβ在不依賴雌激素受體的情況下，是通過Akt途徑發(fā)揮其抗炎、抗凋亡及減輕Aβ細(xì)胞毒性的作用。是否還有別的途徑參與ERβ的非配體依賴，還需要進(jìn)一步研究。

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Estrogen receptor β attenuates the toxicity in PC12 cells induced by β-amyloid via estrogen independent pathwayLINa,JIANGZhi-hong,DAIYue,etal.(TheAffiliatedZhongshanHospitalofDalianUniversity,Dalian116001,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of estrogen receptor beta on beta amyloid induced inflammation and apoptosis in PC12 cells without estrogen stimulus.MethodsPC12 cells were divided into control group,blank group,and Ad-ERβ-EGFP group,treatment with PBS,blank vector and Ad-ERβ-EGFP,respectively.Western blot was used to detect ER beta protein expression in three groups.Uninfected PC12 cells were randomly selected as control group.After transfection of ERβ,PC12 cells were divided into Over-expression group and ABI-2 group.All 3 groups were treated with Aβ,whereas ABI-2 group was also added with Akt specific inhibitor ABI-2.Real time quantitative PCR was used to detect TNF-α and IL-1β mRNA expression.Flow cytometry was used to apoptosis.ResultsERβ over-expressed in PC12 cells after transfection.TNF-α and IL-1β mRNA expression in over-expression group were significantly lower than those of the control group and ABI-2 groups.Apoptosis of PC12 cells in over-expression group was obviously lower than those of the control group and ABI-2 group.ConclusionInependent of estrogen,ERβ could represent anti-inflammatory and anti apoptotic effects and thus reduce the toxic effects of Aβ via Akt pathway.

Key words:estrogen;Estrogen receptor;Alzheimer's disease;Amyloid beta;PPAR-gamma

(收稿日期：2015-03-12)

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：R741.02；Q816

文章編號：1007-4287(2016)02-0198-04

*通訊作者