郝家輝，李曉嵐（昆明醫(yī)科大學,云南 昆明 650031；昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院,云南 昆明 650031）

SLE患者B細胞TNFAIP3、TNIP1基因啟動子、增強子活性的研究

郝家輝，李曉嵐
（昆明醫(yī)科大學,云南 昆明 650031；昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院,云南 昆明 650031）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡，TNFAIP3、TNIP1基因，啟動子、增強子

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種可累及多系統(tǒng)，多臟器的慢性、炎癥性、自身免疫性疾病，其臨床表現(xiàn)也是多種多樣，該病易產(chǎn)生大量自身抗體和免疫復合物，并常伴有免疫細胞功能亢進。SLE的發(fā)病機制復雜，至今仍未完全闡明。SLE多發(fā)于女性，特別是育齡期婦女，男女患病率存在明顯差異，約為1：9。其發(fā)病率及患病率存在種群及地區(qū)差異，中國人患病率約為31～70/10萬。目前系統(tǒng)性紅斑狼瘡確切病因尚未闡明，公認是遺傳易感性、環(huán)境觸發(fā)因子及性激素共同作用的結果，其中遺傳因素在SLE的發(fā)病機制中扮演著重要的角色。研究表明，SLE以大量自身抗體產(chǎn)生和免疫復合物廣泛沉積為其病理特征，造成機體多個靶組織、器官炎癥損傷并表現(xiàn)出相應的多種臨床癥狀和體征。SLE許多臨床癥狀被認為是B細胞介導的免疫反應引起，特別是B細胞的高度活化會針對多種自身的抗原可以產(chǎn)生多種自身的抗體，特別是抗DNA抗體。B淋巴細胞刺激因子家族的異常、自身反應性B淋巴細胞凋亡的異常、B淋巴細胞抗原受體的信號傳導失控、共刺激信號的紊亂等B細胞的異常在SLE發(fā)生發(fā)病中起著相當重要的作用。而B細胞功能的亢進、細胞因子分泌、抗體產(chǎn)生、受體活化后的共同反應會導致T細胞的活化。因此，T、B細胞功能異常，B細胞自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定喪失和壽命延長是發(fā)生自身免疫應答最為重要的機制。有相關研究證實，不論活動期與穩(wěn)定期的SLE患者，均會存在克隆性增生和異?；罨腂淋巴細胞，B細胞的異?；罨芍苯佑绊懖∏榛顒?，晚期B細胞異?；罨荢LE患者不能徹底被治愈與病情復發(fā)的重要原因之一。近幾年來，全基因組關聯(lián)研究（Genome-wide association studies，GWAS）以及多項候選基因研究已經(jīng)證實TNFAIP3和TNIP1是SLE的易感基因。TNFAIP3和TNIP1的功能主要涉及固有免疫，通過對NF-κ B信號通路的負調(diào)節(jié)抑制B細胞的過度活化和凋亡缺陷，可能在SLE等自身免疫病的發(fā)生發(fā)展中起到至關重要的作用。

1 TNFAIP3（A20）

腫瘤壞死因子α誘導蛋白3（TNF α-induced protein 3，TNFAIP3）基因定位于6q23，基因全長15, 869bp，cDNA基因長度為2373bp，共有9個外顯子，編碼A20蛋白，是一種細胞質(zhì)鋅指蛋白。A20可以抑制腫瘤壞死因子（TNF）受體和Toll樣受體（TLR）誘導的核因子kappa-B（NF-κ B）活性以及TNF介導的程序性細胞死亡（PCD），是炎癥反應的一個重要的負性調(diào)節(jié)因子，能有效終止NF-κ B介導的促炎癥反應[1]。我們發(fā)現(xiàn)，A20缺陷的小鼠可以發(fā)生較為嚴重的炎癥反應，并對TNF和脂多糖的刺激較為敏感；A20缺陷的細胞非但不能有效地終止TNF誘導的NF-κ B反應，反而更易導致TNF介導的細胞凋亡的出現(xiàn)。因此，TNFAIP3被認為是一種內(nèi)源性的可以調(diào)控炎癥反應的基因，也是可以導致自身免疫性炎癥反應形成的重要的候選基因之一。TNFAIP3在炎癥調(diào)節(jié)方面的多種潛在作用至今尚未完全闡明，但似乎是細胞和環(huán)境依賴的。例如TNFAIP3的突變/缺失通常與B淋巴細胞的發(fā)育相關，提示TNFAIP3在這一細胞類型中的缺失可導致淋巴瘤的發(fā)生，可能是因為B細胞中抗細胞凋亡/抑制增殖的NF-κ B信號增強的緣故[2-3]。

2 TNIP1（ABIN1)

TNIP1/ABIN1是TNFAIP3/A20的相互作用蛋白，又稱A20結合抑制NF-κ B激活因子(A20-binding inhibitor of NF-κ B activation,ABIN1)，于1999年首次被克隆出來。其mRNA廣泛表達在多種組織和細胞，包括淋巴細胞，脾臟，骨骼肌等，在細胞分化、細胞凋亡、炎癥反應調(diào)節(jié)方面具有重要功能。人類TNIP1基因位于染色體5q32-q33.1，長度為51492bp，cDNA基因長度為1911bp，有18個外顯子，外顯子1為非編碼外顯子，TNIP1也稱為NAF1或ABIN-1。TNIP1蛋白包含四種ABIN同源區(qū)域：AHD1,AHD2, AHD3,AHD4,其中AHD1主要作用是可以介導TNIP1與TNFAIP3的結合，AHD2是一個與抑制NF-κ B的功能密切相關的重要的調(diào)節(jié)區(qū)域，迄今為止，還沒有關于AHD3和AHD4的相關功能的報道。TNIP1的缺乏對NF-κ B通路的抑制幾乎沒有影響，但TNIP1的表達是受NF-κ B誘導的，而TNIP1的過表達又反過來抑制TNF對NF-κ B的激活，故TNIP1通過與A20相互作用，在抑制NF-κ B通路中發(fā)揮著部分效應，此外，TNIP1不與A20結合也能獨立抑制TNF誘導的細胞凋亡[4]。有研究表明A20抑制NF-κ B信號能力的減弱可導致高水平的TNIP1產(chǎn)生，進而下調(diào)TNF-a,并在免疫細胞活化、細胞因子信號轉(zhuǎn)導和細胞凋亡等生物學的功能中起到重要作用[5]。近年來發(fā)現(xiàn)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK2）信號通路可參與調(diào)控細胞的增殖與分化，抑制凋亡信號的傳導。TNIP1過度表達會增加細胞表面CD4分子的表達，從而抑制了ERK2的核轉(zhuǎn)運與活化，阻斷ERK2依賴的ELK1轉(zhuǎn)活，可證明TNIP1為ERK2信號通路的衰減基因之一。因此我們可以推斷，TNIP1有可能間接調(diào)節(jié)T、B淋巴細胞的增殖及分化，繼而影響SLE的發(fā)病情況。

3 TNFAIP3、TNIP1基因多態(tài)性與SLE的關系

近幾年以來，全基因組關聯(lián)研究（Genome-wide association studies，GWAS）和大量的候選基因研究均證實表明TNFAIP3位點的多個單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）與系統(tǒng)性紅斑狼瘡密切相關。在歐洲、日本以及中國的漢族人群中研究表明SLE患者的TNIP1基因啟動子區(qū)的兩個SNP rs7708392和rs10036748與SLE易感性顯著相關[8-10]；Wang C[11】[7]結果顯示TNFAIP3的rs2230926（位于Exon3，為錯義突變），rs5029937和rs5029924 （upstream）等位基因及單體型在SLE組中的頻率顯著高于正常對照（Corrected P=0.012，Corrected P= 0.012，Corrected P=0.030），與SLE呈顯著相關，而TNIP1的rs7708392在SLE組中的頻率低于正常對照，P=0.02，但校正P=0.39；分層研究發(fā)現(xiàn)TNFAIP3基因多態(tài)性與多種SLE臨床亞型如蝶形紅斑、關節(jié)炎、血細胞減少和高滴度抗核抗體等相關聯(lián)；而TNIP1僅與發(fā)病年齡呈弱相關。結合同期研究結果[10-12]表明TNFAIP3和TNIP1可能是中國漢族人群SLE的常見易感基因，并對疾病多種臨床表型的病理機制有所貢獻。Y.Fan等[12]對2011年以前所有GWAs和獨立樣本的復制研究結果進行meta分析，確定rs2230926與所有種族人群SLE呈顯著相關。LeeYH[13]的 meta分 析 結果均 顯 示 rs2230926，rs3757173的罕見等位基因與所有人種尤其是歐洲和亞洲人SLE相關，另外還發(fā)現(xiàn)rs5029939罕見等位基因與所有人群尤其歐洲人SLE發(fā)病風險呈強相關，這與我們的研究結果是吻合的。Lodolce等[7]對非洲裔美國人SLE患者進行病例對照的復制研究，不僅證實了TNFAIP3去泛素化區(qū)域（DUB）即編碼區(qū)2個無義突變多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)A125V變異調(diào)節(jié)A20蛋白的去泛素化（DUB）活性。Adrianto[18]等用精細基因繪圖和基因組重復測序法對不同種族SLE進行研究，得出TNFAIP3的風險單體型并確定了一個TT＞A雙核苷酸多態(tài)性（一個T缺失，另一個T轉(zhuǎn)換為A）與歐洲人群和韓國人SLE相關。這一變異位于一個高度保守區(qū)域，具調(diào)控潛力并與核蛋白復合體結合組成親和力降低的NF-κ B亞單位。而且，與非風險性單體型相比，攜帶此變異的單體型引起TNFAIP3mRNA 和A20蛋白質(zhì)的表達減少，因此確定TT＞A變異是導致TNFAIP3和SLE間相關性的一個最有可能的功能性多態(tài)性。

綜上所述，我們將采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分別檢測SLE患者TNFAIP3和TNIP1基因啟動子、增強子活性，以及我們前期研究發(fā)現(xiàn)的分別位于TNFAIP3基因上游的SNPs rs5029924，以及TNIP1基因SNP rs7708392和rs10036748對基因下游功能的影響；并應用RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒的慢病毒表達系統(tǒng)以TNFAIP3 rs2230926、rs5029937、rs5029924和TNIP1 rs7708392、rs10036748共同和（或）獨立轉(zhuǎn)染SLE患者B淋巴細胞，檢測B細胞活化、增殖、分化及細胞免疫功能的相關指標，對TNFAIP3和TNIP1基因的功能以及在SLE發(fā)病中的作用機制進行深入的研究，以期在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機制和免疫病理學研究方面有實質(zhì)性的突破和創(chuàng)新，為下一步開展基因敲除/敲入狼瘡動物模型研究打下堅實的基礎。

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10.3969/j.issn.1008-4118.2016.01.032

2016-01-25