陳　俊　李良平

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膜微粒在肝臟疾病中的研究進(jìn)展

陳俊李良平

膜微粒是細(xì)胞活化、凋亡早期、應(yīng)力作用時(shí)釋放的一類(lèi)富含脂類(lèi)、蛋白質(zhì)、核酸的細(xì)胞膜包裹的顆粒，其組成與母體細(xì)胞的來(lái)源和釋放機(jī)制密切相關(guān)。不同細(xì)胞來(lái)源的膜微粒內(nèi)含物并不完全一致，生物學(xué)功能與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系也各有異同。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在生理作用與機(jī)制方面，還是在疾病發(fā)生發(fā)展與臨床診治方面，膜微粒都占有十分重要的作用和地位。此文就膜微粒及其在肝臟疾病中的研究進(jìn)展作一綜述。

膜微粒；非酒精性脂肪性肝炎；急性肝損傷；肝纖維化；肝細(xì)胞癌

膜微粒(MP)是一類(lèi)廣泛存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清液以及各種體液(血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁)中，直徑為0.1～1 μm，富含蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、mRNA、miRNA、DNA的細(xì)胞膜包裹的顆粒[1-3]。紅細(xì)胞、白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等大多數(shù)真核細(xì)胞都能在應(yīng)激、凋亡或者應(yīng)力的作用下釋放MP。目前研究認(rèn)為MP是亞細(xì)胞水平信息傳遞的載體，是一種新的細(xì)胞間信息傳遞機(jī)制。既往對(duì)MP的研究主要集中在凝血、血管性疾病、某些傳染性及自身免疫性疾病方面。近年來(lái)國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，在各類(lèi)肝臟疾病中MP的釋放也會(huì)增加，并可能參與了細(xì)胞間通訊、細(xì)胞遷移、血管新生和免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程，認(rèn)為MP很有可能成為這類(lèi)疾病的診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。本文就MP與肝臟疾病關(guān)聯(lián)性的研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)要綜述。

1　MP的定義

1967年，Wolf首次發(fā)現(xiàn)在活化的血小板周?chē)嬖谝恍┚哂写龠M(jìn)凝血的顆粒，并將其命名為“血小板塵?！?platelet dust)[4]。之后對(duì)MP的研究進(jìn)展緩慢，且一直沒(méi)有關(guān)于MP的精確定論。近年來(lái)運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、電子顯微鏡和動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)，人們才逐漸了解到MP的特征。學(xué)者們將在組織及體液中觀察到的由細(xì)胞膜包裹的囊泡狀物統(tǒng)稱(chēng)為細(xì)胞外囊泡(EV)[5]，它們是一種母體細(xì)胞來(lái)源的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由死亡或活化的細(xì)胞釋放。目前發(fā)現(xiàn)有兩種類(lèi)型的EV，包括外泌體(EXO)和MP或者微泡(MV)(目前認(rèn)為MP與MV是同一種物質(zhì)的不同表述方式[6])。實(shí)驗(yàn)中主要根據(jù)大小、密度、產(chǎn)生方式來(lái)區(qū)分EXO和MP，具體如下：EXO直徑<100 nm，密度1.13～1.19 g/mL，由內(nèi)體性溶酶體作用產(chǎn)生[7]；MP直徑100～1000 nm，由質(zhì)膜“出芽”形成，膜表面表達(dá)凋亡標(biāo)志物，能被膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)標(biāo)記[8-9]。人們常說(shuō)的凋亡小體(apoptosis body)，是胞膜皺縮內(nèi)陷，分割包裹胞質(zhì)形成的泡狀小體，內(nèi)含DNA及細(xì)胞器，直徑為1～4 μm[9]，并不屬于EV的范疇。

2　MP的形成機(jī)制

微粒的脫落是所有真核生物受到刺激或凋亡時(shí)的一個(gè)原始應(yīng)激反應(yīng)，但其具體形成機(jī)制十分復(fù)雜，可能是多因素疊加的結(jié)果。大部分研究認(rèn)為當(dāng)受到炎性反應(yīng)、凋亡刺激時(shí)，細(xì)胞骨架重構(gòu)，MP以“出芽”方式產(chǎn)生，以胞吐的形式釋放到細(xì)胞外，其產(chǎn)生受細(xì)胞內(nèi)Ca2+和細(xì)胞骨架相關(guān)酶的調(diào)節(jié)[10]。正常細(xì)胞膜的磷脂雙分子層是由外層的磷脂酰膽堿和鞘磷脂與內(nèi)層的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸(PS)組成。細(xì)胞活化過(guò)程中，活化誘導(dǎo)物使Ca2+聚集，抑制或降低轉(zhuǎn)位酶等多種酶的效能，繼而PS與磷脂酰乙醇胺不能被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)膜，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層發(fā)生不對(duì)稱(chēng)重排，PS暴露于細(xì)胞膜外側(cè)。同時(shí)相對(duì)升高的Ca2+濃度可使細(xì)胞骨架蛋白斷裂并發(fā)生重構(gòu)，質(zhì)膜向細(xì)胞外突出形成“出芽”并脫落，形成MP[11]。細(xì)胞凋亡與天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)和Rho相關(guān)卷曲螺旋形成的蛋白激酶(ROCK)有關(guān)。在凋亡途徑中，MP的形成依賴(lài)于ROCKⅠ和caspase-3的激活，ROCKⅠ主要作用于肌球蛋白輕鏈和肌動(dòng)蛋白，肌球蛋白輕鏈磷酸化加快并與肌動(dòng)蛋白相互結(jié)合，引起細(xì)胞收縮并釋放MP[12]。質(zhì)膜“出芽”過(guò)程中包裹了一定的細(xì)胞質(zhì)，富含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等多種細(xì)胞成分，研究推測(cè)這些成分并不是隨機(jī)包裹進(jìn)來(lái)的，而是在疾病特定的病理生理過(guò)程中生成的。

3　MP發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的途徑

MP豐富的細(xì)胞表面分子(如膜結(jié)合蛋白、膜錨定受體、黏附分子、細(xì)胞表面特異抗原等)和內(nèi)含物(細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、信號(hào)通道蛋白等蛋白質(zhì)及RNA、miRNA、DNA)構(gòu)成了其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的基礎(chǔ)。研究顯示MP可能通過(guò)以下兩種途徑發(fā)揮作用[6]：(1)抗原抗體反應(yīng)直接激活受體細(xì)胞。MP表面抗原分子與受體細(xì)胞表面抗體結(jié)合，激活受體細(xì)胞，啟動(dòng)相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，產(chǎn)生應(yīng)答國(guó)。(2)MP搭載的內(nèi)容物改變受體細(xì)胞功能表達(dá)。MP與目的細(xì)胞融合或直接釋放其內(nèi)容物，影響細(xì)胞表型及基因的表達(dá)，使受體細(xì)胞功能發(fā)生改變，即完成信息的傳遞。值得注意的是，MP不止停留于起源細(xì)胞的周?chē)?，也可以隨血液循環(huán)遷徙至全身各處[13]，因此，MP以上兩種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不僅可影響其周?chē)?xì)胞，還可以調(diào)節(jié)遠(yuǎn)離起源細(xì)胞的組織細(xì)胞。鑒于以上作用，可以認(rèn)為MP不僅可作為疾病的檢測(cè)指標(biāo)，還可作為疾病的治療靶點(diǎn)。

4　MP的檢測(cè)方法

MP作為一群細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)能穩(wěn)定存在于多種體液內(nèi)[14]，體外反復(fù)超速離心或凍融均不影響其形態(tài)大小，但4℃或37℃保存可能導(dǎo)致MP結(jié)構(gòu)降解[15]。MP可通過(guò)多步差速離心法從樣本中分離，常規(guī)透射電鏡或負(fù)染透射電鏡可觀察MP的大小和形態(tài)[16]；通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，可以確定MP的蛋白質(zhì)組成[17]；流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)Annexin V錨定PS，并聯(lián)合熒光素標(biāo)記的高特異性抗體結(jié)合MP上的特異性標(biāo)志物，可以分析微粒的大小和形態(tài)、膜表面特異的抗原分子以及內(nèi)含物[18]；甚至可以通過(guò)ELISA方法初步檢測(cè)MP[19]。

5　MP在肝臟疾病中的研究進(jìn)展

肝臟損傷是各類(lèi)細(xì)胞間相互作用的結(jié)果，而MP恰巧就是這些細(xì)胞間信息傳遞的媒介。近年來(lái)的研究主要集中在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、急性肝損傷、肝纖維化、肝細(xì)胞癌等疾病過(guò)程。

5.1MP與NASH

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)與肥胖、糖尿病、血脂異常、高血壓相關(guān)，是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)形式。NAFLD包括非酒精性脂肪肝(NAFL)和NASH[20]。肝臟過(guò)多攝取游離脂肪酸造成的脂質(zhì)沉積是NASH發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。脂毒性引起的病理性血管形成是肥胖相關(guān)慢性肝臟炎性反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵病理過(guò)程[21]，肝細(xì)胞釋放的MP可能是NASH肝臟脂毒性和炎性反應(yīng)的橋梁。最近一項(xiàng)研究指出，過(guò)度飽和脂肪酸沉積的小鼠肝細(xì)胞釋放MP，MP數(shù)量與炎性反應(yīng)嚴(yán)重程度相關(guān)，MP表面的血管非炎性蛋白-1(Vanin-1)介導(dǎo)MP進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞并將其激活，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞遷徙和病理性血管形成[13]。Vanin-1包含糖基磷脂酰肌醇(GPI)，與細(xì)胞間黏附和遷徙有關(guān)，Vanin-1介導(dǎo)MP在血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)化中發(fā)揮了“脂質(zhì)筏”的作用。同樣，Povero等[16]研究NASH小鼠，發(fā)現(xiàn)MP水平與肝細(xì)胞凋亡、纖維化和新生血管形成有關(guān)。Spearman相關(guān)性分析指出，MP水平與細(xì)胞凋亡(r2=0.64，P<0.05)、肝纖維化程度(r2=0.66，P<0.05)、新生血管(r2=0.71，P<0.05)相關(guān)，其水平隨肝臟損傷程度加重而升高。

有研究報(bào)道，通過(guò)特定免疫細(xì)胞來(lái)源的MP定量，可從NAFLD中鑒別NASH并判斷肝臟炎性反應(yīng)程度。正常肝組織中有多種免疫細(xì)胞，如庫(kù)普弗細(xì)胞(KC)、自然殺傷細(xì)胞(NK)和自然殺傷T細(xì)胞(NKT)。固有免疫系統(tǒng)的激活是發(fā)生NASH的基礎(chǔ)。有研究表明KC和浸潤(rùn)巨噬/單核細(xì)胞、恒定自然殺傷T細(xì)胞(iNKT)在NASH的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[22-24]。同時(shí)巨噬細(xì)胞在肝臟中的聚集與NASH病理分期分級(jí)有關(guān)[25]。以色列學(xué)者Kornek等[26]采集慢性丙型肝炎(CHC)、NAFL、NASH患者及正常對(duì)照組外周靜脈血，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析MP表面抗原并計(jì)數(shù)，指出CD14+和iNKT MP與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)升高相關(guān)，Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.63和0.59，并且兩者也均與組織學(xué)炎性反應(yīng)程度相關(guān)(r=0.58，P<0.000 1)，但與纖維化分級(jí)無(wú)關(guān)。因此，檢測(cè)CD14+和iNKT MP可診斷NASH。

NAFLD與肥胖密切相關(guān)，肥胖導(dǎo)致代謝綜合征的中心事件是脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。Eguchi等[27]指出，暴露于飽和脂肪酸的脂肪細(xì)胞釋放高水平MP，引導(dǎo)單核和巨噬細(xì)胞募集于脂肪組織。進(jìn)一步研究表明，從ob/ob小鼠分離MP，靜脈注射到野生型小鼠中，在脂肪組織和外周循環(huán)中均可觀察到單核細(xì)胞活化。Koeck等[28]研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者的內(nèi)臟脂肪可釋放MP和EXO，兩者可整合到肝星狀細(xì)胞中，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)參與的信號(hào)通路失調(diào)，為研究NAFLD的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路。

5.2MP與急性肝損傷

CD39，即是胞外核苷三磷酸雙磷酸酶1(E-NTPDase1)，能水解胞外三磷酸腺苷(ATP)和二磷酸腺苷(ADP)為一磷酸腺苷(AMP)和游離的磷酸。表達(dá)CD39+的活性MP可調(diào)節(jié)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的信息交換[29]。以往研究認(rèn)為，缺失CD39會(huì)嚴(yán)重影響血管形成和肝組織再生，不利于急性肝損傷的肝臟修復(fù)[30]。近期研究指出，急性肝臟損傷時(shí)，造血干細(xì)胞(HSC)釋放CD39+、CD133+MP進(jìn)入肝臟，減輕血管炎性反應(yīng)并促進(jìn)肝組織再生修復(fù)，且HSC和CD133+MP發(fā)揮作用均依賴(lài)于CD39+MP。同時(shí)，研究還納入急性肝損傷、慢性肝損傷急性加重患者進(jìn)行臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)急性肝損傷時(shí)CD39+MP明顯升高，而CD39+/CD133+MP在慢性肝損傷急性加重患者中明顯升高，兩者均與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(VCAM-1)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)顯著相關(guān)[31]。因此，CD39+MP、CD133+MP可用于評(píng)估急性肝損傷患者病情，甚至可評(píng)估肝移植的時(shí)機(jī)。肝切除或移植引起的缺血再灌注(IRI)可導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生，進(jìn)一步損傷肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致KC再生、血小板活化和微循環(huán)障礙。Teoh等[32]的研究認(rèn)為，肝臟發(fā)生IRI時(shí)，血漿中各類(lèi)細(xì)胞來(lái)源的MP釋放量明顯增多，MP通過(guò)促炎效應(yīng)和活化血小板參與IRI的病理過(guò)程。MP的促炎特性如下：激活核因子-κB(NF-κB)和JNK激酶，使黏附分子E-選擇素(E-selectin)、P-選擇素(P-selectin)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)和VCAM-1高表達(dá)。而當(dāng)加入Annexin V的同源二聚體Diannexin(ASP8597)時(shí)，觀察到肝臟炎性反應(yīng)減輕。Diannexin不僅可抑制血栓形成[33]，還可終止肝臟氧化應(yīng)激級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

5.3MP與肝纖維化

肝竇內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管化先于其他肝血管重組的發(fā)生，并引起血液分流，形成血管通道，最終產(chǎn)生肝纖維化。Hedgehog(Hh)信號(hào)通路激活與脂肪性肝炎和纖維化相關(guān)，與匯管區(qū)炎性反應(yīng)密切相關(guān)[34]。Witek等[35]從膽管結(jié)扎大鼠的血液、膽汁中分離得到MP，第1次證明了肝細(xì)胞來(lái)源的MP可存在于肝纖維化大鼠的血液和膽汁中。研究進(jìn)一步指出，肝纖維化模型中肝星狀細(xì)胞釋放大量生物活性MP，這種MP帶有Hh信號(hào)通路的配體，以MP為轉(zhuǎn)運(yùn)載體，激活肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，改變相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致肝竇毛細(xì)血管化，促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展，這與既往研究結(jié)果相符[36-37]。所以攜帶Hh信號(hào)通路配體的MP可介導(dǎo)肝竇毛細(xì)血管化和肝纖維化。Kornek等[38]的研究指出，CD4+MP、CD8+MP在CHC患者外周血中明顯升高，與肝臟組織學(xué)評(píng)分相關(guān)。研究進(jìn)一步指出通過(guò)細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)作用，CD4+MP、CD8+MP與肝星狀細(xì)胞的細(xì)胞膜融合，其攜帶的信號(hào)分子CD147(EMMPRIN，細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子)激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2通路，上調(diào)肝星狀細(xì)胞致纖維化基因的表達(dá)。此外，Rautou 等[39]進(jìn)行的一項(xiàng)綜合離體及活體研究發(fā)現(xiàn)，血漿MP可減輕肝硬化門(mén)脈高壓，MP使血管收縮性降低，血壓降低，促進(jìn)與門(mén)脈高壓有關(guān)的動(dòng)脈血管擴(kuò)張，其中COX-1及MP表面的PS參與以上生理過(guò)程。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)肝硬化患者血漿內(nèi)皮細(xì)胞(CD31+/CD41-)MP、全白細(xì)胞(CD11a+)MP、T細(xì)胞(CD4+)MP、紅細(xì)胞(CD235a+)MP明顯升高，其中肝硬化程度與CD31+/CD41-MP水平顯著相關(guān)。

5.4MP與肝細(xì)胞癌

越來(lái)越多的研究表明，MP在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面具有重要作用。Sarkar等[40]發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞來(lái)源的MP可通過(guò)傳遞caspase-1誘導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞凋亡。內(nèi)皮細(xì)胞、血小板來(lái)源的MP含有caspase-3[41-42]。腫瘤細(xì)胞來(lái)源的MP攜帶Fas配體(FasL或CD95L)，導(dǎo)致具有Fas受體的淋巴細(xì)胞凋亡[43]。腫瘤細(xì)胞分泌微粒(TMV)參與腫瘤進(jìn)展的多個(gè)方面，TMV向周?chē)钠胀?xì)胞傳遞腫瘤特異性蛋白而改變細(xì)胞表型，傳遞核酸而改變細(xì)胞功能，增加逆轉(zhuǎn)錄干擾基因的穩(wěn)定性，從而建立腫瘤微環(huán)境[44]；同時(shí)，MP可促進(jìn)血管新生、破壞細(xì)胞基質(zhì)，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性。另外，有研究指出肝細(xì)胞癌化學(xué)治療的高耐藥性與MP有關(guān)。Takahashi等[45]證實(shí)了MP內(nèi)含的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lincRNA)參與了基于TGF-β的耐藥過(guò)程。lincRNA-ROR(linc-ROR)是一種在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的競(jìng)爭(zhēng)性長(zhǎng)鏈非編碼RNA，在腫瘤細(xì)胞來(lái)源的MP中的含量也較豐富。腫瘤細(xì)胞釋放MP，并高表達(dá)linc-ROR，改變目標(biāo)細(xì)胞功能，使細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物敏感性降低。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞表達(dá)CD133+，而CD133+原始腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物的應(yīng)答較差[46]，研究觀察到TGF-β可使CD133+細(xì)胞增多，并在培養(yǎng)基中呈菌落生長(zhǎng)，若加入linc-ROR抑制劑，可削弱上述效應(yīng)。

6　展望

MP在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，血漿MP水平與肝臟疾病密切相關(guān)。通過(guò)分析其表面抗原、蛋白質(zhì)及核酸可知，MP可能成為潛在的具有疾病特異性的生物標(biāo)志物和評(píng)價(jià)療效的有效工具，根據(jù)其介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特征，MP可成為多種疾病治療的靶點(diǎn)。但MP導(dǎo)致疾病的機(jī)制尚不清楚，需要更深入的研究，其臨床應(yīng)用前景也需要進(jìn)一步探索。另外，為了更好地鑒別肝臟疾病并評(píng)估治療效果，還需要準(zhǔn)確、簡(jiǎn)化地測(cè)量循環(huán)中的MP，因此MP測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化是未來(lái)臨床研究努力的方向。

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(本文編輯：周駿)

563003遵義醫(yī)學(xué)院(現(xiàn)就職于四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院消化科)

李良平，Email: llp0131@medmail.com.cn

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.02.007

2015-07-30)