吳月明，朱耐偉，朱勇喆

1.第二軍醫(yī)大學微生物學教研室，上海 200433; 2.第二軍醫(yī)大學海軍醫(yī)學系學員5隊，上海 200433

?

·綜述·

腸道病毒71型感染動物模型的應用與局限

吳月明1,2,*，朱耐偉1,*，朱勇喆1

1.第二軍醫(yī)大學微生物學教研室，上海 200433; 2.第二軍醫(yī)大學海軍醫(yī)學系學員5隊，上海 200433

腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是一種被忽視的熱帶傳染病——手足口病的主要病原體之一，過去15年在亞太地區(qū)引起了多次手足口病暴發(fā)。由于脊髓灰質炎病毒的有效控制，EV71已成為最重要的嗜神經(jīng)腸道病毒，其嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥威脅著兒童健康。合適的動物模型可幫助更好地了解EV71神經(jīng)致病機制，并有利于開發(fā)有效的疫苗和治療藥物。本文就EV71已建立的3類主要動物模型(非人靈長類動物模型、小鼠適應性模型及轉基因小鼠模型)的特征、應用與局限進行綜述。

腸道病毒71型；動物模型；應用與局限

腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)為手足口病的主要病原體之一，是一種被忽視的熱帶傳染病[1]。EV71屬于小RNA病毒科，含有4種結構蛋白，分別為VP1、VP2、VP3和VP4。VP1可識別和結合宿主細胞表面受體蛋白。根據(jù)VP1核苷酸序列的差異，可將EV71分為A、B、C 3個基因型[2]。

EV71感染可引起持續(xù)發(fā)熱、腹瀉、皮疹、無菌性腦膜炎和腦炎，少數(shù)危及生命，如腦干腦炎、急性弛緩性麻痹[3]、自主神經(jīng)系統(tǒng)失調和肺水腫等[4-5]。自1969年在美國加利福尼亞州首次發(fā)現(xiàn)EV71，其在全世界至少引起12次手足口病暴發(fā)[6]。20世紀90年代末EV71在馬來西亞和中國臺灣地區(qū)暴發(fā)，主要感染兒童，導致嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[6-7]。此后，亞太地區(qū)包括中國臺灣地區(qū)、馬來西亞、越南、新加坡、日本和中國大陸，經(jīng)歷了多次EV71相關手足口病疫情[8]。根據(jù)中國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會報道，2015年我國共有2 014 999例患者確診為手足口病，死亡124例[9]。

目前，EV71感染動物模型包括非人靈長類動物模型、小鼠適應性模型及轉基因小鼠模型，已用于研究EV71的發(fā)病機制、疫苗與藥物研發(fā)，但尚未建立一種可涵蓋人類EV71感染各方面的模型。有些模型缺乏表面效度(與人類癥狀的相似度)，有些模型則缺乏構念效度(與人類病因的相似度)[10]。目前的動物模型各有優(yōu)缺點，非人靈長類動物模型可用于評價EV71的神經(jīng)毒力，小鼠適應性模型可用于研究疾病的發(fā)病機制及防治，而轉基因小鼠模型則有助于了解病毒的生物學特性及其與宿主的相互作用。

1　非人靈長類動物模型

自20世紀90年代末EV71相關手足口病疫情暴發(fā)后，非人靈長類動物模型被用來評估和檢測EV71的神經(jīng)毒力。研究表明，食蟹猴、恒河猴和長尾黑顎猴均可被EV71感染[11-12]。

Nagata等[13-14]將EV71通過髓內和靜脈感染食蟹猴，表現(xiàn)出錐體束損傷(弛緩性麻痹等)和錐體外系損傷(震顫和共濟失調等)，且病毒抗原廣泛分布于脊髓、腦干、小腦皮質、齒狀核及大腦。食蟹猴的神經(jīng)病理特征與重癥EV71腦炎患者的病變相一致[15-17]，提示食蟹猴的中樞神經(jīng)組織對EV71的易感性與人相似。

Zhang等[18]使用EV71阜陽分離株感染成年恒河猴，引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和外周神經(jīng)病變所致的神經(jīng)元損傷。該模型建立了EV71系統(tǒng)性感染過程和病理變化，揭示了EV71的病毒血癥動力學、免疫反應、組織病理學變化及神經(jīng)元和外周神經(jīng)的病變。該模型經(jīng)顱內感染可引起肺水腫和肺門出血，是第1個能模擬EV71在非自然宿主中引起肺水腫的動物模型。

Liu等[19]通過氣管內注入EV71感染恒河猴嬰猴，其四肢與口部出現(xiàn)手足口病樣丘疹和水皰。恒河猴嬰猴的炎癥反應與成年恒河猴類似，主要發(fā)生于氣管和肺部。病毒聚集在恒河猴嬰猴的延髓和下丘腦中，但未引起與食蟹猴類似的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。有研究表明[20]，恒河猴嬰猴不僅可作為手足口病的動物模型，還可評價EV71滅活疫苗的療效。

Koroleva等[21]使用EV71保加利亞臨床分離株感染長尾黑顎猴，致其癱瘓，并出現(xiàn)與兒童神經(jīng)感染相似的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。同時，EV71感染長尾黑顎猴可引起典型的腦干腦炎和脊髓灰質炎。因此，長尾黑顎猴可用于研究EV71引起的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。

EV71對食蟹猴具有廣泛的嗜神經(jīng)性。不同毒力的毒株感染食蟹猴后，在神經(jīng)毒力方面沒有顯著差異，因此該模型不適于評估病毒的神經(jīng)毒力[13-14]。食蟹猴的癥狀與人類有所不同，并不出現(xiàn)皮膚損傷和肺水腫。雖然所有EV71亞型均證實對食蟹猴具有神經(jīng)毒力，但尚未明確該模型是否可用于評價減毒活疫苗變異株的神經(jīng)毒力[10]。

成年恒河猴感染EV71后可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染及肺部炎癥和肺水腫，但未能引起皮膚皰疹性病變及典型的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[18]。恒河猴嬰猴感染EV71后可引起手足口病皮膚皰疹性病變，但不能造成典型的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如弛緩性麻痹及共濟失調等[19]。

綜上所述，非人靈長類動物模型的組織親嗜性、病毒復制部位和臨床癥狀在不同靈長類動物之間存在明顯的不同，且由于道德和經(jīng)濟問題很難廣泛應用。

2　小鼠適應性模型

Wang等[10]將EV71臺灣臨床分離株EV71/4643分別經(jīng)顱內、靜脈、腹腔、口服感染2周齡以內和3～6周齡的BALB/c小鼠、C3H/HeN小鼠和ICR小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠對EV71的易感性呈年齡依賴性。同時，將EV71/4643毒株連續(xù)4次傳代建立小鼠適應毒株(EV71/MP4)，再通過口服感染7日齡小鼠致其后肢癱瘓，在脊髓和腦干處發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元消失和凋亡。該研究表明，EV71/MP4毒株具有強烈的嗜神經(jīng)性，能引起持續(xù)性感染，并誘發(fā)腦部炎癥和弛緩性麻痹。

Chua等[22]在新生BALB/c小鼠顱內接種第6代EV71/MP-26M毒株，分別經(jīng)肌內、顱內或腹腔感染1日齡和7日齡BALB/c小鼠，小鼠均出現(xiàn)四肢癱瘓，其中VP1突變(G145E)可增加EV71/ MP-26M在小鼠體內的毒力。

Ong等[23]將EV71/AY207648(B3亞型)毒株在1日齡ICR小鼠腦內數(shù)次傳代，該適應毒株可感染2周齡ICR小鼠，并通過外周運動神經(jīng)進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起腦膜炎。

Wang等[24]在小鼠骨骼肌4次傳代建立小鼠肌肉適應毒株(Fuyang-0805a)。該毒株具有嗜肌肉性，可誘發(fā)骨骼肌和心肌的重度壞死性肌炎，1日齡ICR小鼠腹腔感染后可引起腸炎。

為避免小鼠適應性毒株的嗜神經(jīng)性和嗜肌肉性等自然嗜性，Khong等[25]利用非適應毒株(臨床分離株EV71/5865/SIN/00009)經(jīng)腹腔和口服感染2周齡AG129小鼠〔α/β干擾素(interferon α/β，IFN-α/β)和IFN-γ受體缺陷小鼠〕，可引起神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。Yao等[26]將EV71臨床分離株(EV71/58301，C4亞型)經(jīng)腹腔感染21日齡長爪沙鼠，引起癱瘓、共濟失調等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。這兩種模型的臨床表現(xiàn)和組織病理學特點與Wang等[10]和Chua等[22]的小鼠適應模型相似。

目前尚未建立有效的成年小鼠模型。雖然在小鼠體內數(shù)次傳代分離的病毒可增加EV71臨床分離株的毒力，但小鼠適應性毒株并不能感染免疫力正常的非乳鼠小鼠。同時，小鼠適應性毒株具有明顯的嗜肌肉性，改變了EV71感染引起的神經(jīng)病變，并不能完全模擬人類感染的病理變化。

3　轉基因小鼠模型

2009年確定了兩種EV71人類受體：人類P-選擇素糖蛋白配體1(P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1；CD162)[27]和清道夫受體B2(scavenger receptor class B,member 2，SCARB2)[28]。PSGL-1是唾液黏蛋白的膜蛋白，僅在骨髓、白細胞和血小板中表達。SCARB2又稱為溶酶體完整膜蛋白Ⅱ，主要定位于溶酶體，廣泛表達于人體組織和細胞。

Liu等[29]建立人PSGL-1轉基因小鼠，但該模型只對小鼠肌肉適應性毒株FY0805/MP10易感，并不能感染EV71臨床分離毒株(C4亞型)。

Lin等[30]建立人SCARB2轉基因小鼠。EV71(B亞型)感染小鼠后產(chǎn)生手足口病樣癥狀，并引起1日齡小鼠癱瘓，但不能感染2周齡以上的小鼠。與野生型小鼠相比，該小鼠模型更易產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、肢體癱瘓和死亡，且年齡依賴性和病毒復制部位等感染特征與野生型小鼠相似。

Fujii等[31]用人的表達譜(如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元細胞、肺泡壁細胞、肝細胞和腸上皮細胞)建立人SCARB2轉基因小鼠。6周齡以上的小鼠仍對EV71臨床分離株易感。該模型的神經(jīng)病變和臨床特征(如共濟失調、癱瘓和死亡)與人類、靈長類動物及野生型小鼠類似。Arita等[32]在3周齡的非肥胖型糖尿病/嚴重聯(lián)合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency，NOD/SCID)轉基因小鼠腦中將病毒3次傳代獲得EV71(NOD/SCID)毒株。該毒株能使3～4周齡的NOD/SCID小鼠癱瘓。Caine等[33]在成年免疫缺陷小鼠A129(IFN-α/β受體缺陷小鼠)和AG129(IFN-α/β和IFN-γ受體缺陷小鼠)中建立EV71小鼠適應性毒株。該毒株可造成10周齡的AG129小鼠癱瘓，致死率達100%。Liao等[34]用EV71臨床分離株(EV71/F23)感染NOD/SCID小鼠和stat-1敲除小鼠，均能引起癱瘓、脾纖維化、肌肉溶解和死亡。在NOD/SCID小鼠中，EV71抗原VP1主要聚積在肌肉中；而在stat-1敲除小鼠中，則表現(xiàn)為嗜神經(jīng)性，EV71主要位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。EV71感染NOD/SCID小鼠后引起的細胞因子變化與人類相似，可用于研究EV71感染引起的炎癥變化。

PSGL-1是EV71受體，但神經(jīng)元細胞不表達PSGL-1，人PSGL-1轉基因小鼠模型僅可造成短暫的胃腸道感染，不能引起神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。人SCARB2轉基因小鼠對EV71易感，但該小鼠模型不能模擬人類的所有癥狀，且發(fā)病機制與人類有差異[10]。肺水腫是重癥EV71感染的標志，但轉基因與野生型小鼠模型均未能誘發(fā)肺水腫，從而限制了這些小鼠模型在EV71發(fā)病機制中的研究。

4　結語

現(xiàn)已建立的3類EV71感染動物模型在應用領域中各有側重。非人靈長類模型可用于研究EV71的系統(tǒng)性感染過程，加深人們對EV71感染途徑、臨床表現(xiàn)、病理學、病毒分布和免疫反應的了解。此外，靈長類模型更適用于評估EV71疫苗的免疫原性，并可用于檢測小鼠模型中不能獲得的疫苗指標。小鼠適應性模型對闡明EV71感染機制及研發(fā)疫苗、藥物起重要作用[35]。新生小鼠在天然免疫方面尚未成熟，并不能完全模擬人類感染的機制與特點，因此仍需進一步研發(fā)小鼠非適應性毒株可感染的成年小鼠模型。目前僅確定了兩種EV71受體，探尋所有EV71受體、共同受體及研發(fā)表達所有上述受體的轉基因小鼠也是一條可行之路。

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.ZHU Yongzhe,E-mail: zhuyongzhe1984@sina.com

Applications and limitations of animal models in enterovirus 71 infection

WU Yueming1,2,*， ZHU Naiwei1,*， ZHU Yongzhe1

1.Department of Microbiology，The Second Military Medical University,Shanghai 200433,China; 2.Student 5 Team,Department of Naval Medicine,The Second Military Medical University,Shanghai 200433,China

Enterovirus 71 (EV71) is a major pathogen of hand,foot and mouth disease which is known as a neglected tropical infectious disease.EV71 is responsible for several outbreaks in the Asia-Pacific Region over the past 15 years.Since the effective control of poliovirus,EV71 has been regarded as the most important neurotropic enterovirus and its severe neurological complications threaten the children’s health.Appropriate animal models of EV71 infection are essential to understand the neuropathology and to facilitate the development of effective vaccines and drugs.In this paper,we review the characteristics,applications and limitations of three major kinds of established animal models,including non-human primate models,mouse-adaptation models and transgenic mouse models.

Enterovirus 71; Animal model; Applications and limitations

第二軍醫(yī)大學創(chuàng)新能力培養(yǎng)計劃(FH2015146)

朱勇喆

*同為第一作者

2016-03-30)