王曲直，江淵，沈素芳，沈鑫，趙洪進，唐文紅，徐峰，楊顯超，劉佩紅

1.上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103； 2.上海市疾病預(yù)防控制中心，上海 200336

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·論著·

牛型純化蛋白衍生物皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗陽性牛中分枝桿菌的分離與鑒定

王曲直1，江淵2，沈素芳1，沈鑫2，趙洪進1，唐文紅1，徐峰1，楊顯超1，劉佩紅1

1.上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103； 2.上海市疾病預(yù)防控制中心，上海 200336

為評價牛分枝桿菌純化蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)單純頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(single intradermal cervical tuberculin，SICT)在奶牛結(jié)核病檢測中的特異性，采集54頭SICT陽性牛的118份組織樣品進行病原分離和鑒定。結(jié)果顯示，14頭SICT陽性牛樣品中分離到抗酸陽性菌，占SICT陽性?？倲?shù)的25.9%(14/54)。其中，10頭陽性牛樣品中分離到分枝桿菌，占18.5%(10/54)；1頭陽性牛樣品中分離到牛分枝桿菌，占1.9%(1/54)。從118份組織樣品中分離到16株抗酸陽性菌，其中12株為分枝桿菌，分枝桿菌分離率為10.2%(12/118)。12株分枝桿菌中，1株為牛分枝桿菌，其余11株為禽分枝桿菌、土地分枝桿菌等非結(jié)核分枝桿菌。牛分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌分別占分枝桿菌分離株的8.3%(1/12)和91.7%(11/12)。病原分離和鑒定結(jié)果表明，SICT陽性牛的牛分枝桿菌分離率較低，為確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，有必要采用其他檢測方法進行驗證。同時，可將分枝桿菌快速分離培養(yǎng)及菌種鑒定檢測技術(shù)引入對皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗陽性牛的實驗室診斷，進一步提高牛結(jié)核病檢測的特異性。

皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗；陽性牛；分枝桿菌

牛結(jié)核病是一種主要由牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis，M.bovis)引起的慢性消耗性人獸共患傳染病，對養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展、奶產(chǎn)品安全及人類健康有重大威脅[1]。中國是全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，2000年第4次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告顯示，全人口的結(jié)核分枝桿菌感染率為44.5%[2]。世界動物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties，OIE)推薦的牛結(jié)核病檢測方法有皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗、γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)試驗等[1]。目前，我國普遍采用牛分枝桿菌純化蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)進行單純頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(single intradermal cervical tuberculin，SICT)開展檢測，比較頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(single intradermal comparative cervical tuberculin,SICCT)和IFN-γ試驗也逐步用于確診。多年來，SICT在牛結(jié)核病的監(jiān)測中發(fā)揮了重要作用，但在實際工作中也出現(xiàn)假陽性率高、重復(fù)性差等問題。本研究對奶牛結(jié)核病監(jiān)測中的SICT陽性牛采集組織樣本進行病原分離和鑒定，以了解上海地區(qū)奶牛場分枝桿菌感染情況。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器

國產(chǎn)牛型PPD購自哈藥集團生物疫苗有限公司，進口牛型PPD和禽型PPD、BOVIGAM?牛結(jié)核分枝桿菌IFN-γ檢測試劑盒購自瑞士Prionics公司，BACTEC MGIT 960 System、MGIT 7 mL分枝桿菌生長指示管、MGIT TBc Identification Test(結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定試劑)、MGIT 960 SIRE 試劑盒、MGIT 960 PZA(吡嗪酰胺)藥敏培養(yǎng)管及PZA藥敏試劑盒購自美國BD公司，3130基因分析儀及相應(yīng)試劑購自美國Applied Biosystems公司，抗酸染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，中性羅氏培養(yǎng)基及對硝基苯甲酸(p-nitrobenzoic acid，PNB)、噻吩-2-羧酸酰肼(2-thiophenecarboxylic acid hydrazide，TCH)含藥培養(yǎng)基由上海市疾病預(yù)防控制中心培養(yǎng)基室提供。

1.2試驗用牛

在5個奶牛場開展試驗。這些奶牛場每年上、下半年各進行一次SICT全群監(jiān)測，對檢出的陽性牛進行撲殺和無害化處理。

1.3SICT和IFN-γ試驗

5個奶牛場均采用SICT進行全群檢測。對D奶牛場檢出的SICT陽性牛，在撲殺采樣前用SICCT和IFN-γ試驗進行復(fù)核檢測。SICT、SICCT和IFN-γ試驗按王曲直等的方法進行[3]。SICT采用國產(chǎn)牛型PPD，SICCT采用進口牛型PPD和進口禽型PPD。使用劑量為：國產(chǎn)牛型PPD 2 000 IU，進口牛型PPD 3 000 IU，進口禽型PPD 2 500 IU。SICT參照《動物結(jié)核病診斷技術(shù)(GB/T18645-2002)》進行操作和判定，SICCT參照OIE《陸生動物診斷試驗和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊》中牛結(jié)核病診斷方法進行操作和判定[1]。IFN-γ試驗采集試驗牛血液，按試劑盒說明書進行操作和判定。

1.4樣品采集

采用簡單隨機抽樣法，自SICT陽性牛無菌采集淋巴結(jié)、肺等組織樣品。

1.5病原菌分離和鑒定

按江淵等建立的快速檢測方法，采用MGIT 960液體培養(yǎng)法對樣品組織中分枝桿菌進行快速分離培養(yǎng)，采用免疫色譜法和基因測序進行快速基因分型及菌種鑒定[4]。針對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群內(nèi)不同菌種基因組中6個差異基因片段的存在和缺失不同，參照相關(guān)文獻進行引物合成和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種鑒定[5]。差異基因片段的擴增結(jié)果結(jié)合牛分枝桿菌對吡嗪酰胺天然耐藥而對其他抗結(jié)核藥物敏感，從而鑒定牛分枝桿菌。經(jīng)MGIT TBc Identification Test初篩鑒定為非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculousMycobacterium，NTM)的抗酸陽性菌，用16S rRNA基因序列分析進行菌種鑒定。

2　結(jié)果

2.1SICT結(jié)果

5個奶牛場總存欄量9 355頭，試驗歷時3年，共開展6次SICT全群監(jiān)測，共檢出SICT陽性牛223頭。

2.2SICCT和IFN-γ試驗結(jié)果

D奶牛場共檢出SICT陽性牛26頭，采用簡單隨機抽樣法抽取10頭SICT陽性牛，用SICCT和IFN-γ試驗復(fù)核檢測。10頭SICT陽性牛中，SICCT檢出陽性牛4頭，IFN-γ試驗檢出陽性牛1頭。結(jié)果見表1。

表1SICCT和IFN-γ檢測結(jié)果

Tab.1Results of SICCT and IFN-γ test

IFN-γPositiveNegativeTotalSICCTPositive044Negative156Total1910

2.3采樣情況

無菌隨機采集5個奶牛場54頭SICT陽性牛的淋巴結(jié)組織、肺組織、血液、乳汁等樣品共118份，每頭牛至少采集肺組織樣品或肺淋巴結(jié)組織樣品1份以上，具體樣本組成見表2。病理解剖均未見明顯肉眼觀病變。

表2不同組織的分枝桿菌分離率

Tab.2Isolation rate ofMycobacteriain different tissues

TissuenIsolatedstrainIsolationrate(%)Pulmonarylymphnode44511.4Lung20210.0Mesentericlymphnode10110.0Intestine200Axillarylymphnode200Spleen11100Wholeblood2700Milk12325.0Total1181210.2

2.4組織樣品分離培養(yǎng)結(jié)果

118份樣品經(jīng)前處理后，進行MGIT 960分離培養(yǎng)和中性羅氏分離培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性物經(jīng)涂片抗酸染色確認(rèn)為抗酸陽性菌的樣品共16份，來自4個奶牛場的14頭SICT陽性牛。16株抗酸陽性菌中，分枝桿菌共12株，來自10頭SICT陽性牛。16份抗酸陽性菌樣品經(jīng)MGIT TBc Identification Test初篩鑒定，有1株為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，來自1頭SICT陽性牛的肺淋巴結(jié)樣本。分枝桿菌MGIT液體培養(yǎng)陽性報告時間為17 d，轉(zhuǎn)種中性羅氏培養(yǎng)基，生長28 d后呈典型的象牙色、表面干燥、粗糙的菌落形態(tài)(圖1)。其余15株均為NTM或其他抗酸陽性菌，來自13頭SICT陽性牛。從不同組織的分枝桿菌分離率來看，牛奶和肺淋巴結(jié)的分離率較高，分別為25.0%和11.4%。未在血液中分離到分枝桿菌。因僅有1份脾臟組織，故未將其納入統(tǒng)計。不同組織的分枝桿菌分離率見表2。

圖1培養(yǎng)陽性的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群在羅氏培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)

Fig.1Colonial morphology ofMycobacteriumtuberculosiscomplex grown in L-J medium

2.5結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種鑒定結(jié)果

對經(jīng)MGIT TBc Identification Test初篩鑒定為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的1份樣品，進一步用基因分型結(jié)合藥敏試驗進行菌種鑒定。對一線抗結(jié)核藥物鏈霉素、異煙肼、利福平和乙胺丁醇全部敏感，PNB、TCH陰性，對吡嗪酰胺耐藥。根據(jù)以上結(jié)果，綜合判定該結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群為牛分枝桿菌。

2.6非結(jié)核分枝桿菌及其他抗酸陽性菌的菌種鑒定

15株抗酸陽性菌經(jīng)MGIT TBc Identification Test初篩鑒定為非結(jié)核分枝桿菌或其他抗酸陽性菌，經(jīng)基因測序分析，確認(rèn)非結(jié)核分枝桿菌11株、棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)1株、馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)3株。11株非結(jié)核分枝桿菌分別為禽分枝桿菌(M.avium)8株，土地分枝桿菌(M.terrace)1株，通俗分枝桿菌(M.triviale)1株，不產(chǎn)色分枝桿菌(M.nonchromogenicum)1株。菌種鑒定結(jié)果及樣品來源見表3。

表3菌種鑒定結(jié)果

Tab.3Identification results ofMycobacteriumstrains

DairyfarmCattleNo.TissueStrainidentification/SequencingresultSICTSICCTIFN-γA1PulmonarylymphnodeM.bovis+//2MilkM.triviale+//3MilkM.terrace+//4MilkM.avium+//B5LungM.avium+//6PulmonarylymphnodeM.avium+//7PulmonarylymphnodeActinomadura+//C8LungM.avium+//PulmonarylymphnodeM.avium+//9PulmonarylymphnodeM.avium+//D10SpleenM.nonchromogenicum+--11PulmonarylymphnodeM.avium++-12MesentericlymphnodeCorynebacteriumsp.++-AxillarylymphnodeActinomadura13PulmonarylymphnodeActinomadura++-14MesentericlymphnodeM.avium+-+

3　討論

參與試驗的奶牛場多年來堅持每年開展2次SICT全群監(jiān)測，對檢出的陽性牛進行撲殺和無害化處理，故結(jié)核病流行率處于較低水平。在5個奶牛場的54頭SICT陽性牛中，有4個奶牛場的14頭SICT陽性牛樣品中分離到抗酸陽性菌，占SICT陽性牛的25.9%(14/54)；其中10頭陽性牛樣品中分離到分枝桿菌，占SICT陽性牛的18.5%(10/54)；僅1頭陽性牛樣品中分離到牛分枝桿菌，占1.9%(1/54)，表明SICT陽性牛的牛分枝桿菌分離率較低。SICT是目前我國牛結(jié)核病檢測的常用方法，但一直受到檢測特異性問題的困擾。有研究采用SICT在1 867頭奶牛中檢出陽性牛22頭，對采集的陽性牛病料進行病原學(xué)檢測，未發(fā)現(xiàn)牛分枝桿菌[6]。結(jié)核病的細菌學(xué)檢查是發(fā)現(xiàn)病原的主要手段和途徑，但由于分枝桿菌生長緩慢，一般需4～8周，且操作繁瑣、檢出率低，在生產(chǎn)實際中不宜推廣應(yīng)用。本研究認(rèn)為，可將分枝桿菌快速分離培養(yǎng)及菌種鑒定檢測技術(shù)引入SICT陽性牛的實驗室診斷，進一步提高牛結(jié)核病檢測的特異性。

對D奶牛場抽取的10頭SICT陽性牛開展SICCT和IFN-γ試驗復(fù)核檢測，結(jié)果顯示5頭陽性牛樣品中分離到抗酸陽性菌，但SICT、SICCT與IFN-γ試驗結(jié)果不一致(表3)。通過本課題組前期對SICCT與IFN-γ試驗的比較，證實在結(jié)核病低流行地區(qū)SICCT與IFN-γ試驗符合率較低[3]。D奶牛場的檢測結(jié)果進一步證實了該結(jié)論。理論上，SICCT和IFN-γ試驗可排除禽型PPD反應(yīng)陽性牛，而通常認(rèn)為禽型PPD陽性是禽分枝桿菌等引發(fā)的非特異反應(yīng)。D奶牛場的5頭SICT陽性牛經(jīng)病原學(xué)檢測，均未分離到牛分枝桿菌，但2份樣品中分離到禽分枝桿菌。該結(jié)果提示，在結(jié)核病低流行地區(qū)或奶牛場，為確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，有必要采用一種以上檢測方法來驗證。現(xiàn)在應(yīng)用比較成熟的牛結(jié)核病檢測方法有IFN-γ試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)等，可作為皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗的補充，而這些試驗的主旨并非是診斷陽性牛個體，而是發(fā)現(xiàn)陽性牛群體，并采取相應(yīng)的處置方法。陽性牛個體確診應(yīng)平行使用免疫學(xué)試驗、病原學(xué)檢測等方法。一些成功消滅牛結(jié)核病的國家的經(jīng)驗提示，當(dāng)牛群結(jié)核病始終處于低流行時，在持續(xù)使用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗開展監(jiān)測的同時，應(yīng)重視對皮試陽性牛病原菌進行分離及對分離菌株從基因水平上進行分離和鑒定。

從54頭SICT陽性牛的解剖情況看，均未見結(jié)核病的典型病變。從不同組織的分枝桿菌分離率來看，牛奶和肺淋巴結(jié)的分離率分別是25.0%和11.4%，高于腸系膜淋巴結(jié)和肺組織。有研究發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者中約15%是飲用了結(jié)核病牛的奶而發(fā)病[7]。從本研究分離結(jié)果看，牛奶中雖未分離到牛分枝桿菌，但其分枝桿菌分離率最高，在12份現(xiàn)場采集的牛奶樣品中共分離到禽分枝桿菌、土地分枝桿菌和通俗分枝桿菌。由此可見，未經(jīng)消毒的牛奶被分枝桿菌污染的可能性較高，其食品安全和公共衛(wèi)生安全應(yīng)受到進一步關(guān)注。本研究從肺淋巴結(jié)分離到1株牛分枝桿菌。何昭陽等研究認(rèn)為，腸淋巴結(jié)的分枝桿菌分離率高于額下淋巴結(jié)，其次是肺門淋巴結(jié)，但其分離到的5株牛分枝桿菌有4株來自肺淋巴結(jié)、1株來自腸淋巴結(jié)[8]。本研究認(rèn)為，因牛結(jié)核分枝桿菌主要經(jīng)呼吸道感染，侵入機體后，被巨噬細胞吞噬或?qū)⑵鋷刖植苛馨徒Y(jié)形成原發(fā)性病灶[9]，故在采集組織樣品時應(yīng)重點關(guān)注肺淋巴結(jié)。

118份組織樣品中，16份分離到抗酸陽性菌，分離率為13.6%(16/118)；16份抗酸陽性菌樣品中，12份為分枝桿菌，分離率為10.2%(12/118)。在12株分枝桿菌中，牛分枝桿菌1株，占8.3%(1/12)；非結(jié)核分枝桿菌11株，占91.7%(11/12)。在11株非結(jié)核分枝桿菌中，8株為禽分枝桿菌，占72.7%(8/11)。從分枝桿菌分離和鑒定結(jié)果看，SICT無法區(qū)分牛分枝桿菌感染與非結(jié)核分枝桿菌感染。有研究者將牛源非結(jié)核分枝桿菌回歸動物實驗，用非結(jié)核分枝桿菌注射牛犢，再用牛型PPD進行變態(tài)反應(yīng)試驗，發(fā)現(xiàn)非結(jié)核分枝桿菌均表現(xiàn)出相互交叉的變態(tài)反應(yīng)陽性結(jié)果[10]。在自然環(huán)境和健康牛體內(nèi)中，非結(jié)核分枝桿菌的存在比較普遍。林世平等對牛鼻腔分泌物中的非結(jié)核分枝桿菌進行分離，分離率高達50.5%[11]。毛冉等在健康牛的頜下淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)中分離出非結(jié)核分枝桿菌[12]。一些研究者在SICT陽性牛的病原菌分離中發(fā)現(xiàn)，非結(jié)核分枝桿菌占分離株的81.5%[8]。據(jù)報道，從無病變的變態(tài)反應(yīng)陽性牛體內(nèi)分離比較多的非結(jié)核分枝桿菌主要有瘰癘分枝桿菌、鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群、偶發(fā)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、淺黃分枝桿菌等[13]。因非結(jié)核分枝桿菌在自然環(huán)境中分布廣泛，給結(jié)核病的準(zhǔn)確診斷和治療帶來了困難。近年來，世界各國醫(yī)療衛(wèi)生和動物臨床均有非結(jié)核分枝桿菌發(fā)病的報道，已成為醫(yī)學(xué)工作者的重要研究方向[14-17]。

除非結(jié)核分枝桿菌外，本研究還分離到1株棒狀桿菌與3株馬杜拉放線菌，抗酸染色均為陽性，但經(jīng)后續(xù)的免疫色譜法初篩和菌種鑒定，最終排除分枝桿菌感染。因棒狀桿菌和放線菌的胞壁多糖主要是阿拉伯糖和半乳糖，與分枝桿菌相似，故產(chǎn)生交叉反應(yīng)，從而影響SICT結(jié)果判定。這進一步提示，在采用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗開展奶牛結(jié)核病監(jiān)測和凈化工作時，應(yīng)警惕由非結(jié)核分枝桿菌和其他抗酸陽性菌引起的非特異性干擾。

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.LIU Peihong,E-mail:shdwfy@163.com

Isolation and identification ofMycobacteriumfrom cows with delayed type hypersensitivity response to bovine purified protein derivative

WANG Quzhi1,JIANG Yuan2,SHEN Sufang1,SHEN Xin2,ZHAO Hongjin1,TANG Wenhong1,XU Feng1,YANG Xianchao1,LIU Peihong1

1.Shanghai Animal Disease Control Center,Shanghai 201103,China; 2.Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention,Shanghai 200336,China

To evaluate the specificity of single intradermal cervical tuberculin (SICT) of bovine purified protein derivative (PPD) in bovine tuberculosis detection,a total of 118 tissue specimens from 54 cows with positive reaction were collected and subjected to the detection ofMycobacterium.Acid-fast bacteria strains were isolated from 14 cows andMycobacteriumstrains were isolated from 10 cows.Mycobacteriumbovis(M.bovis) was isolated from one cow.Sixteen acid-fast bacteria strains were isolated from 118 tissue samples and 12 strains were identified asMycobacterium.The isolation rate ofMycobacteriumwas 10.2% (12/118).One strain was identified asM.bovisand the others were nontuberculousMycobacteria(NTM),such asM.aviumandM.terrace.M.bovisaccounted for 8.3% (1/12) and NTM accounted for 91.7% (11/12) of allMycobacteriarespectively.The results of pathogen detection indicated a low isolation rate ofM.bovisby SICT method.To ensure the accuracy of SICT,it is necessary to use more than one method to verify the results.The culture and species identification by using rapid detection techniques are recommended to be introduced into the program for tuberculosis elimination,which could improve the specificity of tuberculosis detection.

Delayed type hypersensitivity skin test; Cow with positive reaction;Mycobacterium

上海市科技興農(nóng)推廣項目〔滬農(nóng)科推字(2010)第1-2號〕，上海市市級農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長計劃〔滬農(nóng)青字(2014)第2-13號〕

劉佩紅

2016-04-09)