張雨超，郝瑞棟，徐建青

1.溫州醫(yī)科大學(xué)，溫州 325014； 2.復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

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·綜述·

CRISPR/Cas9技術(shù)在感染性疾病中的應(yīng)用

張雨超1,2，郝瑞棟2，徐建青1,2

1.溫州醫(yī)科大學(xué)，溫州 325014； 2.復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9〔clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)，CRISPR/Cas9〕是一種新興的基因編輯技術(shù)，與以前的三大基因編輯技術(shù)——?dú)w巢核酸內(nèi)切酶、鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)相比，其在靶向特異性、操作簡便性、治療徹底性、應(yīng)用廣泛性等方面具有更大的優(yōu)勢和發(fā)展?jié)摿Α０滩?、乙型肝炎、瘧疾等感染性疾病的治療一直是醫(yī)學(xué)上的重大難題，科學(xué)家正努力嘗試?yán)肅RISPR/Cas9技術(shù)解決這些醫(yī)學(xué)難題。本文主要綜述了CRISPR/Cas9技術(shù)在這些感染性疾病中應(yīng)用的研究進(jìn)展。

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9；共價閉合環(huán)狀DNA；鋅指核酸酶；轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶；單導(dǎo)向RNA

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白9〔clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9(Cas9)，CRISPR/Cas9〕系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期進(jìn)化過程中形成的一種免疫防御機(jī)制，用來抵御噬菌體等外源DNA的入侵[1]。它可誘導(dǎo)靶基因組位點(diǎn)發(fā)生DNA雙鏈斷裂(double-strand break，DSB)以促進(jìn)基因組編輯。CRISPR 衍生RNA(CRISPR-derived RNA，crRNA)通過堿基配對與反式激活crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)結(jié)合形成RNA雙鏈，后者指導(dǎo)Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列的靶定位點(diǎn)切斷DNA雙鏈。在缺乏修復(fù)模板時，DSB通過非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)重新連接，導(dǎo)致插入/缺失(insertion-deletion，InDel)突變。

1　CRISPR/Cas的研究背景

大多數(shù)CRISPR/Cas系統(tǒng)存在一種最簡單且具有單一效應(yīng)的DNA核酸內(nèi)切酶——Cas9，它通過兩種小RNA(crRNA和tracrRNA)被引導(dǎo)至其病毒DNA靶位[1]。最初科學(xué)家將CRISPR/Cas系統(tǒng)應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞的DNA編輯，并從釀膿鏈球菌中獲取Cas9蛋白，證實(shí)釀膿鏈球菌Cas9蛋白在哺乳動物細(xì)胞中可通過tracrRNA和crRNA的融合轉(zhuǎn)錄指向DNA靶位，一經(jīng)結(jié)合，Cas9引起的DNA裂解會因NHEJ而易發(fā)生突變。

2　CRISPR/Cas的應(yīng)用

來源于微生物CRISPR適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的RNA引導(dǎo)的Cas9核酸內(nèi)切酶可促進(jìn)真核細(xì)胞的高效基因編輯。CRISPR/Cas9(特別是Cas9)在導(dǎo)向RNA(guide RNA，gRNA)的參與下，可識別和切割真核細(xì)胞中的靶基因組，然后通過同源指導(dǎo)或NHEJ修復(fù)靶基因。由于細(xì)胞在缺乏同源修復(fù)模板的情況下更傾向于NHEJ途徑，所以基因組雙鏈斷裂后，基因組通過NHEJ途徑發(fā)生插入/缺失突變。這種插入/缺失通常在基因開放讀碼框架的下游引入提前成熟的終止密碼子，導(dǎo)致目標(biāo)基因表達(dá)缺失。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)不僅應(yīng)用于真核細(xì)胞，還能在抗病毒感染中發(fā)揮重要作用。病毒通常先利用特異性受體感染細(xì)胞，然后其基因組經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、翻譯，完成生命循環(huán)，最終使病毒基因組(如某些DNA病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒)整合到細(xì)胞基因組中。利用這些靶基因組序列的可識別性，CRISPR/Cas9在治療頑固性和潛伏性病毒感染中可發(fā)揮作用。

CRISPR/Cas9還應(yīng)用于艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)治療。根據(jù)聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署(the Joint United Nations Programme on HIV/AIDS，UNAIDS)發(fā)布的2013年全球艾滋病報告，全世界超過3 500萬人感染人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)[2-3]，且并發(fā)癥、藥物濫用、不規(guī)范藥物治療和病毒變異等因素使AIDS的治療更加棘手。起初，高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy，HAART)的出現(xiàn)讓人們看到了治愈的曙光——堅(jiān)持這種治療方法的患者體內(nèi)病毒載量很低甚至檢測不到，CD4+T細(xì)胞群也接近正常。于是人們很自然地相信，只要繼續(xù)堅(jiān)持治療，最后一定會痊愈。然而沒過多久，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)這些患者體內(nèi)存在病毒潛伏感染細(xì)胞，它們只產(chǎn)生極微量的病毒蛋白，成功躲過了細(xì)胞殺傷作用和宿主免疫清除作用[2,4-5]。細(xì)胞中殘留的CD4+T細(xì)胞被認(rèn)為是最顯著的病毒潛伏感染細(xì)胞群。根據(jù)所涉終末器官的不同，中樞神經(jīng)系統(tǒng)、小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞都可能成為最主要的病毒生產(chǎn)源和儲存源[6-7]。一旦受到HAART刺激或治療中斷，就會使體內(nèi)殘留的CD4+記憶性T細(xì)胞群產(chǎn)生感染性病毒微粒，這是AIDS治愈的主要障礙。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的廣泛應(yīng)用，科學(xué)家設(shè)想通過靶定整合在宿主基因組特定位點(diǎn)的HIV序列，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對其進(jìn)行切除，以期實(shí)現(xiàn)治愈的目的。其中一個很重要的思路是通過靶定HIV-1前病毒基因組高度保守的5′和3′端長末端重復(fù)序列(long terminal repeat，LTR)及其中特異的順式作用元件，將病毒DNA序列從宿主基因組中移除[8-9]。這一過程遇到了許多阻礙——CRISPR/Cas9系統(tǒng)需設(shè)計出與靶切除位5′和3′端相同的gRNA；為減少脫靶的影響，這些序列不能與宿主基因組同源；HIV與許多人類內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒有相似序列[10-11]；存在HIV的高突變性、患者個體間和患者自身的變異性。

CCR5是HIV-1入侵人體的重要共同受體之一，而擁有CCR5Δ32 變種的個體不會感染HIV-1，這使CCR5成為控制HIV-1感染的重要靶點(diǎn)[12-13]。CRISPR/Cas9作為自然存在于原核生物中的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)組成部分，可用于哺乳動物細(xì)胞的基因編輯。CRISPR/Cas9可有效調(diào)節(jié)細(xì)胞系中CCR5位點(diǎn)的剪輯，使細(xì)胞表面的CCR5表達(dá)受抑制。后代基因測序表明，CCR5的預(yù)測斷裂位點(diǎn)出現(xiàn)了各種各樣的突變。在預(yù)測最可能發(fā)生脫靶的3個位點(diǎn)中，并沒有檢測到很明顯的脫靶現(xiàn)象。更重要的是，通過構(gòu)建攜帶CRISPR/Cas9的Ad5F35腺病毒，有效轉(zhuǎn)換了原始CD4+T細(xì)胞，破壞了CCR5表達(dá)，且正向轉(zhuǎn)換細(xì)胞對HIV-1產(chǎn)生抗性。這是有記載以來第一次在原始 CD4+T細(xì)胞中利用腺病毒CRISPR/Cas9對HIV-1產(chǎn)生抗性。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)可特異靶定并切割乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)基因組的保守位點(diǎn)，強(qiáng)力抑制其表達(dá)和復(fù)制。乙型肝炎很難治愈的關(guān)鍵在于HBV感染細(xì)胞中長期存在一種共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circle DNA，cccDNA)，它是HBV基因組和前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)復(fù)制的原始模板[14-15]。利用Cas9核酸內(nèi)切酶直接靶定cccDNA，使其發(fā)生DSB，可達(dá)到滅活cccDNA的效果而抗HBV感染。Ramanan等利用CRISPR在線設(shè)計工具獲得24種以HBV基因組為靶位的單導(dǎo)向RNA(single guide RNA，sgRNA)，通過靶定核心位點(diǎn)、聚合酶位點(diǎn)和X開放讀碼框架位點(diǎn)設(shè)計了一些sgRNA(包括sgRNA 13、sgRNA 14、sgRNA 15、sgRNA 16、sgRNA 17、sgRNA 18、sgRNA 19、sgRNA 21)。為評價這些sgRNA的效果，他們將HBV表達(dá)質(zhì)粒與HepG2肝癌細(xì)胞株、Cas9表達(dá)體和獨(dú)立gRNA共轉(zhuǎn)染，測定HBV 3.5 kb RNA(編碼pgRNA)與HBV表面抗原(HBV surface antigen，HBsAg)的表達(dá)量。結(jié)果表明，sgRNA 17和sgRNA 21能持續(xù)降低HBV中pgRNA水平并抑制HBsAg表達(dá)。此外，利用sgRNA 17/sgRNA 21復(fù)合體靶定HBV基因組，可產(chǎn)生更強(qiáng)的抑制效果[15]。

瘧疾是人類健康的另一重要?dú)⑹?，源于瘧原蟲感染。瘧原蟲“居住”在紅細(xì)胞內(nèi)，一段外源DNA必須穿過4層膜(紅細(xì)胞膜、空泡膜、瘧原蟲質(zhì)膜、瘧原蟲核膜)才能到達(dá)瘧原蟲細(xì)胞核。由于瘧原蟲特殊的生活習(xí)性，其基因組很少有編碼現(xiàn)象，且許多存在于真核細(xì)胞中的酶無法在寄生蟲體內(nèi)找到，故現(xiàn)有基因編輯技術(shù)很難成功應(yīng)用于這一蟲種。盡管目前已測出很多瘧原蟲基因組序列，但近一半的基因功能尚不明確[16]。很多基因編輯技術(shù)包括基因敲除、基因標(biāo)簽、等位置換等廣泛應(yīng)用于瘧原蟲基因功能的研究[17-19]，基本上都是利用同源重組技術(shù)，將一段含有藥物選擇性標(biāo)記的DNA插入靶基因或利用修飾的基因序列取代原有基因。但這些方法既耗時又低效，且需經(jīng)過長時間的藥物選擇和瘧原蟲克隆。另外，DNA插入或置換位點(diǎn)并不特異，易發(fā)生在一個隨機(jī)的同源區(qū)域。可喜的是，最近一種高效、位點(diǎn)特異的基因編輯技術(shù)——鋅指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)修飾技術(shù)可應(yīng)用于惡性瘧原蟲的基因研究[20-21]。但有限的靶位點(diǎn)及昂貴的價格限制了其廣泛應(yīng)用。另一種技術(shù)——轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)技術(shù)[22-23]雖已廣泛應(yīng)用于許多生物體的基因編輯，但尚未成功應(yīng)用于瘧原蟲。最近，科學(xué)家終于將CRISPR/Cas9技術(shù)成功應(yīng)用于瘧原蟲的基因編輯[24-28]。一般情況下，CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)瘧原蟲基因編輯需兩種成分的表達(dá)，即Cas9和靶定sgRNA。為降低構(gòu)建質(zhì)粒的大小及克服瘧原蟲可選標(biāo)記的有限性，科學(xué)家設(shè)計了一個包含hdhfr-2Apeptide-gfp基因的表達(dá)質(zhì)粒和瞬時表達(dá)hdhfr-2A-Flag-SpCas9融合基因的轉(zhuǎn)基因寄生蟲，并通過蛋白免疫印跡法證實(shí)了Cas9的表達(dá)。與其他基因編輯技術(shù)相比，Cas9/sgRNA具有獨(dú)特優(yōu)勢：Cas9/sgRNA的瞬時表達(dá)減少了對外源DNA和鄰近DNA的影響；CRISPR/Cas9系統(tǒng)允許多基因定點(diǎn)修飾，無需擔(dān)心藥物選擇性標(biāo)記不夠用。結(jié)果證明這一技術(shù)能在瘧原蟲基因組中引起定點(diǎn)DSB并被同源重組修復(fù)，且能在多重瘧原蟲基因中實(shí)現(xiàn)高效靶基因切除(100%)、信號導(dǎo)入(22%～45%)和等位置換(22%～45%)。這一現(xiàn)象標(biāo)志著一種高效、精確的瘧原蟲基因修飾方法的形成，也為后續(xù)研究瘧原蟲基因功能提供了重要思路。

3　結(jié)語

CRISPR/Cas9技術(shù)已應(yīng)用于AIDS、乙型肝炎、瘧疾等感染性疾病的治療研究，并顯示出巨大優(yōu)勢。盡管這一技術(shù)仍存在諸如脫靶、治療不徹底等問題，但隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，一定會在不久的將來為人類帶來更多的福音。

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.XU Jianqing,E-mail: xujianqing2014@126.com

The application of CRISPR/Cas9 technology in infectious diseases

ZHANG Yuchao1,2,HAO Ruidong2,XU Jianqing1,2

1.Wenzhou Medical University,Wenzhou 325014,China; 2.Shanghai Public Health Clinical Center Affiliated to Fudan University,Shanghai 201508,China

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)(CRISPR/Cas9) technology is a new gene editing technique.Compared with the previous gene editing techniques,such as homing endonuclease technology,zinc finger nuclease technology and transcription activator-like effector nuclease technology,it has greater advantages in target specificity,operation simplicity,treatment completeness and broad applications.Hepatitis B,acquired immunodeficiency syndrome (AIDS),malaria and other infectious diseases have been the major problems in clinic.Scientists are trying to use CRISPR/Cas9 technology to solve these medical problems.This article mainly summarizes the progress on CRISPR/Cas9 technology applied in infectious diseases.

Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9; Covalently closed circular DNA；Zinc finger nuclease；Transcription activator-like effector nuclease; Single guide RNA

上海市高等級生物安全病原微生物檢測專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺建設(shè)項(xiàng)目(15DZ2290200)

徐建青

2016-02-22)