薛愛娟，黃瑛

復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院消化科,上海 201102

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·綜述·

益生菌在炎癥性腸病中的治療作用

薛愛娟，黃瑛

復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院消化科,上海 201102

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)。隨著對腸道微生物群在IBD發(fā)病機制中作用的認識不斷深入，近年來益生菌廣泛應(yīng)用于IBD治療。大量臨床試驗結(jié)果表明，益生菌治療IBD的療效主要體現(xiàn)在對UC和貯袋炎的治療，對CD的療效不明確。益生菌治療IBD可能通過促進腸道微生物群平衡、改善腸道屏障功能、調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫及營養(yǎng)物質(zhì)代謝等途徑。

益生菌；炎癥性腸?。粷冃越Y(jié)腸炎；克羅恩病

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一組病因未明的慢性非特異性腸道炎性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)、克羅恩病(Crohn’s disease，CD)。IBD在我國的發(fā)病率呈逐年升高趨勢，探討其發(fā)病機制及尋找新的治療手段一直是該病研究領(lǐng)域的熱點。隨著對腸道微生物群在IBD發(fā)病機制中作用的認識不斷深入，目前IBD的治療在調(diào)整腸黏膜免疫的同時也開始關(guān)注應(yīng)用益生菌改善腸道功能?，F(xiàn)就益生菌在IBD中的治療作用進行綜述。

1　腸道微生物群

腸道微生物群是寄居于人體胃腸道的大量微生物群落的集合，包括細菌、真菌和病毒等。其中主要微生物群組包括革蘭陰性菌中的擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形桿菌門(Proteobacteria)，以及革蘭陽性菌中的放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicute)[1]。胃腸道各部位的pH值、蠕動及組織中的氧化還原能力等的不同使細菌在胃腸道中的分布各異：胃內(nèi)主要是少量需氧抗酸性細菌；空腸以需氧菌為主；回腸細菌較多，以厭氧菌為主；結(jié)腸內(nèi)細菌最多，厭氧菌占絕對優(yōu)勢[1]。在同一腸段，細菌按類別在空間上形成3個生物層[2]：由乳酸桿菌、雙歧桿菌等厭氧菌組成膜菌群，中層菌群為糞桿菌、消化鏈球菌、韋榮球菌和優(yōu)桿菌等厭氧菌，表層腔菌群主要由大腸埃希菌、腸球菌等需氧和兼性厭氧菌組成。這些細菌在生理范圍內(nèi)波動，構(gòu)成人體正常微生態(tài)環(huán)境，在人體營養(yǎng)吸收、物質(zhì)代謝及免疫防御等方面發(fā)揮重要作用。

2　益生菌

益生菌是指攝入一定數(shù)量，對宿主健康產(chǎn)生有益作用的活的微生物制劑。益生菌從發(fā)現(xiàn)到臨床應(yīng)用經(jīng)歷了多年的開發(fā)與探索，目前按菌株來源和作用方式，可分為原籍菌、共生菌和真菌[3]。原籍菌來源于人體腸道菌群，如雙歧桿菌、乳酸桿菌等；共生菌來源于人體腸道菌群外，與原籍菌共生并促進原籍菌生長、繁殖或直接發(fā)揮作用，如芽胞桿菌、酪酸梭菌、枯草芽胞桿菌等；真菌制劑主要為布拉酵母[3]。

3　益生菌對IBD的治療作用

盡管目前缺乏有力證據(jù)表明益生菌對IBD治療有效，但很多患者仍使用益生菌，關(guān)于益生菌對IBD治療作用的研究也不斷增多。根據(jù)現(xiàn)有臨床試驗結(jié)果，益生菌治療IBD的療效主要體現(xiàn)在對UC和貯袋炎的治療，對CD的療效不明確。

3.1益生菌對活動期UC的治療作用

根據(jù)活動性，UC分為活動期及緩解期?；顒悠赨C治療以盡快控制炎癥和緩解癥狀為目標。VSL#3是一種益生菌合劑，含有8種有益菌，包括干酪乳酸桿菌、植物乳酸桿菌、嗜乳酸桿菌、德氏乳酸桿菌保加利亞亞種4種乳酸桿菌屬，長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌3種雙歧桿菌屬，以及l(fā)種鏈球菌屬(唾液鏈球菌嗜熱亞種)[4]。既往研究表明，在標準治療基礎(chǔ)上添加VSL#3能增強美沙拉嗪的抗炎效果，延遲使用免疫調(diào)節(jié)劑的時間[4]。與安慰劑組相比，VSL#3組的UC疾病活動度指數(shù)下降50%所需時間更短(P<0.001)，臨床緩解率更高(P<0.001)。大腸埃希菌Nissle 1917(EscherichiacoliNissle 1917，EcN)也是常用于研究益生菌對UC療效的菌株。最近Petersen等[5]探究了在標準方案基礎(chǔ)上添加EcN對活動期UC的療效，結(jié)果表明EcN應(yīng)答率較低(EcN組緩解率為54%，安慰劑組緩解率為89%，P<0.05)。為探索益生菌對活動期兒童UC的療效，Oliva等[6]選擇了40例活動期遠端UC患兒(平均7.2歲)，比較羅伊乳酸桿菌(Lactobacillusreuteri)ATCC 55730與安慰劑的療效。結(jié)果顯示，添加羅伊乳酸桿菌ATCC 55730具有更好的抗炎效果：治療8周，益生菌組Mayo評分從8.6±0.8下降為3.2±1.3(P<0.01)，組織學(xué)評分從4.5±0.6下降為0.6±0.5(P<0.01)，白細胞介素10(interleukin 10，IL-10)表達水平增加(P<0.01)，且IL-1β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、IL-8水平降低(P<0.01)；而安慰劑組治療前后以上指標均無統(tǒng)計學(xué)差異。

3.2益生菌對緩解期UC的治療作用

緩解期UC治療以維持無激素緩解、預(yù)防復(fù)發(fā)為目標。多數(shù)研究表明，EcN和VSL#3對UC緩解期的療效與美沙拉嗪相當(dāng)，對疾病活動度指數(shù)、維持緩解時間及全面評估指標的影響與美沙拉嗪相比無統(tǒng)計學(xué)差異，但具有更好的經(jīng)濟效益及更少的不良反應(yīng)，可作為UC緩解期的替代治療[4]。Zocco等[7]研究表明，在美沙拉嗪基礎(chǔ)上添加鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillusrhamnosus)，UC維持緩解期更長(P<0.05)。Cui等[8]給30例使用柳氮磺胺吡啶和激素的患者添加BIFICO(雙歧桿菌)或安慰劑治療2個月，結(jié)果顯示BIFICO組復(fù)發(fā)率低(P<0.01)，核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)DNA結(jié)合活性降低(P<0.05)，抗炎細胞因子mRNA表達增加。Wildt等[9]分析比較了Probio-Tec AB-25(嗜酸乳酸桿菌和雙歧桿菌的混合制劑)與安慰劑用于32例緩解期UC患者52周后的療效，結(jié)果顯示兩者無統(tǒng)計學(xué)差異。最近，Yoshimatsu等[10]比較了Bio-Three(糞鏈球菌、丁酸梭菌和馬鈴薯芽胞桿菌合劑)與安慰劑預(yù)防緩解期UC復(fù)發(fā)的效果，結(jié)果表明兩者治療12個月的累積復(fù)發(fā)率無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.248)。他們根據(jù)患者糞便菌群分析結(jié)果，認為益生菌的療效與腸道群落構(gòu)成有關(guān)。

3.3益生菌對CD的治療作用

現(xiàn)有研究結(jié)果對益生菌在CD中的治療作用仍存在爭議。多數(shù)臨床試驗將益生菌用于緩解期CD患者。乳酸桿菌是常見的用于研究益生菌對CD療效的菌種，但鼠李糖乳酸桿菌和約氏乳酸桿菌對成人和兒童CD患者的療效均未顯示優(yōu)于安慰劑[11]。法國一項多中心雙盲研究比較了單獨使用布拉酵母與安慰劑治療緩解期CD的效果，結(jié)果表明布拉酵母具有良好的安全性和耐受性，但療效與安慰劑相當(dāng)[12]。另一項研究讓32例緩解期CD患者隨機接受美沙拉嗪3 g/d或美沙拉嗪 2 g/d+酵母治療，結(jié)果顯示聯(lián)合酵母治療組的臨床復(fù)發(fā)率減少(P=0.04)[13]。這兩項研究結(jié)果相互補充，表明單獨使用酵母并不能有效預(yù)防CD復(fù)發(fā)，但在美沙拉嗪標準治療基礎(chǔ)上添加布拉酵母可促進臨床緩解。

3.4益生菌對貯袋炎的治療作用

貯袋炎是難治性UC經(jīng)全結(jié)腸直腸切除、回腸貯袋肛門吻合術(shù)后(ileal pouch-anal anastomosis，IPAA)發(fā)生的炎癥。益生菌治療IBD療效最有說服力的資料是其可預(yù)防貯袋炎的發(fā)生。對于抗生素治療后的貯袋炎，一項研究表明VSL#3治療9個月的維持緩解率為85%，而安慰劑組全部復(fù)發(fā)；另一項研究也表明VSL#3治療12個月的維持緩解率為85%，而安慰劑組僅為6%(P<0.000 1)[11]。Persborn等研究了生態(tài)825(Ecologic 825，9種益生菌合劑)對貯袋炎患者黏膜屏障功能的影響，結(jié)果表明益生菌可改善貯袋炎疾病活動度指數(shù)，且使大腸埃希菌K12減少[14]。

4　益生菌治療IBD的機制

益生菌在IBD治療中的作用機制尚未完全明確，目前研究表明益生菌可能通過以下途徑發(fā)揮治療作用。①促進腸道菌群平衡：近年來亞洲IBD的發(fā)病率逐年上升，與飲食結(jié)構(gòu)、生活方式、抗生素應(yīng)用及衛(wèi)生條件等相關(guān)，而這些因素均可影響腸道微生物群落的構(gòu)成及功能[15]。益生菌在腸道內(nèi)定植可促進有益菌群生長，并通過降低腸道pH值、受體競爭、營養(yǎng)競爭、分泌抗菌物質(zhì)、刺激分泌型免疫球蛋白A產(chǎn)生、刺激Th17細胞和調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)分化和活化，以及促進IL-1β、IL-22和抗菌肽(α防御素、REGⅢγ)釋放等直接或間接方式抑制致病菌的黏附和繁殖[16-17]。②改善腸道屏障功能：益生菌可增強腸道微生物屏障，促使腸上皮細胞分泌黏蛋白及三葉肽家族、加速損傷腸黏膜修復(fù)[18]、阻斷促炎性細胞因子及調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達等機制抑制病原菌引起的腸上皮細胞凋亡，從而保護腸黏膜上皮屏障[19]；益生菌能通過調(diào)整防御素水平改善腸道黏膜通透性，某些益生菌(如VSL#3)可通過p38-絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)信號通路提高緊密連接蛋白(閉合蛋白、ZO-1)的表達量以加固腸黏膜物理屏障[19-20]。布拉酵母可抑制T細胞向非炎癥腸段浸潤，通過抑制NF-κB活性，減少炎性細胞因子表達，降低CD患者腸道的通透性[11]。EcN能抑制髓過氧化物酶活性，降低 TNF-α、γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)及IL-10水平，減少腸黏膜損傷，降低腸上皮通透性并促進腸上皮組織修復(fù)[4]。③調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫功能：益生菌可通過提高食物能量產(chǎn)出維持整體免疫功能水平[21]，并激活天然免疫，誘導(dǎo)局部黏膜免疫，與腸上皮細胞和腸道免疫細胞相互作用，通過多種信號通路如Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)、NF-κB等調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，降低TNF-α、IL-8等促炎細胞因子產(chǎn)生，促進IL-10等抗炎細胞因子分泌，從而減輕炎癥反應(yīng)[22-23]。VSL#3能促進IL-12水平下調(diào)，減少腸上皮細胞凋亡，下調(diào)T細胞、B細胞及TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少Th1轉(zhuǎn)錄因子(TNF-α及其誘導(dǎo)的細胞因子)表達，并減弱腸道促炎細胞因子(IL-6、TNF-α、IFN-γ等)表達，從而減少腸道中性粒細胞浸潤[20]。④營養(yǎng)物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)：益生菌能降解腸道內(nèi)某些抗原物質(zhì)，從而下調(diào)人體免疫系統(tǒng)對腸道內(nèi)抗原的高反應(yīng)性。益生菌降解膳食纖維后發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(short chain fatty acid，SCFA)能為結(jié)腸上皮合成提供能量，其中丁酸鹽可抑制NF-κB活化減少炎癥反應(yīng)。益生菌還可通過代謝產(chǎn)生的中鏈脂肪酸(medium chain fatty acid，MCFA)活化過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)受體抑制炎癥反應(yīng)[24]。

5　結(jié)語

益生菌作為IBD的非化療輔助治療方式很有前景，但目前還缺乏多中心、大樣本、隨機、雙盲、對照臨床試驗確證其療效，在臨床上應(yīng)用仍存在一些問題需解決[25-27]。①目前尚無益生菌制劑的藥代動力學(xué)系統(tǒng)描述，無法明確其在腸道發(fā)揮作用的有效劑量和定植所需劑量。②不同益生菌的作用機制不一致，使選擇敏感的特異性菌株愈加復(fù)雜。③大多數(shù)益生菌不能與抗生素合用，限制其臨床應(yīng)用；即使能與抗生素合用，活菌也可能產(chǎn)生耐藥性。④針對免疫缺陷或抑制患者缺乏使用經(jīng)驗，其安全性尚無確切結(jié)論。⑤潛在的風(fēng)險：細菌移位、敗血癥、微生物突變或由于細菌介入帶來的代謝活性變化、免疫功能改變，包括抗生素耐藥基因在內(nèi)的遺傳物質(zhì)傳播。解決這些問題需微生態(tài)、藥學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域相互滲透，全面了解益生菌在腸道內(nèi)，尤其是在炎癥腸道內(nèi)的生物學(xué)行為和特性，這樣才能指導(dǎo)臨床配伍益生菌株及選擇時機、劑量、療程等。

[1]Jandhyala SM,Talukdar R,Subramanyam C,Vuyyuru H,Sasikala M,Nageshwar Reddy D.Role of the normal gut microbiota [J].World J Gastroenterol,2015,21(29): 8787-8803.

[2]Lavelle A,Lennon G,O′Sullivan O,Docherty N,Balfe A,Maguire A,Mulcahy HE,Doherty G,O′Donoghue D,Hyland J,Ross RP,Coffey JC,Sheahan K,Cotter PD,Shanahan F,Winter DC,O′Connell PR.Spatial variation of the colonic microbiota in patients with ulcerative colitis and control volunteers [J].Gut,2015,64(10): 1553-1561.

[3]鄭躍杰，黃志華，劉作義，王文建，程茜.微生態(tài)制劑兒科應(yīng)用專家共識(2010年10月) [J].中國實用兒科雜志，2011(1)：20-23.

[4]Chibbar R,Dieleman LA.Probiotics in the management of ulcerative colitis [J].J Clin Gastroenterol,2015,49(Suppl 1): S50-S55.

[5]Petersen AM,Mirsepasi H,Halkjaer SI,Mortensen EM,Nordgaard-Lassen I,Krogfelt KA.Ciprofloxacin and probiotic Escherichia coli Nissle add-on treatment in active ulcerative colitis: a double-blind randomized placebo controlled clinical trial [J].J Crohns Colitis,2014,8(11): 1498-1505.

[6]Oliva S,Di Nardo G,Ferrari F,Mallardo S,Rossi P,Patrizi G,Cucchiara S,Stronati L.Randomised clinical trial: the effectiveness of Lactobacillus reuteri ATCC 55730 rectal enema in children with active distal ulcerative colitis [J].Aliment Pharmacol Ther,2012,35(3): 327-334.

[7]Zocco MA,dal Verme LZ,Cremonini F,Piscaglia AC,Nista EC,Candelli M,Novi M,Rigante D,Cazzato IA,Ojetti V,Armuzzi A,Gasbarrini G,Gasbarrini A.Efficacy of Lactobacillus GG in maintaining remission of ulcerative colitis [J].Aliment Pharmacol Ther,2006,23(11): 1567-1574.

[8]Cui HH,Chen CL,Wang JD,Yang YJ,Cun Y,Wu JB,Liu YH,Dan HL,Jian YT,Chen XQ.Effects of probiotic on intestinal mucosa of patients with ulcerative colitis [J].World J Gastroenterol,2004,10(10): 1521-1525.

[9]Wildt S,Nordgaard I,Hansen U,Brockmann E,Rumessen JJ.A randomised double-blind placebo-controlled trial with Lactobacillus acidophilus La-5 and Bifidobacterium animalis subsp lactis BB-12 for maintenance of remission in ulcerative colitis [J].J Crohns Colitis,2011,5(2): 115-121.

[10]Yoshimatsu Y,Yamada A,Furukawa R,Sono K,Osamura A,Nakamura K,Aoki H,Tsuda Y,Hosoe N,Takada N,Suzuki Y.Effectiveness of probiotic therapy for the prevention of relapse in patients with inactive ulcerative colitis [J].World J Gastroenterol,2015,21(19): 5985-5994.

[11]Guslandi M.Role of probiotics in Crohn′s disease and in pouchitis [J].J Clin Gastroenterol,2015,49(Suppl 1): S46-S49.

[12]Bourreille A,Cadiot G,Le Dreau G,Laharie D,Beaugerie L,Dupas JL,Marteau P,Rampal P,Moyse D,Saleh A,Le Guern ME,Galmiche JP; FLORABEST Study Group.Saccharomyces boulardii does not prevent relapse of Crohn′s disease [J].Clin Gastroenterol Hepatol,2013,11(8): 982-987.

[13]Guslandi M,Mezzi G,Sorghi M,Testoni PA.Saccharomyces boulardii in maintenance treatment of Crohn′s disease [J].Dig Dis Sci,2000,45(7): 1462-1464.

[14]Persborn M,Gerritsen J,Wallon C,Carlsson A,Akkermans LM,S?derholm JD.The effects of probiotics on barrier function and mucosal pouch microbiota during maintenance treatment for severe pouchitis in patients with ulcerative colitis [J].Aliment Pharmacol Ther,2013,38(7): 772-783.

[15]Ng SC,Tang W,Leong RW,Chen M,Ko Y,Studd C,Niewiadomski O,Bell S,Kamm MA,de Silva HJ,Kasturiratne A,Senanayake YU,Ooi CJ,Ling KL,Ong D,Goh KL,Hilmi I,Ouyang Q,Wang YF,Hu P,Zhu Z,Zeng Z,Wu K,Wang X,Xia B,Li J,Pisespongsa P,Manatsathit S,Aniwan S,Simadibrata M,Abdullah M,Tsang SW,Wong TC,Hui AJ,Chow CM,Yu HH,Li MF,Ng KK,Ching J,Wu JC,Chan FK,Sung JJ; Asia-Pacific Crohn′s and Colitis Epidemiology Study (ACCESS) Group.Environmental risk factors in inflammatory bowel disease: a population-based case-control study in Asia-Pacific [J].Gut,2015,64(7):1063-1071.

[16]Sassone-Corsi M,Raffatellu M.No vacancy: how beneficial microbes cooperate with immunity to provide colonization resistance to pathogens [J].J Immunol,2015,194(9): 4081-4087.

[17]Fukuda S,Toh H,Hase K,Oshima KA,Yoshimura K,Tobe T,Clarke JM,Topping DL,Suzuki T,Taylor TD,Kikuchi J,Morita H,Hattori M,Ohno H.Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate [J].Nature,2011,469(7331): 543-547.

[18]Everard A,Belzer C,Geurts L,Ouwerkerk JP,Druart C,Bindels LB,Guiot Y,Derrien M,Muccioli GG,Delzenne NM,de Vos WM,Cani PD.Cross-talk between Akkermansia muciniphila and intestinal epithelium controls diet-induced obesity [J].Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(22): 9066-9071.

[19]Zhou YK,Qin HL,Zhang M,Shen TY,Ma YL,Chu ZX,Zhang P,Liu ZH.Effects of Lactobacillus plantarum on gut barrier function in experimental obstructive jaundice [J].World J Gastroenterol,2012,18(30): 3977-3991.

[20]Dai C,Zhao DH,Jiang M.VSL#3 probiotics regulate the intestinal epithelial barrier in vivo and in vitro via the p38 and ERK signaling pathways [J].Int J Mol Med,2012,29(2): 202-208.

[21]Kuo SM.The interplay between fiber and the intestinal microbiome in the inflammatory response [J].Adv Nutr,2013,4(1): 16-28.

[22]de Kivit S,Tobin MC,Forsyth CB,Landay AL.Regulation of intestinal immune responses through TLR activation: implications for pro- and prebiotics [J/OL].Front Immunol,2014.http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fimmu.2014.00060/full.

[23]Mann ER,Li X.Intestinal antigen-presenting cells in mucosal immune homeostasis: crosstalk between dendritic cells,macrophages and B-cells [J].World J Gastroenterol,2014,20(29): 9653-9664.

[24]de Preter V,Machiels K,Joossens M,Arijs I,Matthys C,Vermeire S,Rutgeerts P,Verbeke K.Faecal metabolite profiling identifies medium-chain fatty acids as discriminating compounds in IBD [J].Gut,2015,64(3): 447-458.

[25]熊德鑫.腸道微生態(tài)制劑與消化道疾病的防治 [M].北京：科學(xué)出版社，2008.

[26]Saez-Lara MJ,Gomez-Llorente C,Plaza-Diaz J,Gil A.The role of probiotic lactic acid bacteria and bifidobacteria in the prevention and treatment of inflammatory bowel disease and other related diseases: a systematic review of randomized human clinical trials [J/OL].Biomed Res Int,2015.http://www.hindawi.com/journals/bmri/2015/505878.

[27]Cruchet S,Furnes R,Maruy A,Hebel E,Palacios J,Medina F,Ramirez N,Orsi M,Rondon L,Sdepanian V,Xóchihua L,Ybarra M,Zablah RA.The use of probiotics in pediatric gastroenterology: a review of the literature and recommendations by Latin-American experts [J].Pediatric Drugs,2015,17(3): 199-216.

.HUANG Ying,E-mail: yhuang815@163.com

Role of probiotics in inflammatory bowel disease

XUE Aijuan,HUANG Ying

Children’s Hospital of Fudan University,Shanghai 201102,China

Inflammatory bowel disease (IBD) mainly consists of Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC).Rapid progress has been made to understand the interaction between the gut microbiota and IBD,which provides the rationale for administering probiotic agents in the medical treatments of IBD.It is now widely accepted that probiotic therapy is a helpful option for UC and pouchitis,but stays controversial for CD.Probiotics help to alter the gut dysbiosis,improve the function of mucosal barrier,stimulate the development of innate and adaptive immunity and modulate bacterial metabolites.Although probiotics have shown promise in the treatment of IBD,further controlled studies,enrolling larger numbers of patients,are needed to identify the therapeutic role of probiotics.

Probiotics; Inflammatory bowel disease; Ulcerative colitis; Crohn’s disease

黃瑛

2016-03-07)