汪金麗，沈 兵，范一菲，唐志強(qiáng)，程文慧，鐘明奎

NaHS對(duì)慢性間歇性低氧大鼠胸主動(dòng)脈血管張力的影響

汪金麗，沈 兵，范一菲，唐志強(qiáng)，程文慧，鐘明奎

目的研究硫氫化鈉（NaHS）對(duì)慢性間歇性低氧（CIH）大鼠離體胸主動(dòng)脈血管張力的影響。方法將雄性SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照（Sham）組和慢性間歇性低氧（CIH）組，用無創(chuàng)套尾法測(cè)大鼠的尾動(dòng)脈收縮壓（SBP），用離體血管張力實(shí)驗(yàn)觀察NaHS對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈血管張力的影響。結(jié)果與Sham組相比，在苯腎上腺素（Phe）預(yù)收縮的大鼠胸主動(dòng)脈中，CIH組乙酰膽堿（ACh）引起的舒張作用顯著減弱（P＜0.01）。Sham組在累積濃度NaHS為50～100μmol/ L時(shí)引起血管收縮，NaHS為300～1 000μmol/L時(shí)引起血管舒張；CIH組在累積濃度NaHS為50～300μmol/L時(shí)引起血管收縮，500～1 000μmol/L時(shí)引起血管舒張。與Sham組（100μmol/L）相比，CIH組（300μmol/L）低濃度NaHS引起的血管收縮作用顯著增加（P＜0.01）；與Sham組（1 000 μmol/L）相比，CIH組（1 000μmol/L）高濃度NaHS引起的血管舒張作用顯著減弱（P＜0.01）。結(jié)論在Phe預(yù)收縮的大鼠胸主動(dòng)脈中，累積濃度的NaHS在Sham組和CIH組均可引起雙向作用，即在低濃度時(shí)產(chǎn)生血管收縮，高濃度時(shí)產(chǎn)生血管舒張，兩組之間差異有顯著性（P＜0.01）；同時(shí)CIH可使大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能下降，其機(jī)制可能與血管對(duì)硫化氫的反應(yīng)異常有關(guān)。

慢性間歇性低氧；硫化氫；高血壓；血管內(nèi)皮功能障礙

阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）被認(rèn)為是高血壓和心血管疾病中獨(dú)立的危險(xiǎn)因素［1］，慢性間歇性低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）和睡眠中斷在OSA綜合征患者中被認(rèn)為是重要的損傷機(jī)制。H2S已被認(rèn)為是包括人在內(nèi)的哺乳類動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)的氣體遞質(zhì)［2］，并成為繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后第三種新型內(nèi)源性氣體信號(hào)分子［3］。H2S作為一種內(nèi)源性舒張因子，能夠擴(kuò)展血管，抑制平滑肌細(xì)胞增殖，在心血管系統(tǒng)尤其是高血壓形成中發(fā)揮了重要的作用。該研究旨在討論H2S對(duì)CIH大鼠血管張力的影響與可能機(jī)制，為臨床研發(fā)防治高血壓疾病的新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物 成年SD雄性大鼠，200～250 g，SPF級(jí)，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物提前進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，保持室內(nèi)通風(fēng)，溫度和濕度適宜，飲水?dāng)z食充足。

1.1.2藥品與儀器 BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購自四川成都泰盟科技有限公司；苯腎上腺素（phenylephrine，Phe）、乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）均購自美國(guó)Sigma公司；硫氫化鈉（NaHS）購自上海Aladdin公司；藥品均用蒸餾水配制；克氏液（K-H）液（mmol/L）：NaCl 118、CaCl22.5、KCl 4.7、KH2PO41.2、MgSO4·7H2O 1.2、NaHCO325.2、葡萄糖11.1；高鉀溶液（mmol/L）：NaCl 58、CaCl22.5、KCl 60、KH2PO41.2、MgSO4·7H2O 1.2、NaHCO325.2、葡萄糖11.1。

1.2 方法

1.2.1CIH模型的制備 SD大鼠在進(jìn)行1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機(jī)分成CIH組和Sham組，CIH組進(jìn)行間歇性低氧處理，其余與Sham組相同處理。將CIH組大鼠放入低氧艙內(nèi)，低氧艙內(nèi)進(jìn)行先后循環(huán)充入氮?dú)夂脱鯕?，時(shí)間分別為4 min和5 min，一個(gè)循環(huán)設(shè)定為9 min，通過氧探頭測(cè)出低氧艙內(nèi)的氧氣濃度，調(diào)節(jié)氣體流量和充氣時(shí)間使低氧艙內(nèi)氧氣濃度每一循環(huán)不低于6%，持續(xù)40 s之后再循序漸進(jìn)使氧濃度升高最大值不超過21%。每天從早上9點(diǎn)到下午5點(diǎn)重復(fù)該循環(huán)8 h，一共重復(fù)15 d，由定時(shí)電磁轉(zhuǎn)換器設(shè)定低氧艙內(nèi)的充氮?dú)夂统溲鯕獾霓D(zhuǎn)換時(shí)間。無創(chuàng)套尾法測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠尾動(dòng)脈收縮壓≥160 mmHg，視為造模成功。

1.2.2血管環(huán)的制備 SD大鼠用過量CO2窒息法處死，迅速取出胸主動(dòng)脈，置于4℃K-H液的培養(yǎng)皿中并通上混合氧氣（95%O2+5%CO2）保持pH在（7.40±0.05），然后剔除血管周圍的脂肪組織并剪成3 mm的血管環(huán)，對(duì)于要去除內(nèi)皮的血管，用細(xì)鋼絲插入血管腔中輕輕來回摩擦。

1.2.3離體血管張力實(shí)驗(yàn) 將分離好的血管環(huán)懸掛于張力換能器上，然后置于含有5ml的K-H液浴槽內(nèi)，持續(xù)通入95%O2和5%CO2混合氣體；調(diào)節(jié)張力換能器并給予1 g的基礎(chǔ)張力，運(yùn)用BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄張力。血管在K-H液中平衡45 min，張力基線達(dá)到穩(wěn)定值后加入60 mmol/L的高鉀溶液進(jìn)行兩次預(yù)收縮，每次10 min，達(dá)峰值后用K-H液洗3 min×3次，之后再休息20 min。用1 μmol/L ACh檢測(cè)血管舒張功能，舒張大于80%視為內(nèi)皮完整，舒張小于10%視為去內(nèi)皮成功。用1 μmol/L Phe進(jìn)行預(yù)收縮，收縮達(dá)平臺(tái)期后加入累積濃度（50～1 000μmol/L）的H2S供體NaHS記錄胸主動(dòng)脈張力的變化。以Phe預(yù)收縮的最大幅度為100%，即以加入0μmol/L NaHS作為基礎(chǔ)值100%，計(jì)算給藥后各劑量的幅度變化占最大收縮幅度的百分?jǐn)?shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件分析，數(shù)據(jù)以s表示，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 CIH對(duì)ACh引起的大鼠胸主動(dòng)脈舒張功能的影響與Sham組［（88.63±2.92）%］相比，CIH組［（43.82±7.00）%］大鼠（n=6）ACh在Phe預(yù)收縮的胸主動(dòng)脈中引起的舒張作用顯著減弱（t= 5.903，P＜0.01）。

2.2 NaHS對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈血管張力的影響在Phe預(yù)收縮的大鼠胸主動(dòng)脈中，Sham組在累積濃度NaHS為50～100μmol/L時(shí)產(chǎn)生血管收縮，NaHS為300～1 000μmol/L時(shí)產(chǎn)生血管舒張；CIH組在累積濃度NaHS為50～300μmol/L時(shí)產(chǎn)生血管收縮，NaHS為500～1 000μmol/L時(shí)產(chǎn)生血管舒張。因此累積濃度NaHS在Sham組和CIH組均可引起雙向作用，即在低濃度時(shí)產(chǎn)生血管收縮，高濃度時(shí)產(chǎn)生血管舒張，但兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 26.832，P＜0.01），見表1。與Sham組（100μmol/ L）相比，CIH組（300μmol/L）低濃度NaHS引起的血管收縮作用顯著增加（t=-3.928，P＜0.01），見圖1A；與Sham組（1 000μmol/L）相比，CIH組（1 000μmol/L）高濃度NaHS引起的血管舒張作用顯著減弱（t=-4.879，P＜0.01），見圖1B。3 討論

OSA是高血壓發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，為難治性高血壓的主要原因之一。OSA的特點(diǎn)是睡眠時(shí)反復(fù)發(fā)作的部分或完全的上氣道阻塞，從而產(chǎn)生CIH，CIH被認(rèn)為是OSA引起高血壓的主要原因，但具體機(jī)制還不十分清楚。CIH可產(chǎn)生氧化應(yīng)激、炎癥和交感神經(jīng)過度激活，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙與高血壓。然而，對(duì)OSA患者的研究得出的結(jié)論往往不一致，因?yàn)镺SA患者除CIH外，還經(jīng)常出現(xiàn)其他合并癥（肥胖和代謝的改變），這是混雜因素也增加心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。因此，運(yùn)用CIH動(dòng)物模型模擬OSA缺氧復(fù)氧循環(huán)，是研究OSA引起心血管疾病機(jī)制的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究中所使用的CIH大鼠模型采用的是常壓間歇性缺氧的方式，低氧程度比較嚴(yán)重，最低氧濃度可降至6%，低氧頻率為6～7次/h，更接近于OSA病理生理特點(diǎn)，連續(xù)造模15 d后，可引起大鼠血壓增高及交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)［4］。

本研究顯示，在CIH大鼠ACh引起的胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張作用顯著減弱，提示CIH可引起血管內(nèi)皮功能受損。臨床研究［5］顯示，OSA患者在產(chǎn)生高血壓前，就出現(xiàn)頸動(dòng)脈內(nèi)、中膜厚度增加，且在合并有代謝性疾病患者中更加顯著；在OSA患者血流和ACh介導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能下降，應(yīng)用持續(xù)氣道正壓通氣（CPAP）治療后可顯著改善血管重塑和內(nèi)皮功能紊亂［6］。Krause et al［7］發(fā)現(xiàn)，大鼠CIH暴露21 d后，頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度沒有改變但內(nèi)徑減小，在離體的頸動(dòng)脈，高鉀引起的收縮作用增強(qiáng)，而ACh誘發(fā)的舒張作用減弱。這些研究均支持與本研究的結(jié)果。

H2S作為一種氣體信號(hào)分子在調(diào)節(jié)心血管功能方面發(fā)揮了重要的作用，其供體NaHS在兩腎一夾高血壓大鼠中表現(xiàn)出來明顯的降壓效果［8］。有研究［9-10］表明，H2S在人的乳內(nèi)動(dòng)脈和大鼠的胃部動(dòng)脈的離體血管中能夠引起收縮和舒張效應(yīng)，這主要依賴于H2S的濃度劑量。NaHS作為H2S供體能夠在水溶液中迅速產(chǎn)生H2S，在生理溶液中NaHS游離成Na+和HS-，然后與H+反應(yīng)生成H2S，其中三分之一的NaHS以H2S形式存在，三分之二以HS-形式存在，因此H2S被廣泛的作為一種外源性H2S的來源。本研究顯示，在Phe預(yù)收縮的大鼠胸主動(dòng)脈中，累積濃度的NaHS在Sham組和CIH組均可引起雙向作用，即在低濃度時(shí)產(chǎn)生血管收縮，高濃度時(shí)產(chǎn)生血管舒張，但兩組之間有顯著性差異。Sham組在累積濃度NaHS為50～100μmol/L時(shí)產(chǎn)生血管收縮，NaHS為300～1 000μmol/L時(shí)產(chǎn)生血管舒張；CIH組在NaHS為50～300μmol/L時(shí)產(chǎn)生血管收縮，NaHS為500～1 000μmol/L時(shí)產(chǎn)生血管舒張。與Sham組（100μmol/L）相比，CIH組（300 μmol/L）低濃度NaHS引起的最大收縮作用顯著增加；與Sham組（1 000μmol/L）相比，CIH組（1 000 μmol/L）高濃度NaHS引起的舒張作用顯著減弱。提示，CIH引起的血管功能紊亂可能與血管對(duì)H2S的反應(yīng)異常有關(guān)。內(nèi)皮作為單層細(xì)胞在不同類型的血管、不同的位置，其結(jié)構(gòu)、形態(tài)的異質(zhì)性以及在心血管系統(tǒng)內(nèi)表面的廣泛覆蓋說明了其功能的重要性［11］。本研究顯示，去內(nèi)皮后NaHS在Sham組與CIH組的收縮作用基本消失，舒張作用減弱（未發(fā)表），說明H2S引起的收縮機(jī)制可能涉及到血管內(nèi)皮釋放某種物質(zhì)。

KATP通道（ATP敏感性鉀通道）的開放在H2S介導(dǎo)的血管舒張中扮演了重要的角色［12］，KATP通道由主要由兩個(gè)亞單位組成，內(nèi)向整流亞單位Kir6.1和硫酰尿受體SUR1。有研究［13］顯示，H2S要么在cys6和cys26的位置結(jié)合SUR1的細(xì)胞外環(huán)的半胱氨酸殘基，要么打破涉及cys6和cys26的二硫鍵，然后改變KATP通道復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致開放Kir6.1并增加KATP通道電流。其他的H2S舒血管機(jī)制也曾被報(bào)道，Jackson-Weaver et al［14］證明H2S通過激活內(nèi)皮上的大電導(dǎo)激活鉀通道舒張大鼠腸系膜動(dòng)脈；H2S也能通過激活一類電壓依賴性的鉀通道來舒血管［15］。本研究中CIH大鼠胸主動(dòng)脈中H2S的舒張效應(yīng)具體涉及到哪種通道的開放，包括作為心血管系統(tǒng)中產(chǎn)生內(nèi)源性H2S的胱硫醚-γ-裂解酶［16］是否也發(fā)生了變化，需要進(jìn)一步的研究與探討。

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Effect of NaHS on the tension of thoracic aorta in a ratmodel of chronic interm ittent hypoxia

Wang Jinli，Shen Bing，F(xiàn)an Yifei，et al
（Dept of Physiology，AnhuiMedical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the effect of NaHS on the tension of thoracic aorta in a ratmodel of chronic intermittent hypoxia（CIH）.MethodsMale SD ratswere randomly divided into Sham and CIH groups.The conscious noninvasivemethod with tail cuffwas performed in rats to record the systolic blood pressure（SBP）.The experiment of vascular tension in vitro was carried out to observe the effects from NaHS on thoracic aorta rings.ResultsCompared with Sham thoracic arteries，the relaxant effect induced by acetylcholine（ACh）was decreased markedly in CIH thoracic arteries precontracted with phenylephrine（Phe）（P＜0.01）.NaHS caused contraction at low concentrations（50～100μmol/L in Sham arteries and 50～300μmol/L in CIH arteries）and relaxation at high concentrations（300～1 000μmol/L in Sham arteries and 500～1 000μmol/L in CIH arteries）.Compared with Sham thoracic arteries（100μmol/L），themaximum contractile effect at low concentrations（300μmol/L）increased notably in CIH arteries（P＜0.01）.Compared with Sham thoracic arteries（1 000μmol/L），the relaxant effect at high concentrations（1 000μmol/L）decreased significantly in CIH arteries（P＜0.01）.ConclusionCumulative concentrations of NaHS can cause contractile and relaxant effects in the precontracted with Phe of the thoracic arteries both Sham and CIH groups.However，there is a significant difference between two groups（P＜0.01）.Meanwhile，CIH can induce endothelium-dependent vasodilatation function decline.The mechanism may be involved in abnormal vascular reaction to hydrogen sulfide.

chronic intermittent hypoxia；hydrogen sulfide；hypertension；vascular endothelial dysfunction

R 331.33；R 363.21

A

1000-1492（2016）03-0329-04

時(shí)間：2016/1/28 14：23：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.008.html

2015-12-25接收

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：81070066）；安徽省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2010A176）；安徽醫(yī)科大學(xué)博士科研基金（編號(hào)：XJ201221）

安徽醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，合肥 230032

汪金麗，女，碩士研究生；

鐘明奎，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail zhongmkcn@aliyun.com