高宗華，付彩霞，王　雪，張懷斌

(濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東煙臺264003)

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金屬離子對4-氨基安替比林與牛血清白蛋白相互作用的影響

高宗華*，付彩霞，王雪，張懷斌

(濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東煙臺264003)

摘要:采用熒光法研究了金屬離子Ca2+、Zn2+和Mg2+存在下4-氨基安替比林( 4-AAP)與牛血清白蛋白( BSA)的相互作用．結(jié)果表明，金屬離子存在時，4-AAP對BSA的猝滅常數(shù)減小，但猝滅機(jī)制仍舊為靜態(tài)猝滅，4-AAP 與BSA之間的結(jié)合常數(shù)( KA)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)( n)均增大，分析認(rèn)為，金屬離子在二者的結(jié)合作用中起了“離子架橋”的作用．

關(guān)鍵詞:4-氨基安替比林;牛血清白蛋白;相互作用;金屬離子

4-AAP作為原料中間體，被用于生產(chǎn)鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌類的新型藥物［1］．血清白蛋白是生物體內(nèi)血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，對生命活動有著非常重要的作用，是運(yùn)輸內(nèi)源及外源性物質(zhì)的重要載體［2］．動物體的正常生理活動需要大量金屬離子的參與，我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)金屬離子對藥物小分子和蛋白質(zhì)的作用會產(chǎn)生不同的影響［3－4］．鑒于此，本文作者在模擬生理?xiàng)l件下，用熒光光譜法研究了鈣、鎂、鋅3種金屬離子對4-AAP與BSA相互作用的影響，以期為4-AAP在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝等研究提供一定的參考信息．

1　實(shí)驗(yàn)部分

1．1儀器與試劑

LS-55熒光分光光度計(jì)(美國，PE公司)，TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析儀器公司)，電熱恒溫水浴鍋(龍口市先科儀器公司)，BP211D電子分析天平(上海精密儀器廠)．BSA(生化試劑，純度＞98%)，4-AAP購自國藥集團(tuán)，為分析純，氯化鈉、Tris試劑、鹽酸、氯化鋅、氯化鈣、氯化鎂均為分析純．用0．05 mol·L－1pH= 7．40的Tris-HCl緩沖溶液(含0．1 mol·L－1NaCl)配制BSA溶液，BSA濃度為1．0×10－6mol·L－1，用蒸餾水配制濃度為1．16×10－3mol·L－1的4-AAP儲備液;配制濃度分別為1．00×10－4mol·L－1的ZnCl2、MgCl2、CaCl2溶液．實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水．

1．2熒光光譜測定方法

292 K時，移取3．0 mL BSA溶液于石英比色皿中，逐次加入10 uL的4-AAP溶液，搖勻，靜置5 min．設(shè)定激發(fā)波長為280 nm，測定體系的熒光光譜，記錄最大發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度．

分別移取1．5 mL的BSA和1．5 mL的各種金屬離子(混合后BSA的濃度為5．00×10－7mol·L－1;各種金屬離子的濃度為5．00×10－5mol·L－1)加入石英比色皿中，搖勻，靜置5 min，然后逐次加入10 uL的4-AAP溶液，搖勻，靜置5 min，測定混合體系的熒光光譜，考查金屬離子對4-AAP與BSA結(jié)合作用的影響．

2　結(jié)果與討論

2．1 4-AAP對BSA熒光光譜的影響

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中因含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基而具有內(nèi)源熒光．通過熒光光譜的變化可以反映小分子、金屬離子等物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的情況［5］．圖1為在292 K時，4-AAP對BSA熒光光譜的影響．BSA的最大發(fā)射峰位于348．5 nm附近處．隨著4-AAP濃度的增大BSA的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度明顯減弱，發(fā)生熒光猝滅;最大發(fā)射峰位藍(lán)移到346．5 nm處，藍(lán)移2 nm．表明4-AAP與BSA發(fā)生了相互作用，4-AAP的加入有可能改變了氨基酸殘基周圍的微環(huán)境［5］．

圖1　4-AAP對BSA熒光光譜的影響Fig．1 Effect of 4-AAP on fluorescence spectra of BSA

蛋白質(zhì)的熒光猝滅機(jī)制主要包括動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，根據(jù)Stern-Volmer方程［6］F0/F = 1 + KSV［c］= 1 + Kqτ0［c］作出4-AAP對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線，如圖2所示，求出292 K時猝滅常數(shù)KSV=4．75×104L·mol－1和猝滅速率常數(shù)Kq=4．75×1012L·mol－1·s－1．

Kq值遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)2．0×1010L·mol－1·s－1［6］，由此推斷4-AAP對BSA的熒光猝滅作用主要是靜態(tài)猝滅．

圖2　4-AAP對BSA的Stern-Volmer曲線Fig．2 Stern-Volmer curves for 4-AAP-BSA

2．2 4-AAP與BSA的結(jié)合作用

在靜態(tài)猝滅中，小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合作用可以用公式lg( F0/F－1) = lgKA+ nlg［c］加以描述［7］，式中KA為4-AAP與白蛋白分子的結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)．在292 K時，以lg( F0/F－1)對lg［c］作圖(圖3)．由直線的斜率及截距分別求得反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)KA及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，見表1． 2．3不同金屬離子對4-AAP與BSA相互作用的影響

圖3　lg［c］與lg( F0/F－1)的關(guān)系Fig．3　Plot of lg［c］versus lg( F0/F－1)

固定BSA與金屬離子( Ca2+、Zn2+、Mg2+)的濃度，分別加入不同濃度的4-AAP，在292 K時考查金屬離子對4-AAP與BSA相互作用的影響，結(jié)果見表1．表1顯示，在Ca2+、Zn2+和Mg2+存在下，4-AAP對BSA的熒光猝滅作用略有減小，但靜態(tài)猝滅仍是導(dǎo)致4-AAP對BSA熒光猝滅的主要成因; 4-AAP與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及結(jié)合常數(shù)增大，說明金屬離子首先和BSA發(fā)生一定程度的絡(luò)合，加入4-AAP分子后，4-AAP分子通過金屬離子增強(qiáng)了與BSA的結(jié)合作用，金屬離子起到了“離子架橋”的作用［8］．

表1　292 K時金屬離子存在下4-AAP與BSA作用的參數(shù)Table 1 Quenching reactive parameters of 4-AAP and BSA in the presence of metal ions at 292 K

3　結(jié)論

采用熒光光譜法探討了3種金屬離子對4-氨基安替比林和BSA相互作用的影響．金屬離子存在下，4-AAP對BSA的熒光猝滅機(jī)制仍為靜態(tài)猝滅;4-AAP與BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均增大，金屬離子的參與促進(jìn)了4-AAP與BSA的結(jié)合作用．該研究對于小分子在體內(nèi)的運(yùn)輸過程及作用機(jī)理具有一定的意義．

參考文獻(xiàn):

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［2］CAO S H，JIANG X Y，CHEN J W．Effect of zinc ( II) on the interactions of bovine serum albumin withfiavonols bearing different number of hydroxyl substituent on B-ring ［J］．J Inorganic Biochem，2010，104( 2) : 146－152．

［3］張懷斌，榮先國．三價(jià)鐵對燈盞花素與牛血清白蛋白相互作用的影響［J］．化學(xué)研究，2013，24( 3) : 224－227．

［4］張懷斌，馬麗英，劉向勇，等．Eu(Ⅲ)、Cu(Ⅱ)對燈盞花素與BSA作用的擾動［J］．化學(xué)試劑，2012，34 ( 12) : 1068－1072．

［5］ZHANG P J，LAN P，MA Y N，et al．Spectroscopic investigation on the interaction of Cr( VI) with bovine serum albumin ［J］．J biochem mole toxicol，2012，26( 2) : 54 －59．

［6 ］CHI Z X，LIU R T．Phenotypic characterization of the binding of tetracycline to human serum albumin ［J］．Biomacromolecules，2011，12( 1) : 203－209．

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［8］劉雪峰，李磊，方云，等．中藥成分七葉內(nèi)酯-BSA-金屬離子的相互作用［J ］．化學(xué)研究與應(yīng)用，2007，19 ( 2) : 145－149．

［責(zé)任編輯:任鐵鋼］

The effect of metal ions on the interaction between 4-aminoantipyrine and bovine serum albumin

GAO Zonghua*，F(xiàn)U Caixia，WANG Xue，ZHANG Huaibin

( Pharmaceutical College，Binzhou Medical University，Yantai 264003，Shandong，China)

Abstract:The interaction between bovine serum albumin ( BSA) and 4-Aminoantipyrine( 4-AAP) was investigated using fluorescence spectroscopy in the presence of metal ions ( Ca2+，Zn2+and Mg2+)．The results suggested that the quenching constant decreased in the presence of metal ions，but the quenching mechanism was not changed．The binding constants ( KA) and numbers of binding site ( n) increased．The anslysis indicated that the effect of metal ions on the interaction between 4-AAP and BSA was related to the metal ions function as the bridge ions．

Keywords:4-aminoantipyrine; bovine serum albumin; interaction; metal ions

作者簡介:高宗華( 1966－)，女，教授，研究方向?yàn)橛袡C(jī)合成和光譜分析．*通訊聯(lián)系人，E-mail: gzh3308@ 163．com．

基金項(xiàng)目:山東省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目( J08LG15)．

收稿日期:2015－08－15．

中圖分類號:O657．3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1008－1011( 2016) 01－0051－03