陸 英，蒲金基，喻群芳，謝藝賢，張 賀，漆艷香

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南海口 571700）

轉(zhuǎn)基因抗病棉花基因類型及原理研究進(jìn)展

陸 英，蒲金基，喻群芳，謝藝賢，張 賀，漆艷香

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南?？?571700）

評述了幾丁質(zhì)酶基因、β-1,3-葡聚糖酶基因、葡萄糖氧化酶基因和天麻抗真菌蛋白基因等抗病基因的抗病機(jī)理及其在轉(zhuǎn)基因抗病棉花中的應(yīng)用，并分析了抗病轉(zhuǎn)基因棉花研究目前存在的問題，為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)基因抗病棉花提供方向。

棉花；轉(zhuǎn)基因技術(shù)；抗病基因

棉花是世界上最主要的經(jīng)濟(jì)作物之一，據(jù)統(tǒng)計每年創(chuàng)造的產(chǎn)值有1 800億～2 000億美元[1]。棉花產(chǎn)業(yè)也是我國傳統(tǒng)優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，國家統(tǒng)計局公布的全國棉花產(chǎn)量數(shù)據(jù)顯示，2015年全國棉花總產(chǎn)量560.5×104t，為棉花種植戶每年帶來400億～600億元的直接經(jīng)濟(jì)收入，解決了3 000多萬個就業(yè)崗位[2]。

棉花病害是阻礙我國棉花產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的一個重要限制因素，我國棉花每年因病害造成的產(chǎn)量損失為10%～20%，嚴(yán)重年份高達(dá)30%～50%[3]。目前，在病害綜合防治措施中，化學(xué)防治雖能有效控制病害，但化學(xué)農(nóng)藥的長期使用會造成環(huán)境污染、對靶生物產(chǎn)生抗性等問題，使得化學(xué)農(nóng)藥的使用受到限制，生物防治技術(shù)因生防因子?；詮?qiáng)而制約了該技術(shù)的推廣應(yīng)用；使用抗病品種是最經(jīng)濟(jì)有效，又環(huán)保的防治措施，目前栽培品種中欠缺既豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)又抗病的棉花品種，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足棉花生產(chǎn)的需求，因此培育抗病品種才是解決棉花病害的根本途徑之一。

植物基因工程的迅速發(fā)展為棉花抗病種質(zhì)資源創(chuàng)新提供了新的思路和方法，利用基因工程技術(shù)可以打破物種間的生殖隔離，將特定的抗性基因定向轉(zhuǎn)移，避免了傳統(tǒng)育種工作的盲目性。棉花的轉(zhuǎn)基因方法主要有3種：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（Agrobactetium mediated genetansfer）、基因槍轟擊法（Particle bombardment） 和花粉管通道法（Pollen tube pathway）。截至2014年，我國種植了390×104hm2轉(zhuǎn)基因棉花，轉(zhuǎn)基因棉花的采用率達(dá)到90%[4]。轉(zhuǎn)入的基因有以下幾種：幾丁質(zhì)酶基因（Chitinase，Chi）、β-1,3-葡聚糖酶基因（β-1,3-glucanase，Glu）、葡萄糖氧化酶基因（Glucose oxidase，Go）、蘿卜抗真菌蛋白基因（Raphanus sativus antifungal proteins，Rs-AFPs）、天麻抗真菌蛋白（Gastrodia antifungal protein，GAFP）及幾丁質(zhì)酶與β-1,3-葡聚糖酶的融合基因。

1 幾丁質(zhì)酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因

幾丁質(zhì)酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因是植物防御體系中的2種防衛(wèi)因子，二者具有協(xié)調(diào)增效作用。劉桂珍等人[5]利用微束激光穿刺法將幾丁質(zhì)酶與β-1,3葡聚糖酶的融合基因?qū)朐ッ?號、南抗2號、新疆822等棉花品種，獲得對枯黃萎病抗性較高的轉(zhuǎn)基因棉花株（系）。程紅梅等人[6]利用花粉管通道法將幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶基因?qū)朊藁ǎ晒ε嘤隹箍菸S萎的轉(zhuǎn)基因棉品種（系）。李莉等人[7]將來自木霉的幾丁質(zhì)酶基因（TvChi）利用花粉管通道法導(dǎo)入多個陸地棉品種（系）中，在T2代選育了30株具有較高抗黃萎病能力的棉花品種。李樹誠等人[8]將菜豆幾丁酶和β-1,3-葡聚糖酶基因?qū)朊藁?，成功培育?個高抗黃萎病品系。蔡應(yīng)繁等人[9]采用基因槍法和葉盤法將抗真菌的β-1,3葡聚糖酶基因和幾丁質(zhì)酶融合基因轉(zhuǎn)入棉花基因組中，獲得了抗真菌病害的轉(zhuǎn)基因棉花。樂錦華等人[10]利用花粉管通道法將菜豆幾丁質(zhì)酶基因（BChi）與煙草β-1,3-葡聚糖酶基因（NtGlu）一并導(dǎo)入新疆棉花主栽品種（系）中，并進(jìn)行病圃枯萎病抗病篩選，獲得抗病性優(yōu)良和遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因棉花。吳家和等人[11]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶嵌合雙價基因?qū)朊藁?，獲得3個雙抗轉(zhuǎn)基因純合系。

2 葡萄糖氧化酶基因

葡萄糖氧化酶基因通過催化B2D2葡萄糖氧化成葡萄糖酸和H2O2，誘發(fā)植物的抗病反應(yīng)，還可以作為第二信使誘導(dǎo)植株系統(tǒng)抗性形成。研究表明，轉(zhuǎn)Go基因的棉花對黃萎病和枯萎病的抗性具有顯著提高。Murray等人[12]將Go基因轉(zhuǎn)入棉花，使棉株對大麗輪枝菌產(chǎn)生了一定的抗菌活性。劉慧君等人[13]將Go基因轉(zhuǎn)入棉花，轉(zhuǎn)基因后代對炭疽病、立枯病、疫病、枯萎病和黃萎病抗性均有顯著提高，部分轉(zhuǎn)基因植株后代抗黃萎病性能最好。

3 天麻抗真菌蛋白

天麻抗真菌蛋白是分離自天麻的一種具有廣譜抗真菌活性的蛋白質(zhì)，對許多植物病原菌包括棉花黃萎病菌具有很強(qiáng)的抑制作用。王義琴等人[14]采用花粉管通道法將以CaMV35S啟動子驅(qū)動的天麻抗真菌蛋白基因轉(zhuǎn)入陸地棉，獲得高抗黃萎病的轉(zhuǎn)基因株系。肖松華等人[15]利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)法技術(shù)將GAFP導(dǎo)入陸地棉，獲得抗落葉型黃萎病的棉花新種質(zhì)。陳大軍等人[16]將天麻抗真菌蛋白基因轉(zhuǎn)入天然彩色棉主栽品種，獲得既抗枯萎病又抗黃萎病的棉花品系。

4 存在的問題和展望

近年來，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，棉花轉(zhuǎn)基因方法和基因數(shù)量得到了較大拓展，獲得一批又一批的轉(zhuǎn)基因棉花，并且轉(zhuǎn)基因棉花在生產(chǎn)上得到大規(guī)模商業(yè)推廣和應(yīng)用，獲得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益、社會效益和生態(tài)效益，但也面臨著一些問題。例如，對植物抗性機(jī)制的研究缺乏系統(tǒng)性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因育種存在盲目性；有利性狀基因聚合的相關(guān)研究較少，而采用單一基因轉(zhuǎn)化，不同品種間的表達(dá)存在差異；利用過表達(dá)啟動子（35S）驅(qū)動抗逆基因高水平表達(dá)時，有可能造成畸形植株的產(chǎn)生；對棉花抗病品種缺乏系統(tǒng)性鑒定篩選，對棉花抗病性狀標(biāo)準(zhǔn)的系統(tǒng)性研究較少，導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)品種在后期材料篩選中被遺漏掉；外源抗逆性基因能否在受體棉花材料中穩(wěn)定表達(dá)，以及能否在后代中穩(wěn)定遺傳的研究較少；外源基因在后代中出現(xiàn)基因丟失、基因沉默等現(xiàn)象，通過消除DNA甲基化、構(gòu)建表達(dá)載體時，使用同源性較低的序列、選用具有組織和發(fā)育特異性調(diào)控作用的增強(qiáng)子、強(qiáng)啟動子，利用特異性重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)外源基因共整合，誘導(dǎo)型啟動子能有效提高外源基因的表達(dá)等策略，減少基因沉默現(xiàn)象的發(fā)生。

[1]Kumriar，Sunnichanvg，Dasdk.High-frequency so matic embryo production and maturation into normal plantsin cotton（Gossypium Hirsutum） through Metabolic Stress[J].Plant Cell Rep，2003（21）：635-639.

[2]張勝昔，孟艷艷，馮常輝.棉花抗黃萎病轉(zhuǎn)基因育種研究進(jìn)展 [J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（23）：5 673-5 675.

[3]劉方，王坤波，宋國立.中國棉花轉(zhuǎn)基因研究與應(yīng)用[J].棉花學(xué)報，2002，14（4）：249-253.

[4]James C.Global status of commercialized biotech/GM crops in 2014[J].ISAAA，2015，35（1）：1-14.

[5]劉桂珍，藍(lán)海燕.利用激光微束穿刺法獲得抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花的研究 [J].中國激光，2000，27（3）：279-283.

[6]程紅梅，簡桂良，倪萬潮，等.轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶基因提高棉花對枯萎病和黃萎病的抗性 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（6）：1 160-1 166.

[7]李莉，曲延英，陳全家.新疆陸地棉轉(zhuǎn)木霉幾丁質(zhì)酶基因棉花的初步篩選 [J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，42（3）：178-180.

[8]李樹誠，蔡仁盛.利用基因工程技術(shù)培育新疆棉花抗病抗蟲新品種 [J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，36（2）：60-62.

[9]蔡應(yīng)繁，葉鵬盛，江懷仲，等.抗真菌基因?qū)朊藁▌?chuàng)造高抗黃萎病材料研究 [J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2000，13（4）：45-49.

[10]樂錦華，祝建波，崔百明，等.利用目的基因轉(zhuǎn)化技術(shù)培育棉花抗病新品種 [J].石河子大學(xué)學(xué)報，2002，6（3）：173-178.

[11]吳家和，張獻(xiàn)龍，羅曉麗，等.轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶基因棉花的獲得及其對黃萎病的抗性 [J].遺傳學(xué)報，2004，31（2）：183-188.

[12]Murray，Llewellyn，Peacock，et al.Isolation of the glucose oxidase gene from Talaromyces flavusand characterisation of its role in the biocontrol of Verticillium dahliae[J].Current Genetics，1997，32（5）：367-375.

[13]劉慧君，簡桂良，鄒亞飛，等.Go基因?qū)雽γ藁ㄞr(nóng)藝性狀及抗病性的影響 [J].分子植物育種，2003（6）：669-672.

[14]王義琴，陳大軍，危曉薇，等.天麻抗真菌蛋白基因（GAFP）轉(zhuǎn)化彩色棉的研究 [J].植物學(xué)通報，2003，20（6）：703-712.

[15]肖松華，趙君，劉劍光，等.轉(zhuǎn)天麻真菌蛋白基因提高棉花對黃萎病抗性 [J].作物學(xué)報，2016，42（2）：212-221.

[16]陳大軍，簡桂良，李仁敬，等.轉(zhuǎn)天麻抗真菌蛋白基因彩色棉新品系抗枯黃萎病研究 [J].分子植物育種，2003（5/6）：673-676.

Advances of Research on Gene Types and Principles of the Transgenic Diseases Resistant Cotton

LU Ying，PU Jinji，YU Qunfang，XIE Yixian，ZHANG He，QI Yanxiang
（Environment and Plant Protection Institute，Chinese Academy of Tropical Agriculture Science，Haikou，Hainan 571700，China）

The mechanisms of several important diseases resistant genes about chitinase，β-1,3-glucanase，glucose oxidase，gastrodia antifungal protein and theirapplications indevelopingtransgenic diseases resistantcotton are summarized.Meanwhile，the existing problems and developing tendency of the transgenic resistant cotton are analyzed and discussed，provide the direction for further research on transgenic diseases resistantcotton.

cotton；transgenic technology；diseases resistantcotton

S562

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.11.044

1671-9646（2016）11b-0054-02

2016-09-26

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)“南繁區(qū)生物安全監(jiān)測預(yù)警及控制關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（201403075）。

陸 英（1976—），女，博士，副研究員，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)。