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·述評·

血細胞分析自動化與顯微鏡復檢應關(guān)注什么

張時民1,2，王庚1,2

(1.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院，北京 100730；2.北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科,北京 100730)

關(guān)鍵詞:血細胞分析；顯微鏡；復檢

由于血細胞分析儀具有快速、準確和便捷等優(yōu)勢，60多年來一直在改變實驗室血常規(guī)檢驗方法與檢驗流程。近年來血細胞分析儀由于各種新技術(shù)的使用，其檢測性能越來越強大，檢測參數(shù)也越來越多，特別是具有白細胞五分類技術(shù)的儀器的普及應用及全自動流水線化的血細胞分析系統(tǒng)的使用，使得實驗室越來越依賴這樣的設備來完成大量的血常規(guī)檢驗工作[1]。在樣本量加大和人員缺乏這種特定環(huán)境條件下，外周血涂片檢查的重要性被逐漸淡化和忽視，以至造成一些漏診與錯誤。這種現(xiàn)象已經(jīng)引起國內(nèi)外臨床檢驗界的重視，因此P.W.Barnes等教授倡導并組成了國際血液學復檢專家組(International Consensus Group for hematology Review)，并在2005年制定了自動血細胞計數(shù)和白細胞分類計數(shù)的復檢標準[2]，該標準被國際實驗血液學學會(ISLH)作為一個推薦方法介紹給全球使用各種自動化血液分析系統(tǒng)的專業(yè)人士參考。中華醫(yī)學會檢驗分會也于2006年組成全國血液學復檢專家小組對該標準進行了標準的釋義并將其發(fā)表[3]，這就是所熟悉的41條篩檢規(guī)則。而采用不同的血細胞分析系統(tǒng)，建立與各自醫(yī)療單位和服務人群相適應的復檢規(guī)則也成為血液分析儀的用戶單位的重要工作，這也是衛(wèi)生部實驗室管理辦法和ISO 15189評審中重要的檢查條款。

血涂片的復檢與復核方法有兩種，血片瀏覽(review)和血片分類(differential)。許多情況下僅僅需要瀏覽復核血片，用于確認血細胞分析儀得出的結(jié)論，例如紅細胞體積大小(對發(fā)現(xiàn)的紅細胞異常形態(tài)、染色、內(nèi)含物應同時進行描述和報告)，大小不等、某類細胞增高或減低(不包括形態(tài)學報告內(nèi)容)。對出現(xiàn)白細胞形態(tài)學提示的問題，分類不正確的問題、不能分類的問題，則應采用顯微鏡下血片分類，重新分類報告。那么復檢規(guī)則要關(guān)注和解決那些問題呢？以下幾點建議供參考。

1瀏覽血片

首先瀏覽血涂片，此時可采用低倍(或高倍)鏡瀏覽觀察，初步了解血涂片制片效果，細胞的分布情況，染色效果，有否具有病理意義的大型細胞的出現(xiàn)等。同時觀察血小板的聚集情況，如果是外周血、未抗凝的條件下直接涂片，血小板應出現(xiàn)輕度聚集，可見3～5個的小型聚集或成簇狀聚集，表明血小板具有聚集能力，血小板無力癥患者血涂片中的血小板雖數(shù)量未見異常，但血小板散在分布，幾乎見不到聚集的血小板，也是一種異?，F(xiàn)象。如果是抗凝血，血小板應該分布均勻，不應出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，如有聚集出現(xiàn)將是導致儀器計數(shù)異常的問題所在。同時還需要觀察紅細胞的分布與排列，發(fā)現(xiàn)緡錢狀排列現(xiàn)象和紅細胞凝集現(xiàn)象等，從而發(fā)現(xiàn)初步判斷是否有多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、血粘度較高或者冷凝集綜合征等，甚至考慮判斷是否會影響紅細胞計數(shù)的準確性等問題。

2評估檢測結(jié)果

通過血涂片的瀏覽觀察，可以對血細胞分析儀測定的細胞計數(shù)結(jié)果進行復核，初步評估儀器計數(shù)結(jié)果的可靠性和一致性。例如白細胞可參考表1的關(guān)系進行復核[4]；或采用估算方法進行復核，選擇血片中分布均勻的區(qū)域進行評估，白細胞計數(shù)(×109/L)=每高倍鏡視野中白細胞平均個數(shù)×2(×109/L)[5]。

表1　　血涂片白細胞分布與定量計數(shù)結(jié)果的關(guān)系對照表*

*：該對應關(guān)系或評估方法，與所使用的顯微鏡鏡頭的數(shù)值孔徑和視場直徑有關(guān)，本表供參考。

還可根據(jù)血涂片上血小板分布情況初步評估儀器對血小板計數(shù)結(jié)果的一致性及復核。如果每油鏡視野中平均1個血小板，相當于PLT計數(shù)結(jié)果的10×109/L，依次類推。或者通過血片推斷血小板數(shù)量，選擇血片體尾交界處分布均勻、無異常聚集或纖維蛋白絲的區(qū)域，瀏覽血涂片可大致估算血小板數(shù)量，方法：血小板數(shù)(×109/L)=每油鏡視野中血小板平均個數(shù)×15(×109/L)[5]。

3不漏檢血液病

復檢中很重要的問題是不要漏檢血液系統(tǒng)疾病，或者稱為造血與淋巴組織腫瘤。雖然許多品牌的血細胞分析儀可以給出不成熟粒細胞(IG)、異型淋巴細胞(ATYP)、原始細胞(BLAST)、核左移(LEFT SHIFT)、大型未染色細胞(LUC)等提示性報警信息，甚至是數(shù)量結(jié)果信息，但是他們依然具有局限性。根據(jù)目前的技術(shù)水平，五分類原理的血細胞分析儀尚不能對多種異常細胞給出明確的定義，更談不上對血液系統(tǒng)疾病給出正確的白細胞分類報告。因此需要有經(jīng)驗的檢驗醫(yī)師或技師進行細致的顯微鏡分類復檢。在進行顯微鏡涂片檢查時，除了關(guān)注和發(fā)現(xiàn)各系原始或幼稚細胞外，此外還應關(guān)注中性粒細胞毒性改變(如中毒顆粒、空泡變性、D?hle小體及白細胞體積大小不均)，核左移與核右移、Pelger-Huet畸形、May-Hegglin畸形、Chediak-Higashi畸形、是否吞噬病原微生物等現(xiàn)象，這些問題的出現(xiàn)對診斷傳染性疾病、某些嚴重感染、中毒、惡性腫瘤、猩紅熱、白喉、MDS等具有重要意義，還對疾病的治療和預后判斷具有一定的幫助。對嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和單核細胞異常增高的病例，也需進行鏡下復核與確認，以防止出現(xiàn)假性增加的問題。此外還要觀察是否有其他異常細胞出現(xiàn)，如異型淋巴細胞、漿細胞、骨髓瘤細胞、毛細胞、塞色利(Sezary)細胞、淋巴瘤細胞等，以便初步篩查某些血液系統(tǒng)疾病。白細胞參數(shù)出現(xiàn)異常報警提示，一般要考慮進行白細胞分類，將幼稚或異常的白細胞給出適當?shù)陌俜直葓蟾?，對儀器分類錯誤的結(jié)果要給予糾正或重新分類確定。如果某些報警信息過于敏感，經(jīng)鏡檢確認未見異常報警信息所提示的細胞、或未見異常細胞，也要在報告中予以記錄和說明。

4關(guān)注紅細胞

應該關(guān)注紅細胞形態(tài)信息,提供貧血診斷的初步鑒別信息。一般血細胞分析儀都會提供許多紅細胞報警的信息，如大細胞(Macro)、小細胞(Micro)、紅細胞大小不等(Aniso)、血紅蛋白含量不均(HC VAR)、低色素性(Hypo)、高色素性(Hyper)等形態(tài)學信息。筆者認為這些紅細胞形態(tài)學信息是更加準確的告知一個樣本的紅細胞大小或大小不等的信息，他更加客觀、更加敏感，更加準確的、定量化的了解紅細胞大小及色素改變的情況，是比較可信的參數(shù)，而這些參數(shù)的準確性應該建立在儀器校準合格、儀器質(zhì)控在控及MCV/MCH/MCHC三項浮動均值指標完全在控的基礎之上。而人工觀測和描述這些紅細胞信息，則可能受到個人經(jīng)驗因素影響，筆者認為其敏感性和一致性不如儀器分析結(jié)果準確和穩(wěn)定。紅細胞大小及形態(tài)學改變的臨床意義參見表2。

表2　　MCV、MCH、MCHV和RDW輔助進行貧血分類鑒別表

紅細胞分析還可對一些現(xiàn)象進行提示性報警，如紅細胞聚集(RBC Agglutination)表示標本可能有冷凝集現(xiàn)象；血紅蛋白測定濁度增加(Hb Interf)則可能是因乳糜血因素的影響；有核紅細胞增加(NRBC)、紅細胞雙峰分布(Dimorphic Population)、紅細胞碎片(RBC Fragment)干擾等，這些提示可以對一些紅細胞和血紅蛋白異?，F(xiàn)象進行初步判斷，但是NRBC、紅細胞聚集、紅細胞碎片現(xiàn)象等還需要進行顯微鏡下的確認。如果這些現(xiàn)象出現(xiàn)，會影響到白細胞和紅細胞計數(shù)的正確性，進而影響紅細胞相關(guān)計算參數(shù)的準確性，因而需復檢血片；紅細胞碎片增多會干擾阻抗法的血小板計數(shù)結(jié)果，也要通過儀器直方圖和散點圖初篩，通過復檢血片而確認，并且需要對受到影響的計數(shù)結(jié)果進行糾正。復檢血片所需要關(guān)注的是許多紅細胞形態(tài)的異常改變、染色情況和內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常時，血細胞分析儀的有關(guān)參數(shù)和報警信息不能完全覆蓋或不能正確提示，如珠蛋白生成障礙性貧血和HbC時出現(xiàn)的靶形紅細胞；遺傳性橢圓形紅細胞增多癥；自身免疫性溶血性貧血時的球形紅細胞(spherocyte)增多；肝臟疾病、溶血性貧血和小兒消化系統(tǒng)疾病導致的口形紅細胞(stomatocyte)增加；舞蹈病和重度肝損傷時的棘形紅細胞(acanthocyte)、骨髓纖維化時的淚滴樣紅細胞(tear drop)、巨幼細胞貧血和橢圓形紅細胞增多癥時的橢圓形紅細胞(elliptocyte)增加；以及鐮狀細胞(sickle cell)貧血、嗜堿性點彩(basophilic stippling)紅細胞、卡波環(huán)(Cabot rings)和豪焦小體(Howell-Jolly bodies)等情況出現(xiàn)和增加，均需要通過觀察紅細胞形態(tài)而進行識別和參與臨床輔助診斷。

2015年，國際血液學標準委員會(International Council for Standardization in Haematology，ICSH)根據(jù)十多位專家的研究和建議，推出了有關(guān)紅細胞形態(tài)術(shù)語的標準化和外周血細胞形態(tài)學特征分級標準(ICSH recommendations for the standardization of nomenclature and grading of peripheral blood cell morphological features)，見表3。該項推薦標準對今后應用細胞形態(tài)術(shù)語的標準化，特別是在判斷細胞形態(tài)異常的標準方面，提供了有價值的借鑒性指導[6]。其中有關(guān)紅細胞形態(tài)的術(shù)語和分類原則，與我國專業(yè)書籍或教科書中有關(guān)紅細胞形態(tài)的命名及分類原則有一定差距，這方面應該引起我國同行們的注意。同時筆者也建議國內(nèi)檢驗學會和血液學專家盡快討論，制定或建立中英文標準化術(shù)語和譯名，規(guī)范化各種細胞類別的定義，這對專業(yè)的發(fā)展是有積極意義的。

5關(guān)注血小板

特別關(guān)注血小板，血小板體積小，易發(fā)生聚集和計數(shù)不準，因此是非常容易出現(xiàn)問題的復檢內(nèi)容之一。在進行血涂片檢查或復檢時，首要注意是否出現(xiàn)血小板聚集(PLT Clump)報警信息，或者血小板分布異常(PLT Abn Distribution)的提示，特別是應用EDTA抗凝血標本時，注意防范血小板假性減低現(xiàn)象發(fā)生。而EDTA抗凝劑導致的假性血小板減低會給臨床帶來誤診或延誤治療。此外還需要關(guān)注大血小板是否明顯增加的報警(Large PLT)，它會使阻抗法計數(shù)的血小板出現(xiàn)假性減低現(xiàn)象，此時需要考慮是否改用其他檢測原理的設備，或者改用顯微鏡計數(shù)法進行糾正，巨大血小板出現(xiàn)過多甚至會導致儀器“漏數(shù)”，這些超出紅細胞體積大小的巨大血小板只有通過鏡檢才能發(fā)現(xiàn)。如果外周血出現(xiàn)較多顆粒缺失或減少的血小板、巨大血小板、形態(tài)異常的血小板、血小板體積明顯大小不等，對骨髓病態(tài)造血相關(guān)的疾病和凝血機能障礙的疾病具有提示意義，如骨髓增生異常綜合征、慢性骨髓增生性疾病等。此外筆者在最近的兩年中還發(fā)現(xiàn)了冷球蛋白血癥患者，導致血小板計數(shù)假性升高的病例，如果是假性升高到極高的水平(如>1 000×109/L)通過復檢規(guī)則還可以發(fā)現(xiàn)，如果是血小板偏低，而假性升高到正常水平，甚至儀器不出現(xiàn)任何報警信息，那則是非常難以發(fā)現(xiàn)和復檢查出的，在2013和2015年就發(fā)現(xiàn)兩例此類患者。因此發(fā)現(xiàn)冷球蛋白血癥，其血小板計數(shù)結(jié)果一定要經(jīng)過人工復檢來確認，這是以前的復檢規(guī)則中未曾提到的問題[7]。

表3　　細胞中英文名稱及形態(tài)學分級標準

6血液寄生蟲

血片檢查中另一特別需要重視的問題是血液寄生蟲，某些患者可能因臨床癥狀不典型，未引起臨床醫(yī)生關(guān)注寄生蟲感染問題。在血液中可以發(fā)現(xiàn)瘧原蟲[8]、微絲蚴、巴貝斯蟲、錐蟲、弓形蟲等感染，要知道這些病原體的發(fā)現(xiàn)，實際上是給臨床出具了診斷性報告，是血液檢驗中可以發(fā)出確診報告的項目，這是非常重要的。如果臨床患者有相關(guān)癥狀，或臨床醫(yī)生提示檢查血液寄生蟲，應將血片仔細瀏覽，或者多涂幾張血片，包括厚血片進行細致檢查。而目前在南方，特別是從疫區(qū)國家歸來的人員，其瘧原蟲感染率非常高，值得警惕和仔細檢查。

7顯微鏡計數(shù)技術(shù)

復檢有時候還需要傳統(tǒng)的顯微鏡法予以配合，雖然血細胞分析儀在計數(shù)的準確性、精密度上、檢測速度上已經(jīng)大大高于傳統(tǒng)的人工測定方法，是毋庸置疑的。但是在某些特定的病例上，可能還需要人工法予以驗證和輔助分析。假如遇到EDTA及枸櫞酸鈉抗凝劑均可引發(fā)血小板聚集的病例，就需要回歸顯微鏡計數(shù)法。遇到嚴重的冷凝集現(xiàn)象或者冷球蛋白血癥、紅細胞碎片增加的病例，都有可能導致紅細胞計數(shù)及血小板計數(shù)出現(xiàn)錯誤，都可能要回歸顯微鏡計數(shù)法予以解決。溶血性貧血患者過高的網(wǎng)織紅細胞，也可因儀器試劑或線性問題導致計數(shù)結(jié)果偏低或不正確，且在41條規(guī)則中并未涉及到此類問題的復檢規(guī)則，因此也需要用傳統(tǒng)的煌焦油藍染色和顯微鏡計數(shù)法予以糾正[9]。

8數(shù)字圖像技術(shù)

目前已經(jīng)有一些數(shù)字圖像的血細胞檢查系統(tǒng)，將血片置于顯微鏡下進行數(shù)字圖像拍攝，然后數(shù)字識別軟件對白細胞進行分類處理。其完全模擬顯微鏡分類技術(shù)進行形態(tài)學血細胞檢查，這是一個有益的進步。但是可能還有一些瓶頸問題尚未得到解決，或許因血細胞形態(tài)千變?nèi)f化，在原始和幼稚細胞、異常細胞形態(tài)等方面，在某些成分的干擾情況下，其正確識別率仍有待進一步的提升。目前對應用此類儀器應用，筆者的建議是，首先進行屏幕審核，糾正其錯誤識別的細胞，消除干擾成分，對難以鑒別的樣本，重新進行顯微鏡下的觀察和判別。

9小結(jié)

目前在廣泛應用各種品牌的自動化血細胞分析儀進行大量血常規(guī)標本檢測的背景下、在工作量增加、檢驗人員配備不足、檢驗報告時間被限定的現(xiàn)實條件下，制定適合自己實驗室使用的、能夠保證實驗質(zhì)量、盡量減少漏檢和實驗誤差的復檢規(guī)則，非常重要。更為重要的是有了復檢規(guī)則，應該具體落實和執(zhí)行這些規(guī)則，不要流于形式，以保證實驗室所出具的報告具有可信性和高質(zhì)量，最大限度地滿足臨床醫(yī)師診治工作對臨床檢驗的需求。

參考文獻

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[9]張時民，李建英，王庚.3例溶血性貧血患者用血液分析儀檢測網(wǎng)織紅細胞結(jié)果偏低[J].臨床檢驗雜志，2012，30(1)：72.

(收稿日期：2015-08-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.04.001

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)04-0433-03

作者簡介：張時民，男，副主任技師，主要從事臨床檢驗基礎血液、體液及形態(tài)學檢驗專業(yè)研究。