■冼健安陳　江張秀霞方　哲黃丹楓王冬梅

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南?？?71101；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北武漢430070）

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飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺稚螺生長、肌肉組成與免疫功能的影響

■冼健安1陳江2張秀霞1方哲1黃丹楓2王冬梅1

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南海口571101；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北武漢430070）

摘要：為探討飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺稚螺生長、肌肉組成與免疫功能的影響，在基礎(chǔ)飼料中添加3個(gè)不同濃度（2.34×105、2.34×107CFU/100 g和2.34×109CFU/100 g）的枯草芽孢桿菌，養(yǎng)殖初始體重為0.62 g的方斑東風(fēng)螺10周。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，添加枯草芽孢桿菌濃度為2.34×109CFU/100 g時(shí)，增重率和特定生長率有顯著的提高（P<0.05），增重率相對(duì)對(duì)照組提高了11.4%；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的臟體比、肥滿度、存活率、肌肉體組成沒有顯著性差異（P>0.05）；添加枯草芽孢桿菌對(duì)過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽還原酶（GR）活力沒有顯著影響（P>0.05）；添加濃度為2.34×105CFU/100 g時(shí)，東風(fēng)螺肝胰腺的超氧化物歧化酶（SOD）活力提高17.8%（P<0.05）；添加濃度為2.34×109CFU/100 g時(shí)，堿性磷酸酶（AKP）活力提高61.9%（P<0.05），而添加濃度為2.34×107和2.34× 109CFU/100 g時(shí)，酸性磷酸酶（ACP）活力分別提高28.9%和94.6%（P<0.05）。這些結(jié)果表明，飼料中添加2.34×109CFU/100 g的枯草芽孢桿菌可顯著提高方斑東風(fēng)螺稚螺的生長性能和部分非特異性免疫功能。

關(guān)鍵詞：方斑東風(fēng)螺；枯草芽孢桿菌；配合飼料；免疫

Effects of dietary Bacillussubtilison growth performance, muscle composition and immunity of Babyloniaareolata

Xian Jian’an, Chen Jiang, Zhang Xiuxia, Fang Zhe, Huang Danfeng, Wang Dongmei

Atssynu bab ositflti l r si ( aspi n co(itt2t：ti.eaT3dlh4 e a× bva1 eeb0 frfy5ae,lgco 2etns. 3 w s o4nef×ai dg1i ilh0 et (7tBa 0C ra.yF6b2yU Bl/ ao g1 cn)0 iila0 wl uea g srr,ees aou fnlbeaddttial 2 i) es.x 3wpo4ene×rre i1 gmr0 soet9wunCdtthaFi elU pd d/ e1i irenf0 ot0sr tmh wgea)int p fhcorere t,sh 1e br0neoted w ys det ue i cfkdof es myr,.ep r Tnoe t h ss iep dt ieoo scsnpteiosv a tt e ne ol dydf. i B b m R aa mebcsiyuulll nolut inss?showed that dietary Bacillus subtilis in dose of 2.34×109CFU/100 g improved the weight gain rate (WGR) and specific growth rate (SGR) of Babyloniaareolata, and the WGR significantly increased by 11.4% (P<0.05). Compared with the control group, dietary Bacillus subtilis did not affect the vis?cerosomic index, condition factor, survival rate and body composition (P>0.05). Dietary Bacillussubti?lis also did not affect catalase (CAT) and glutathione reductase (GR) activities (P>0.05). Superoxide dismutase (SOD) activity significantly increased by 17.8% in snail fed diet supplemented with 2.34×105CFU/100 g Bacillus subtilis (P<0.05). Alkaline phosphatase (AKP) activity increased by 61.9% in snails fed diet supplemented with 2.34×109CFU/100 g (P<0.05), and acid phospha?tase (ACP) activity increased by 28.9% and 94.6% when snails fed diets supplemented with 2.34×107CFU/100 g and 2.34×109CFU/100 g,respectively. These results indicated that dietary Bacillus subtilis with dose of 2.34×109CFU/100 g would improve the growth performance and some non-specific immune indexes of Babyloniaareolata.

Key words：Babyloniaareolata；Bacillussubtilis；compound feed；immunity

方斑東風(fēng)螺（Babyloniaareolata）味道鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高，隨著人工育苗和養(yǎng)殖技術(shù)的成功，我國東南沿海以及越南、泰國等東南亞國家興起了養(yǎng)殖東風(fēng)螺的熱潮，東風(fēng)螺養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展前景良好[1]。但目前東風(fēng)螺的養(yǎng)殖仍主要以冰鮮魚為餌料，存在餌料供應(yīng)不穩(wěn)定、殘餌不易清理、養(yǎng)殖水體污染嚴(yán)重、病原大量滋生等問題，直接制約了東風(fēng)螺養(yǎng)殖的規(guī)模化、可持續(xù)化發(fā)展。研制污染小、營養(yǎng)全面以及可增強(qiáng)免疫力的專用配合飼料代替冰鮮魚，是東風(fēng)螺養(yǎng)殖業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展的重要保障。近年來，東風(fēng)螺營養(yǎng)需求的研究已相繼開展[2-7]，但其配合飼料仍有待進(jìn)一步的優(yōu)化。

益生菌已作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物配合飼料中，研究表明，飼料中添加一定含量的益生菌可提高水產(chǎn)動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率、促進(jìn)生長、增強(qiáng)免疫力[8-9]。在過往的研究中，本研究組針對(duì)兩種芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺免疫力的影響進(jìn)行了初探，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌能顯著提高方斑東風(fēng)螺的免疫功能，而地衣芽孢桿菌則表現(xiàn)出免疫抑制作用[10]。為進(jìn)一步探明枯草芽孢桿菌的作用，本試驗(yàn)研究了不同添加量枯草芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺的生長性能、肌肉組分以及免疫功能的影響，為枯草芽孢桿菌在東風(fēng)螺飼料中的合理應(yīng)用提供參考。

1材料和方法

1.1飼料配制

本飼料是以魚粉為主要的蛋白源，α-淀粉為主要糖源，魚油為主要脂肪源配制試驗(yàn)所需要的基礎(chǔ)飼料，基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。枯草芽孢桿菌菌粉（細(xì)菌含量為1.17×1010CFU/g）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院熱帶生物技術(shù)研究所提供。不添加枯草芽孢桿菌的基礎(chǔ)飼料組為對(duì)照組，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼料中分別添加三個(gè)不同濃度的枯草芽孢桿菌：2.34×105、2.34×107CFU/100 g和2.34×109CFU/100 g。各原料粉碎后過80目篩，然后按照配方稱取原料，用飼料混合機(jī)混合均勻，再加入魚油以及含有不同濃度枯草芽孢桿菌的水，混合揉成面團(tuán)狀軟顆粒飼料，按照估算的日投喂量小份分裝，置于-20℃冰箱保存，投喂前解凍至室溫。

表1基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(%)

1.2養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)于2014年6月~8月在海南省瓊海市長坡鎮(zhèn)椰林村某方斑東風(fēng)螺養(yǎng)殖場內(nèi)進(jìn)行。方斑東風(fēng)螺稚螺由該養(yǎng)殖場提供，選取同一批螺苗，暫養(yǎng)在30 cm×40 cm×35 cm規(guī)格的塑料箱中，用基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)兩周。挑選活力好、規(guī)格相近的個(gè)體作為試驗(yàn)稚螺，隨機(jī)分配至各組中，每組3個(gè)重復(fù)。箱子底部鋪上3~4 cm厚的沙子，海水進(jìn)行過濾后用作試驗(yàn)用水，鹽度30‰~31‰，水溫(27±2)℃，流水養(yǎng)殖。飼料日投喂量為螺重的4%~5%，并根據(jù)實(shí)際攝食情況進(jìn)行調(diào)整，每天19:00投喂。養(yǎng)殖周期為10周。

1.3樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

東風(fēng)螺取樣前禁食24 h，統(tǒng)計(jì)存活率（SR）后，稱量終末體重（FBW），計(jì)算試驗(yàn)方斑東風(fēng)螺的增重率（WGR）、特定生長率（SGR）和飼料系數(shù)（FC）。東風(fēng)螺放入液氮中速凍，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室置于-80℃冰箱保存。

1.3.1生長性能

增重率（weight gain rate，WGR，%）=100×（螺終末平均體重-螺初始平均體重）/螺初始平均體重；

特定生長率（specific growth rate，SGR，%/d）= 100×（Ln螺終末平均體重-Ln螺初始平均體重）/飼養(yǎng)天數(shù)；

肉殼比=螺肉的質(zhì)量(g)/螺殼的質(zhì)量(g)；

存活率（survival rate，SR，%）=100×試驗(yàn)結(jié)束時(shí)螺的顆數(shù)/開始時(shí)螺的顆數(shù)；

臟體比（viscerosomic index，VSI，%）=100×內(nèi)臟團(tuán)重(g)/螺體重(g)；

肥滿度（condition factor，CF）=肉重(g)/螺體重(g)。

1.3.2飼料和肌肉營養(yǎng)組成

用105℃烘箱干燥法測(cè)定飼料和螺肌肉的水分（GB/T 6435—1986）；將烘干的飼料和螺肌肉組織粉碎，用凱氏定氮法測(cè)定飼料和螺肌肉的粗蛋白含量（GB/T 6432—1994）；用索氏抽提法測(cè)定飼料和螺肌肉的粗脂肪含量（GB/T 6433—1994）；采用550℃灼燒法測(cè)定灰分含量（GB/T 6438—1992）。

1.3.3免疫酶活性

每個(gè)重復(fù)各隨機(jī)選取3只螺，每飼料組共9只，每只螺的組織單獨(dú)測(cè)定。在-80℃冰箱取出樣品，待適當(dāng)解凍后，于冰上解剖分離出肝胰臟，用4℃的生理鹽水沖洗，用吸水紙將水吸干，準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量體積比加入9倍的生理鹽水制成10%的組織勻漿，4℃、2 500 r/min離心10 min，取上清液用于酶活測(cè)定。組織勻漿粗提液蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）、堿性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性測(cè)定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示，利用SPSS19.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），P<0.05確認(rèn)為差異顯著。

2　結(jié)果

2.1枯草芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺生長性能和肌肉組成的影響（見表2~表3）

表2飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺生長性能的影響

表3飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺肌肉組成的影響（%）

飼料中添加2.34×109CFU/100 g的枯草芽孢桿菌顯著提高了螺的增重率和特定生長率（P<0.05），增重率相對(duì)對(duì)照組提高了11.4%。與對(duì)照組相比，飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)螺的肥滿度、肉殼比、臟體比和存活率均沒有顯著影響（P>0.05）。如表3所示，飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺肌肉的水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分含量沒有顯著影響（P> 0.05）。

2.2枯草芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺免疫功能的影響（見表4）

結(jié)果如表4所示，與對(duì)照組相比，飼料中添加濃度為2.34×105CFU/100 g的枯草芽孢桿菌使東風(fēng)螺肝胰腺SOD活力提高17.8%（P<0.05）；飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)CAT和GR活力沒有顯著影響（P>0.05）；飼料中添加2.34×109CFU/100 g的枯草芽孢桿菌使東風(fēng)螺的AKP活力提高61.9%（P<0.05）；添加濃度為2.34×107CFU/100 g和2.34×109CFU/100 g時(shí)，ACP活力分別提高28.9%和94.6%（P<0.05）。

3　討論

3.1枯草芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺生長性能的影響

表4飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺免疫功能的影響

芽孢桿菌廣泛存在于自然界中，是目前使用最為廣泛的益生菌種類之一，具有安全、穩(wěn)定、不產(chǎn)生抗藥性、無毒害殘留等優(yōu)點(diǎn)，是抗生素的絕佳替代品[9]。其中，枯草芽孢桿菌是我國農(nóng)業(yè)部允許直接投喂動(dòng)物的微生物添加劑，在目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中最為常用的芽孢桿菌。以往的研究已表明，飼料中添加各類芽孢桿菌能夠提高斑點(diǎn)叉尾鮰（IetalurusPunetaus）、黑鯛（Acan?thopagrus schlegelii）、雜交鱘（Acipenser baeri♂× Acipenserschrenkii♀）、奧尼羅非魚（Oreochromisni?loticus×O. aureus）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）、青魚（Mylopharyngodonpiceus）、異育銀鯽（allogynoge?neticcruciancarp）以及凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeusvan?namei）等的生長性能[11-20]。一般認(rèn)為，芽孢桿菌能夠定植在動(dòng)物腸道內(nèi)，產(chǎn)生維生素、氨基酸、促生長因子等多種營養(yǎng)物質(zhì)，并且產(chǎn)生多種酶類，提高動(dòng)物體的消化酶活力，參與胃腸道的代謝過程，提高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率，從而促進(jìn)動(dòng)物的生長[8]。也有報(bào)道顯示，枯草芽孢桿菌可以通過改善草魚腸道黏膜形態(tài)，促進(jìn)其對(duì)飼料的吸收利用，從而促進(jìn)其生長[12]。在本研究中，添加枯草芽孢桿菌濃度為2.34×109CFU/100 g時(shí)，增重率和特定生長率也有顯著提高，與上述研究結(jié)果一致，表明枯草芽孢桿菌可以作為飼料添加劑應(yīng)用于方斑東風(fēng)螺稚螺的配合飼料中，可有效促進(jìn)方斑東風(fēng)螺的生長性能。但也有研究顯示，飼料中添加0.03%~0.18%的枯草芽孢桿菌對(duì)吉富羅非魚（Oreo?chromis niloticus）的生長性能沒有顯著影響[21]，添加0.2%的芽孢桿菌使網(wǎng)箱養(yǎng)殖鯉（Cryprinuscarpiod）的增重率和飼料利用率下降[22]。造成這些研究結(jié)果的差異，可能與養(yǎng)殖動(dòng)物品種差異、芽孢桿菌菌種差異、芽孢桿菌對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物腸道以及水體環(huán)境的適應(yīng)性等有關(guān)。

飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物形體指標(biāo)影響的結(jié)果也存在一定的差異。隨著枯草芽孢桿菌添加量的提高，斑點(diǎn)叉尾鮰的腸體比和肝體比都出現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，添加組的肥滿度都低于對(duì)照組，但差異不顯著[11]。飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)草魚的肥滿度、體質(zhì)量體長比、臟體比均沒有顯著影響，僅2 000 mg/kg組魚的肝體比顯著大于對(duì)照組[23]。飼料添加枯草芽孢桿菌對(duì)黑鯛的肝體指數(shù)沒有顯著影響[13]。本研究結(jié)果顯示，飼料中添加枯草芽孢桿菌后，方斑東風(fēng)螺的肥滿度、肉殼比、臟體比均沒有顯著變化，表明在基礎(chǔ)飼料的營養(yǎng)成分已能滿足東風(fēng)螺正常生長需要的情況下，其可食用部分，即肌肉部分的比例較為恒定，不受枯草芽孢桿菌添加的影響。枯草芽孢桿菌對(duì)形體指標(biāo)的影響可能與試驗(yàn)動(dòng)物以及菌種的差異有較大關(guān)系。

3.2枯草芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺肌肉組成的影響

斑點(diǎn)叉尾鮰的研究結(jié)果顯示，在飼料中添加300、500 mg/kg和700 mg/kg的枯草芽孢桿菌可使魚肌肉中粗蛋白質(zhì)與對(duì)照組相比分別提高了6.62%、11.00% 和10.36%[11]。但另外一些研究顯示，飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)體組成沒有顯著影響。攝食添加枯草芽孢桿菌的飼料的青魚魚種與對(duì)照組青魚魚種相比，其全魚營養(yǎng)組成均無顯著差異[17]。飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)黑鯛幼魚全魚和肌肉組成均沒有顯著影響[13]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，飼料中添加枯草芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺稚螺肌肉組成沒有顯著影響。

3.3枯草芽孢桿菌對(duì)方斑東風(fēng)螺免疫功能的影響

眾多研究已顯示，枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑可在一定程度上提高水產(chǎn)動(dòng)物的免疫功能和抗氧化活力。投喂添加枯草芽孢桿菌飼料的黑鯛幼魚血清總蛋白水平，及CAT、SOD活性顯著提高，肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性也顯著提高[13]。克氏原螯蝦（Procambarusclarkii）血細(xì)胞吞噬活性于投喂枯草芽孢桿菌后第7 d開始顯著高于對(duì)照組，溶菌活力、抗菌活力也顯著提高[24]。在飼料中添加0.25%枯草芽孢桿菌可顯著提高雜交鱘的血清溶菌酶、AKP、SOD活力及總抗氧化能力(T-AOC)[14]。然而，一些研究也發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌對(duì)不同的免疫指標(biāo)也有不同的作用效果。飼料中添加枯草芽孢桿菌可顯著提高凡納濱對(duì)蝦血清ACP和酚氧化物酶（PO）活力，而對(duì)血清SOD和過氧化物酶（POD）活力沒有顯著影響[18]。投喂添加枯草芽孢桿菌飼料的草魚血清中免疫球蛋白M、補(bǔ)體C3含量和AKP活性，血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白含量，白球比以及溶菌酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性無顯著變化，血清和肝胰臟中T-AOC、CAT、SOD活力以及肝胰臟中還原型谷胱甘肽（GSH）含量顯著升高[25]。在本研究組前期的研究中也發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.5%的枯草芽孢桿菌對(duì)東風(fēng)螺肝胰腺SOD和CAT活力沒有顯著影響，而顯著提高POD活力[10]。在本研究中，低濃度（2.34×105CFU/100 g）的枯草芽孢桿菌可顯著提高東風(fēng)螺肝胰腺SOD活力，3個(gè)濃度的枯草芽孢桿菌均對(duì)CAT和GR活力沒有顯著影響，最高濃度（2.34×109CFU/100 g）則顯著提高AKP和ACP活力。綜合生長性能指標(biāo)來看，在方斑東風(fēng)螺飼料中添加本研究所用的枯草芽孢桿菌菌粉，其濃度以2.34× 109CFU/100 g為宜。

枯草芽孢桿菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫功能和抗氧化活力的影響也可能受到養(yǎng)殖動(dòng)物、菌種以及環(huán)境條件的差異等各類因素的影響?？傮w而言，枯草芽孢桿菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長和免疫的作用機(jī)理是多方面的，各方面相互影響，且由于養(yǎng)殖對(duì)象自身特性的差異，應(yīng)用效果和適宜添加量也就有所差別。通過試驗(yàn)篩選適合某種水產(chǎn)動(dòng)物使用的高效菌種，并確定其適宜的添加范圍是目前最直接有效的途徑。

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（編輯：劉占，laramie_liu@139.com）

基金項(xiàng)目：海南省重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目[ZDXM20130047]；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金[ITBB2015ZY01；ITBB2015ZD03]

收稿日期：2015-11-10

通訊作者：王冬梅，研究員。

作者簡介：冼健安，博士，助理研究員，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料學(xué)、水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)及毒理學(xué)。

中圖分類號(hào)：S816.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-991X（2016）04-0005-05

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.04.002