陸　超　吳　磊　錢(qián)　芳　劉志輝*

（1南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南京　210029；2南京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南京　210046)

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芪雪浸膏劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

陸超1，2吳磊1錢(qián)芳1劉志輝1*

（1南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南京210029；2南京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南京210046)

摘要：目的研究并建立芪雪浸膏劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法采用薄層色譜法對(duì)芪雪浸膏劑中的黃芪、當(dāng)歸、虎杖、大黃、進(jìn)行定性鑒別；采用HPLC-ELSD法研究并建立芪雪浸膏劑中黃芪甲苷的含量測(cè)定方法。結(jié)果處方中4味中藥均能在薄層色譜中檢出，分離效果好，斑點(diǎn)清晰，陰性未見(jiàn)干擾。黃芪甲苷進(jìn)樣量在2.5～25 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r=0.999 2），平均回收率96.62%，RSD為1.42%（n=6）。結(jié)論建立的方法簡(jiǎn)便、可行、準(zhǔn)確，可為芪雪浸膏劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：芪雪浸膏劑；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜；高效液相色譜；黃芪甲苷

芪雪浸膏劑是根據(jù)江蘇省中醫(yī)院腎科孫偉教授的經(jīng)驗(yàn)方制成的醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，由黃芪、當(dāng)歸、虎杖、土茯苓、制大黃、積雪草等11味中藥組成，具有補(bǔ)腎活血祛濁之功效，臨床應(yīng)用治療慢性腎炎多年，療效顯著。本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜（TLC）法對(duì)該制劑中的4味飲片進(jìn)行了定性鑒別，并采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC-ELSD）法對(duì)君藥黃芪中的主要成分黃芪甲苷進(jìn)行了含量測(cè)定研究，為芪雪浸膏劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器Waters2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；Alltech-ELSD2000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（美國(guó)Alltech公司）；XWK-III無(wú)油空氣泵（天津市畢生分析儀器廠）；電子分析天平（BP-211D型，德國(guó)賽多利斯公司），醫(yī)用超聲波清洗儀（KQ-1000E型，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2試藥黃芪甲苷對(duì)照品（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，含量測(cè)定用，批號(hào)：110781-200613）；虎杖、大黃（藥用大黃）、當(dāng)歸、中國(guó)食品藥品檢定研究院，鑒別用，批號(hào)依次為：120980-201005、120984-201202、121341-201404）；黃芪對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，鑒別用，批號(hào)121462-201304）；硅膠G板（青島海洋化工）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

圖1　黃芪的薄層鑒別

圖2　當(dāng)歸的薄層鑒別

圖3　虎杖的薄層鑒別

圖4　大黃的薄層鑒別

2　方法與結(jié)果

2.1定性鑒別

2.1.1黃芪的TLC鑒別取芪雪浸膏劑12 g，加水100 ml使溶解，以水飽和正丁醇溶液振搖提取4次，每次40 ml，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次40 ml，棄去氨液，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。同法制備缺黃芪陰性對(duì)照溶液[1-2]。

取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取黃芪對(duì)照藥材1 g，加甲醇50 ml，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 ml使溶解，照供試品溶液制備方法，自“以水飽和正丁醇溶液振搖提取4次”起，依法制備對(duì)照藥材溶液。

照薄層色譜法（《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述四種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（10∶7∶2）的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性未見(jiàn)干擾。見(jiàn)圖1。

2.1.2當(dāng)歸的TLC鑒別取芪雪浸膏劑8 g，加水50 ml使溶解，稀鹽酸調(diào)pH值至2~3，用乙醚振搖提取2次，每次25 ml，合并提取液，揮干乙醚，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。同法制備缺當(dāng)歸陰性對(duì)照溶液[3]。

另取當(dāng)歸對(duì)照藥材0.5 g，加水30 ml，煎煮1 h，放冷，濾過(guò)，濾液備用。照供試品制備方法，自“稀鹽酸調(diào)pH值至2~3”起，依法制備對(duì)照藥材溶液。

照薄層色譜法（《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶1∶1∶0.1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，陰性未見(jiàn)干擾。見(jiàn)圖2。

2.1.3虎杖的TLC鑒別取芪雪浸膏劑6 g，加水50 ml使溶解，乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。同法制備缺虎杖陰性對(duì)照溶液[4]。

另取虎杖對(duì)照藥材0.5 g，加甲醇10 ml，超聲處理15 min，濾過(guò)，濾液濃縮至1 ml，即得。

照薄層色譜法（《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸（16∶3∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視?；⒄裙┰嚻飞V中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫色斑點(diǎn)，陰性未見(jiàn)干擾。見(jiàn)圖3。2.1.4大黃的TLC鑒別取芪雪浸膏劑12 g，加水50 ml使溶解，加鹽酸2 ml，加熱回流30 min，冷卻，用二氯甲烷振搖提取2次，每次40 ml，合并二氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? ml使溶解，作為供試品溶液。同法制備缺大黃陰性對(duì)照溶液[5]。

另取大黃對(duì)照藥材0.5 g，加甲醇20 ml，浸漬1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 ml使溶解，照供試品溶液的制備方法，自“加鹽酸2 ml”起，依法制備對(duì)照藥材溶液。

照薄層色譜法（《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸（30∶10∶0.5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈光（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同的橙黃色斑點(diǎn)，氨熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榧t色，陰性無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.2含量測(cè)定

2.2.1色譜條件色譜柱：Hedera C18 ODS-2(4.6 mm× 250 mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-水（33∶67）；流速：1.0ml·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量20 μL；ELSD-2000檢測(cè)器：漂移管溫度為102℃，載氣流量為2.7 L·min-1[6-9]。

2.2.2溶液的制備對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇定容，制成每1 ml含0.5 mg的對(duì)照品溶液，即得。

供試品溶液的制備取芪雪浸膏劑12 g，加水100 ml使溶解，以水飽和正丁醇振搖提取4次，每次40 ml，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次40 ml，棄去氨液，將正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓糜? ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。同法制成缺黃芪陰性溶液。

2.2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液和芪雪黃芪陰性溶液各20 μL，按上述色譜條件分別進(jìn)樣，HPLC圖譜見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，色譜峰基線平穩(wěn)，供試品與黃芪甲苷對(duì)照品在相同位置均有吸收，分離度良好且陰性無(wú)干擾，理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算不低于5000。

圖5　黃芪甲苷HPLC-ELSD色譜圖

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍取上述對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣5、10、20、30、40、50 μL，依法測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)X，響應(yīng)值的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，得回歸方程Y=1.693X+11.96，r=0.999 2(n=6)。結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6　黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

以上結(jié)果表明黃芪甲苷在2.5~25 μg范圍內(nèi)與峰面積進(jìn)樣量對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液15 μL，注入高效液相色譜儀中，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積積分值，結(jié)果以黃芪甲苷峰面積計(jì)RSD為1.86%，表明，儀器精密度良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　黃芪甲苷精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.6重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)的芪雪浸膏劑12 g，共6份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，依法測(cè)定，以黃芪甲苷含量計(jì)算樣品含量，RSD%為2.09%，表明該方法重復(fù)性良好。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　黃芪甲苷重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，按上述色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果按黃芪甲苷峰面積計(jì)算，RSD為1.99%，表明黃芪甲苷在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　黃芪甲苷穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8加樣回收試驗(yàn)精密量取已知黃芪甲苷含量的芪雪浸膏劑6 g，共6份，分別加入黃芪甲苷對(duì)照品(0.428 mg·mL-1)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取其中20 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果　?。╪=6）

2.2.9樣品含量測(cè)定取芪雪浸膏3批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，測(cè)定，計(jì)算。結(jié)果3批樣品黃芪甲苷含量分別為0.1458 mg·g-1、0.1392 mg· g-1、0.1415 mg·g-1。

3　討論

芪雪浸膏劑處方共含有11味藥材，成分極其復(fù)雜，不同的中藥可能含有相同的化學(xué)成分成分，本文建立的薄層鑒別方法，均采用對(duì)照藥材為對(duì)照，增強(qiáng)了定性鑒別的準(zhǔn)確性與可靠性，能較好地控制芪雪浸膏劑的質(zhì)量。

虎杖的薄層鑒別曾參考《藥典》方法[10]，用鹽酸加熱水解后，以二氯甲烷萃取，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)后晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視，并以氨熏蒸，結(jié)果陰性有干擾。改用乙酸乙酯振搖提取，并以三氯甲烷-丙酮-甲酸（16:3:1）為展開(kāi)劑，置日光下檢視，鑒別點(diǎn)清晰，陰性未見(jiàn)干擾。

本文的含量測(cè)定，主要測(cè)定的是黃芪甲苷。黃芪作為方中君藥，其有效成分之一黃芪甲苷是黃芪特有的生物活性成分，功能補(bǔ)脾養(yǎng)血，益氣生津，可改善心肺功能，擴(kuò)張血管，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等；故選擇黃芪甲苷作為該制劑含量測(cè)定的指標(biāo)，方法學(xué)考察表明所建立的方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可用于芪雪浸膏劑的質(zhì)量控制。

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2015年2月10日

Study on the quality standards of Qixue Concrete

LU Chao1,2,WU Lei1,QIAN Fang1,LIU Zhihui1*
(1.Department of Pharmacy,The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210029,China; 2.Graduate School of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210046,China)

Abstract:Objective To establish the quality standards for Qixue concrete.Methods Astragali Radix,Angelicae Sinensis Radix, Polygoni Cuspdati Rhizoma Et Radix,Smilacis Glabrae Rhizoma,Rhei Radix Et Rhizoma,Centeliae Herba and Abelmoschi Corolia in Qixue concrete were qualitatively identified by TLC.The content of astragalosideⅣwas determined by HPLC-ELSD.Results Six herbs could be identified by TLC,and the spots were clear and well-separated.The linear range of AstragalosideⅣwas 2.5～25.Μg (r=0.999 2),and the average recovery was 96.62%,RSD=1.42%(n=6).Conclusion The method is simple and accurate,and it can be used for the quality control of Qixue concrete.

Keywords:Qixue concrete;quality standard;TLC;HPLC;AstragalosideⅣ

收稿日期：（本文編輯：張文娟本文校對(duì)：朱敏2015-12-17）

*通訊作者：liuzh1008@126.com

doi:10.3969/j.issn.1672-2779.2016.04.066

文章編號(hào)：1672-2779（2016）-04-0135-04