鄔素珍，趙春梅，聶潤球

(佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院婦科，廣東佛山 528000)

陳氏內(nèi)異丸對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠黏附、侵襲病理機制影響的探討*

鄔素珍，趙春梅，聶潤球

(佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院婦科，廣東佛山 528000)

目的:觀察陳氏內(nèi)異丸對子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)大鼠血清可溶性細胞間黏附分子-1(sICAM-1)濃度和異位內(nèi)膜基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)表達的影響。方法:建立大鼠EMs模型，按隨機數(shù)字表法分為陳氏內(nèi)異丸高、中、低劑量組和丹那唑、模型對照、假手術組，末次給藥1周后采血檢測。結(jié)果:陳氏內(nèi)異丸能有效降低EMs大鼠血清sICAM-1濃度，抑制異位內(nèi)膜組織MMP-3的陽性表達。結(jié)論:抑制異位內(nèi)膜的黏附、侵襲最終抑制EMs的發(fā)展，可能是陳氏內(nèi)異丸治療EMs的作用機理之一。

子宮內(nèi)膜異位癥;陳氏內(nèi)異丸;大鼠;黏附分子-1;基質(zhì)金屬蛋白酶-3

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是具有侵襲性的良性病變，體外研究表明，脫落的子宮內(nèi)膜細胞于24 h之內(nèi)即黏附于腹膜上，進一步發(fā)生種植、侵襲形成異位病灶［1］?？扇苄约毎g黏附分子(sICAM)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是與細胞黏附、侵襲性生長機制密切相關的2種因子。本研究以丹那唑和蒸餾水為對照，觀察陳氏內(nèi)異丸對EMs大鼠血清sICAM-1濃度和異位內(nèi)膜MMP-3表達水平的影響，探討其治療EMs的作用機理。

1 材料與方法

1.1 動物

健康、未孕成熟的清潔級雌性SD大鼠120只，鼠齡60～80 d，體質(zhì)量200～250 g，購自廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心(許可證號 SCXK(粵)2008-0020)。

1.2 藥物

陳氏內(nèi)異丸由佛山市中醫(yī)院制劑中心提供(粵藥制字Z03140215)，臨用前磨碎，將陳氏內(nèi)異丸與蒸餾水分別配制成濃度為0.72 g/mL高劑量、0.36 g/mL中劑量、0.18 g/mL低劑量3種劑量的陳氏內(nèi)異丸溶液。丹那唑膠囊由江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(國藥準字H20023116)，將丹那唑膠囊內(nèi)容物與蒸餾水制成濃度為3.6 mg/mL的丹那唑混懸液，蒸餾水由佛山市中醫(yī)院制劑中心提供(批準文號277179)。

1.3 主要試劑與儀器

石蠟切片機(德國 LEICA)，包埋機(日本櫻花)，脫水機(英國三頓)，光學顯微鏡(日本Olympus)，顯微照相儀(尼康)，MMP-3相關免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。大鼠血清sICAM酶免試劑盒由大連泛邦技術開發(fā)有限公司進口分裝。

1.4 EMs大鼠模型建立

參照雷紅［2］造模方法，本實驗造模成功率為62%。

1.4.1 造模 于大鼠動情期進行手術，以1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉滿意后備皮;下腹正中縱行切口1.5 cm，逐層開腹找到左側(cè)宮角，剪下一段長約1 cm子宮體;揭除漿膜及大部分肌層，將黏膜切割成5×5 mm2的組織;將切割好的子宮黏膜面向下覆蓋腹壁表面，以“6-0”可吸收線于四角縫合固定在腹壁黏膜上;腹腔內(nèi)注入8×103u慶大霉素后逐層關腹;術后連續(xù)3 d肌注慶大霉素0.4萬U預防感染，并用碘伏消毒傷口，繼常規(guī)飼養(yǎng)4周。假手術組動物模型制作:麻醉、備皮方法同上，剖腹后關腹，術后處理同上。

1.4.2 二次剖腹探查 造模術后4周將大鼠逐一進行二次剖腹，探查造模情況。按前法麻醉、備皮、剖腹，檢查腹壁子宮內(nèi)膜移植物是否成活。觀察移植物體積增大，出現(xiàn)液體積聚、移植物被結(jié)締組織或大網(wǎng)膜覆蓋并有血管生成，部分移植物成黃色或褐色小結(jié)為造模成功。取4只肉眼證實造模成功的大鼠內(nèi)異病灶組織，以體積分數(shù)10%福爾馬林固定送檢病理，證實移植物中有子宮內(nèi)膜上皮細胞、腺體及間質(zhì)的生長并有分泌活動，說明造模成功。假手術組二次剖腹探查時僅行開關腹術。

1.5 分組及給藥 二次剖腹探查后4周，取造模成功大鼠50只按隨機數(shù)字表法分為5組各10只，分別為陳氏內(nèi)異丸中藥高、中、低劑量組和丹那唑組及模型組。本實驗低劑量組用藥相當于成人常規(guī)口服劑量。高、中、低劑量組按7.2、3.6、1.8 g· kg－1·d－1劑量給藥，丹那唑組按36 mg·kg－1·d－1劑量給藥，模型組和假手術組給予相同容積20 ml的蒸餾水，連續(xù)給藥4周。

1.6 標本提取

在末次給藥1周后抽內(nèi)眥靜脈血2 ml，1000 r/ min離心10 min后取上清液，－20℃冰箱保存?zhèn)錂z;進行第3次剖腹手術，剝?nèi)Ms大鼠內(nèi)異病灶組織，以體積分數(shù)10%甲醛固定，以備檢測MMP-3在大鼠異位內(nèi)膜的表達。

1.7 MMP-3表達結(jié)果判定

子宮內(nèi)膜腺上皮細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性染色。參照 Terry的標準［4］進行評分，即以陽性細胞百分率及顯色深淺的半定量評分值的和為最終評分標準:陽性細胞百分率評分:無細胞顯色為0;＜25%細胞顯色為1;25%～50%細胞顯色為2;＞50%細胞顯色為3;顯色深淺評分:不顯色或顯色不清為0;淺黃色為1;棕黃色為2;深褐色為3。2項評分相加為染色強度:0～1分為陰性(－)，2分為弱陽性(+)，3～4分為中度陽性(++)，5～6分為強陽性(+++)。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

灌胃過程中共死亡7只，總死亡率為11.86%;其中中藥高劑量組死亡3只，中劑量組死亡1只，低劑量組死亡1只，丹那唑組死亡2只。

2.2 血清sICAM-1結(jié)果

表1顯示，治療后陳氏內(nèi)異丸各劑量組及丹那唑組血清sICAM-1濃度明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義;陳氏內(nèi)異丸高、中劑量組血清sICAM-1濃度較丹那唑組低，差異有統(tǒng)計學意義;陳氏內(nèi)異丸各劑量組血清sICAM-1濃度與假手術組比較差異無統(tǒng)計學意義。

表1 治療后各組sICAM-1比較(±s，ng/ml)

表1 治療后各組sICAM-1比較(±s，ng/ml)

注:與模型組比較:＊P＜0.001，與丹那唑組比較:#P＜0.01，與丹那唑組比較:△P＜0.05

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2.3 MMP-3表達結(jié)果

表2圖1～6顯示，假手術組子宮內(nèi)膜腺上皮細胞呈陰性表達，模型組異位內(nèi)膜腺上皮細胞呈強陽性表達;中藥高、中劑量組及丹那唑組異位內(nèi)膜腺上皮細胞呈陰性表達;中藥低劑量組異位內(nèi)膜腺上皮細胞呈弱陽性表達。

表2 各組大鼠治療后異位內(nèi)膜組織MMP-3表達結(jié)果

表2顯示，陳氏內(nèi)異丸高、中劑量組及丹那唑組陽性強度低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義;但低劑量組陽性強度與模型對照組相當，差異無統(tǒng)計學意義;高、中劑量組陽性強度與丹那唑組相當，差異無統(tǒng)計學意義。

圖1 假手術組子宮內(nèi)膜(×200)

圖2 模型組異位內(nèi)膜(×200)

圖3 高劑量組異位內(nèi)膜(×200)

圖4 中劑量組異位內(nèi)膜(×200)

圖5 低劑量組異位內(nèi)膜(×200)

圖6 丹那唑組異位內(nèi)膜(×200)

3 討論

EMs自1860年首次發(fā)現(xiàn)至今其發(fā)病機制仍不清楚。目前各種發(fā)病機制中“種植學說”仍為主要學說之一。研究表明，子宮內(nèi)膜細胞在異位種植生長時，必須具備“3A模式”，即黏附(Attachment)、侵襲(Aggression)和血管生成(Angiogenesis)3個基本環(huán)節(jié)［3-5］，以此完成逆流內(nèi)膜細胞在盆腹腔腹膜、器官和組織的種植、生長，從而形成內(nèi)異病灶。

子宮內(nèi)膜成功在異位種植的首要步驟是通過一系列位于細胞表面的細胞黏附分子及與黏附相關的途徑所介導的內(nèi)膜細胞與種植部位的黏附［6］。閆桂英等［7］檢測到異位灶組織ICAM-1表達明顯高于其在位內(nèi)膜和對照組。另有研究者認為，內(nèi)膜間質(zhì)細胞表面脫落的ICAM-1在異位內(nèi)膜種植初期，在異位病灶逃避免疫監(jiān)視中起重要作用［8］。Matalliotakis等［9］發(fā)現(xiàn)，內(nèi)異癥患者的血清可溶性ICAM-1濃度高于正常者。Daniel等［10］也發(fā)現(xiàn)，中度到重度的內(nèi)異癥患者血漿和腹腔液中ICAM-1明顯升高。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是降解細胞外基質(zhì)的最重要因子，MMP-3在MMPs中尤為重要，它以酶原的形式釋放，由纖溶酶激活，不僅能夠降解細胞外基質(zhì)，更重要的是能激活其他MMPs的酶原形式。Cox［11］在異位癥動物實驗模型中發(fā)現(xiàn)，異位病灶中MMP-3呈過度表達，從而認為MMP-3參與組織的侵襲和重建，促進異位癥的發(fā)生發(fā)展。因此，異位內(nèi)膜組織中MMP-3的高表達，可能賦予異位內(nèi)膜特有的侵襲和種植的能力，是EMs發(fā)病的重要機制之一。

由此可見，血清sICAM-1濃度的高低及異位病灶MMP-3表達的強度可反映EMs發(fā)生發(fā)展“3A”過程的活躍程度。

中醫(yī)藥在治療子宮內(nèi)膜異位癥方面取得了顯著療效［12］。陳氏內(nèi)異丸是佛山市中醫(yī)院具有40多年臨床經(jīng)驗的中西醫(yī)結(jié)合婦科專家陳秀廉獻方生產(chǎn)的中成藥，已在臨床使用20多年，以活血化瘀、軟堅散結(jié)、理氣止痛、補腎固本立論組方，全方重在活血化瘀消癥。陳氏內(nèi)異丸的前期臨床研究表明［13-14］，其治療EMs有明顯的臨床療效，能顯著改善EMs患者痛經(jīng)、腰骶部不適、直腸刺激癥等癥狀。

本研究旨在進一步探討陳氏內(nèi)異丸對EMs的作用機制，結(jié)果顯示陳氏內(nèi)異丸能有效降低EMs模型大鼠的血sICAM-1濃度，并能降至正常水平，高、中劑量組療效優(yōu)于丹那唑組(高劑量組P＜0.01，中劑量組P＜0.05);陳氏內(nèi)異丸高、中劑量組能有效抑制異位病灶MMP-3的陽性表達，且與丹那唑組比較療效相當。

綜上表明，陳氏內(nèi)異丸能明顯降低EMs大鼠血sICAM-1濃度，并能抑制 EMs大鼠異位病灶中MMP-3的陽性表達，高、中劑量組療效尤其顯著。因此，陳氏內(nèi)異丸可降低異位病灶活性并有效治療EMs，其作用機制可能與通過免疫調(diào)節(jié)、抑制異位內(nèi)膜的黏附、侵襲、種植而達到清除異位病灶的作用有重要的關系。這一實驗結(jié)果為臨床使用陳氏內(nèi)異丸治療EMs提供了有力的依據(jù)。

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Investigation of Chenshi Neiyi Pill to the Adhesion，Invasion and Pathological Mechanism of Endometriosis Rats

WU Su-zhen，ZHAO Chun-mei，NIE Run-qiu
(Chancheng District Central Hospital of Foshan city，F(xiàn)oshan，Guangdong 528000，China)

Objective:To evaluate the effect of NeiYi Pill of Chen by the ICAM-1 concentration and expression of MMP-3 on endometriosis model in rats．Methods:To establish endometriosis model in rats．Results:NeiYi Pill of Chen can decrease the ICAM-1 concentration of endometriosis model in rats effectively．Conclusion:Inhibiting the adhesion and invasion of ectopic endometrium，eventually inhibiting the EMS development，may be one of NeiYi Pill of Chen theatment EMS mechanism of action．

Endometriosis;NeiYi Pill of chen;Rat;ICAM-1;MMP-3

R285．5

B

1006-3250(2016)01-0073-03

2015-04-16

廣東省中醫(yī)藥管理局基金項目(1060007)-陳氏內(nèi)異丸對子宮內(nèi)膜異位癥作用機制的實驗研究

鄔素珍(1965-)，女，廣東興寧人，主任醫(yī)師，教授，醫(yī)學學士，碩士研究生導師，從事子宮內(nèi)膜異位癥、不孕癥的臨床與研究。