梁玲，李勝活，陳子夢（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四附醫(yī)院，廣州510000）

外泌體在疾病診治作用中的研究進(jìn)展

梁玲，李勝活，陳子夢
（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四附醫(yī)院，廣州510000）

外泌體（Exosomes）是囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的主要組成部分之一，囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)對于細(xì)胞發(fā)揮多種功能活動起重要作用。釋放至細(xì)胞外面的Exosomes參與一系列生物過程，如免疫應(yīng)答、凋亡、血管生成、炎癥反應(yīng)、凝結(jié)過程、腫瘤轉(zhuǎn)移、動脈硬化、抗原提呈和治療受損器官等。諸多研究表明，不同細(xì)胞來源的Exosomes，通常含有相同的一套蛋白質(zhì)來調(diào)節(jié)膜骨架的動態(tài)性及膜融合；另外，Exosomes中還包含核酸物質(zhì)，統(tǒng)稱為eRNA，Exosomes的生物學(xué)功能通過其攜帶蛋白質(zhì)和miRNA等到達(dá)受體細(xì)胞而發(fā)揮調(diào)控作用。Exosomes可由樹突狀細(xì)胞、血小板、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等不同細(xì)胞類型分泌，并可在多數(shù)體液如外周血、尿液、唾液、羊水、乳汁、腦脊液、支氣管肺泡灌洗液等體液中檢測到。諸多研究表明Exosomes攜帶的mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)在疾病發(fā)生發(fā)展過程中會發(fā)生明顯變化，可作為疾病診斷的理想標(biāo)記物。在Exosomes治療疾病研究方面，目前比較關(guān)注的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞來源Exosomes的治療作用。

外泌體；腫瘤免疫；腫瘤血管新生；診斷；治療

外泌體（Exosomes）是由多種細(xì)胞分泌的40～100 nm的膜性小囊泡，由細(xì)胞內(nèi)多泡體（MVE）出芽形成，再與細(xì)胞膜融合后釋放至細(xì)胞外基質(zhì)中。細(xì)胞間的通訊可通過Exosomes攜帶mRNA、microRNA （miRNA）和蛋白質(zhì)等到達(dá)受體細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用。目前研究表明Exosomes攜帶的蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA與機(jī)體及細(xì)胞的生理疾病狀態(tài)密切相關(guān)，是潛在的理想生物標(biāo)志物。另外，干細(xì)胞分泌的Exosomes是干細(xì)胞發(fā)揮治療作用的主要作用機(jī)制之一，樹狀突細(xì)胞的Exosomes還具有抗腫瘤免疫、促進(jìn)腫瘤血管新生等生理功能。經(jīng)過國內(nèi)外科學(xué)家的努力，目前在Exosomes領(lǐng)域的研究取得較大進(jìn)展?，F(xiàn)將Exosomes在疾病診治中的研究進(jìn)展綜述如下。

1 Exosomes的生物學(xué)特征

Exosomes是細(xì)胞分泌的一類40～100 nm的膜性小囊泡，是囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的主要組成部分之一。囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)對于細(xì)胞發(fā)揮多種功能活動起重要作用，James等因發(fā)現(xiàn)細(xì)胞囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控機(jī)制而獲得2013年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎［1］。在囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，根據(jù)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中所處的位置不同將囊泡分為早期內(nèi)涵體（EE）、晚期內(nèi)涵體（LE）和循環(huán)內(nèi)涵體（RE）［2］。其中，晚期內(nèi)涵體會形成多泡體，多泡體進(jìn)一步分泌一類直徑為40～100 nm的膜性囊泡——Exosomes［3］。釋放至細(xì)胞外面的Exosomes參與一系列生物過程，如免疫應(yīng)答、凋亡、血管生成、炎癥反應(yīng)、凝結(jié)過程、腫瘤轉(zhuǎn)移、動脈硬化、抗原提呈和治療受損器官等［4］。諸多研究表明，不同細(xì)胞來源的Exosomes，通常含有相同的一套蛋白質(zhì)來調(diào)節(jié)膜骨架的動態(tài)性以及膜融合，這類蛋白如GTP酶的Rab家族、Alix、ESCRT蛋白、熱休克蛋白、膜聯(lián)蛋白等；另外，Exosomes中還包含核酸物質(zhì)，統(tǒng)稱為eRNA，Exosomes的生物學(xué)功能通過其攜帶蛋白質(zhì)和miRNA等到達(dá)受體細(xì)胞而發(fā)揮調(diào)控作用［5］。Exosomes可由樹突狀細(xì)胞（DC）、血小板、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等不同細(xì)胞類型分泌，并可在多數(shù)體液如外周血、尿液、唾液、羊水、乳汁、腦脊液、支氣管肺泡灌洗液等體液中檢測到［6］。諸多研究表明Exosomes攜帶的mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)在疾病發(fā)生發(fā)展過程中會發(fā)生明顯變化，可作為疾病診斷的理想標(biāo)記物。并且將Exosomes從體液中分離出來用于監(jiān)測，顯著降低了樣品復(fù)雜性，有利于生物標(biāo)志物的檢出。因此，Exosomes為疾病診斷及標(biāo)志物的探索提供了一個(gè)全新的思路和方向。不同細(xì)胞分泌的Exosomes會有不同的功能。在Exosomes治療疾病研究方面，目前比較關(guān)注的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）和DC來源Exosomes的治療作用。

2 Exosomes中的miRNA對疾病的診斷作用

miRNA是一類長度為18～25 nt的小分子非編碼小RNA，廣泛存在于真核細(xì)胞中，能通過降解靶mRNA或抑制其翻譯，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化與凋亡，參與個(gè)體發(fā)育、機(jī)體代謝及腫瘤發(fā)生等。諸多研究已表明miRNA可作為腫瘤、肌肉損傷、炎癥等多種疾病的生物標(biāo)志物［7］。目前有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miRNA可選擇性組裝到Exosomes中，然后穩(wěn)定存在于患者的血液、尿液和其他體液中，更有意義的是miRNA數(shù)量和組成在患者和正常人中存在差異，與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為疾病診斷的理想標(biāo)記物。

在腫瘤標(biāo)記物研究方面，Huang等［8］發(fā)現(xiàn)Exosomes中的let-7a、miR-1229、miR-1246、miR-150、miR-21、miR-223和miR-23a與結(jié)腸癌的發(fā)生密切相關(guān)。Kawata等［9］發(fā)現(xiàn)Exosomes中的miR-1290、miR-375可作為去勢難治性前列腺癌的診斷標(biāo)記物。Riccardo和他的同事篩選肺癌和正常吸煙者血清Exosomes中的差異miRNAs，發(fā)現(xiàn)miR-378a、miR-379、miR-139-5p和miR-200b-5p可用于鑒定肺癌和正常吸煙者，另外，他們還發(fā)現(xiàn)miR-151a-5p、miR-30a-3p、miR-200b-5p、miR-629、miR-100和miR-154-3p可用于區(qū)分肺腺癌和肺肉芽腫瘤患者［10］。有學(xué)者比較腫瘤和Exosomes中miR-17-3p、miR-21、miR-106a、miR-146、miR-155、miR-191、miR-192、miR-203、miR-205、miR-210、miR-212和miR-214的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)腫瘤中的表達(dá)情況和Exosomes中的表達(dá)情況無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即檢測Exosomes中的差異miRNA可反映腫瘤實(shí)際情況，可作為腫瘤診斷標(biāo)記物。Huang等［11］對前列腺癌患者血清中Exosomes 的RNA進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)在前列腺癌患者中miR-1290和miR-375呈高表達(dá)，且miR-1290和miR-375的表達(dá)與生存期密切相關(guān)。Cazzoli等［12］發(fā)現(xiàn)Exosomes中存在的差異miRNA分子和蛋白質(zhì)可作為肺癌的篩查和診斷標(biāo)記物，敏感性和特異性分別可達(dá)96.0%和76.0%。Roccaro等［13］通過microRNA芯片分析正常人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞Exosomes的miRNA組成，發(fā)現(xiàn)miR-15a在多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的Exosomes中明顯下調(diào)，并進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)他們與多發(fā)性骨髓瘤的特性密切相關(guān)。

在急性冠脈綜合征研究方面，Kuwabara等［14］發(fā)現(xiàn)Exosomes中的miR-1和miR-133a在急性冠脈綜合征患者中明顯升高，可作為其檢查的特異性標(biāo)記物。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)相對于正常人，心肌梗死患者尿液和血清Exosomes中miR-1和miR-208l的水平均明顯升高。在腎臟病研究方面，Lv等［15］通過RT-PCR檢測miR-29、miR-200在慢性腎病患者健康人尿液Exosomes中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示miR-29水平明顯下降，ROC曲線結(jié)果顯示AUC為0.902，提示MicroRNA-29c對慢性腎病有較高的診斷價(jià)值。Wang等［16］發(fā)現(xiàn)IgA腎病患者尿液Exosomes中的miR-200a、miR-200b和miR-429明顯減少，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其減少的程度與疾病的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。Lv等［17］發(fā)現(xiàn)尿液Exosomes中的CD2AP mRNA是腎臟疾病的診斷標(biāo)記物，他們分別收集了32例腎臟疾病患者和7例健康人的尿液，并分離Exosomes及其RNA，然后通過RT-PCR檢測CD2AP、NPHS2和synaptopodin的mRNA水平，結(jié)果顯示CD2AP mRNA水平在患者中明顯下降，ROC曲線分析結(jié)果顯示AUC值為0.821（P=0.008），說明Exosomes中的CD2AP mRNA對腎臟疾病的診斷有較高價(jià)值。

3 Exosomes中蛋白質(zhì)對疾病的診斷作用

蛋白質(zhì)組學(xué)是一門大規(guī)模、高通量、系統(tǒng)化的研究某一類型細(xì)胞、組織或體液中的所有蛋白質(zhì)組成及其功能的新興學(xué)科，是對蛋白質(zhì)翻譯和修飾水平等研究的一種補(bǔ)充，是全面了解基因組表達(dá)的一種必不可少的手段。目前在Exosomes研究領(lǐng)域，可通過蛋白質(zhì)組學(xué)全面分析Exosomes中蛋白質(zhì)的組成，從而更加全面了解Exosomes的功能及作用靶點(diǎn)，同時(shí)對探索疾病的標(biāo)記物有重要意義。

在腫瘤研究方面有學(xué)者通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者尿液Exosomes中存在的差異蛋白可用于膀胱癌的早期診斷，并且證實(shí)Exosomes中的差異蛋白和膀胱癌組織間存在高度相關(guān)性。Roccaro等［17］通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析正常人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的Exosomes蛋白質(zhì)組成差異，發(fā)現(xiàn)IL-6、CCL2和fibronectin在多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中明顯上調(diào)，并進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)他們與多發(fā)性骨髓瘤的特性密切相關(guān)。

在其他疾病研究方面，有學(xué)者分別比較了帕金森患者和正常人尿液Exosomes中LRRK2或DJ-1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在正常人和帕金森患者中差異不是很明顯，但當(dāng)按照性別分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)在男性帕金森患者中的DJ-1表達(dá)情況有明顯差異。有學(xué)者構(gòu)建小鼠肝臟損傷模型，收集其尿液提取Exosomes進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)28種未曾在Exosomes中報(bào)道過但與疾病密切相關(guān)的蛋白，其中Cd26、Cd81、Slc3A1和Cd10可作為肝臟損傷的標(biāo)記物。有學(xué)者分別檢測HIV陽性患者血清Exosomes和無Exosomes血清中21個(gè)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞因子在HIV陽性患者血清Exosomes中的相對表達(dá)量明顯升高，是HIV潛在的檢測標(biāo)記物。

4 MSC來源Exosomes對疾病的治療作用

干細(xì)胞是一類未充分分化、具有自我更新、多向分化潛能的細(xì)胞，主要包括胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞等，它們?yōu)槟壳芭R床難以治療的重大疾病提供了一種新的治療方法［18，19］。其中MSC具有取材方便、應(yīng)用廣泛和免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，是目前干細(xì)胞應(yīng)用研究的熱點(diǎn)［20，21］。至于MSC治療疾病的機(jī)制，主要與其定向分化和旁分泌功能有關(guān)。有研究者發(fā)現(xiàn)從現(xiàn)在干細(xì)胞治療的動物實(shí)驗(yàn)或臨床試驗(yàn)觀察到的獲益主要來源于干細(xì)胞的旁分泌效應(yīng)［22］，其中Exosomes是目前細(xì)胞旁分泌的主要研究熱點(diǎn)，諸多研究已證實(shí)干細(xì)胞修復(fù)器官的功能與其分泌的Exosomes密切相關(guān)。既往多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，MSC培養(yǎng)上清可能是通過生長因子、細(xì)胞因子等旁分泌效應(yīng)對損傷組織起修復(fù)作用［23］。

在腎臟損傷治療方面，Bruno等［24］發(fā)現(xiàn)MSC來源的Exosomes對甘油誘導(dǎo)的SCID鼠急性腎損傷模型具有保護(hù)作用，其修復(fù)能力與其母體細(xì)胞無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2011年該課題組通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MSC來源的Exosomes對缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的非SCID SD大鼠急性腎功能損傷有保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)組血清中的BUN和Cr水平明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若預(yù)先用RNase處理Exosomes，雖然Exosomes的體積和表面黏附分子表達(dá)未發(fā)生變化，但Exosomes卻失去了腎臟保護(hù)作用，這提示Exosomes的腎保護(hù)作用可能通過RNA實(shí)現(xiàn)。Wang等［25］研究發(fā)現(xiàn)，與缺血再灌注組相比，MSC處理的缺血再灌注組、MSC來源Exosomes處理的缺血再灌注組BUN水平明顯下降、凋亡細(xì)胞明顯減少、炎癥因子水平明顯下降。

在皮膚創(chuàng)面治療方面，有學(xué)者構(gòu)建了SD大鼠皮膚深Ⅱ度燒傷模型和體外皮膚細(xì)胞燒傷模型，然后用來源于MSC的Exosomes進(jìn)行治療，以肺成纖維細(xì)胞的Exosomes作為對照組，發(fā)現(xiàn)經(jīng)MSC的Exosomes治療后，SD大鼠皮膚深Ⅱ度燒傷模型的創(chuàng)面愈合率、細(xì)胞存活、上皮化情況和PCNA表達(dá)情況明顯優(yōu)于對照組。同樣體外皮膚細(xì)胞燒傷模型的增殖情況、存活率和PCNA表達(dá)情況明顯優(yōu)于對照組。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的Exosomes通過激活wnt4/β-catenin和AKT通路促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合。Zhang等［26］利用人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞起源MSC的Exosomes注射于大鼠創(chuàng)面周圍皮下，結(jié)果顯示MSC的Exosomes可促進(jìn)上皮化，減少痂皮寬度，促進(jìn)膠原成熟、促進(jìn)新生血管形成和促進(jìn)創(chuàng)面成熟。同樣，在體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞起源MSC的Exosomes以劑量依賴方式刺激人真皮成纖維細(xì)胞和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，另外，Ⅰ、Ⅲ型膠原和彈性蛋白分泌及mRNA表達(dá)亦隨Exosomes濃度增加而增加。

在心肌梗死治療方面，F(xiàn)eng等［27］發(fā)現(xiàn)經(jīng)預(yù)缺氧的MSC可分泌攜帶有miR-22的Exosomes作用于心肌細(xì)胞的靶基因Mecp2從而保護(hù)心肌細(xì)胞，保護(hù)心肌缺血模型。在肝臟損傷治療方面，Tan等［28］用來源于MSC的Exosomes和四氯化碳（CCl4）一起注射到小鼠中，發(fā)現(xiàn)Exosomes可減輕CCl4對肝臟的損害，進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的存活率和PCNA表達(dá)量明顯優(yōu)于對照組。說明在MSC修復(fù)靶器官過程中Exosomes旁分泌效應(yīng)有重要作用。

5 DC來源Exosomes對疾病的治療作用

DC是目前功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，能刺激初始型T細(xì)胞增殖，激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答。近年來，DC釋放的有生物學(xué)活性的Exosomes引起了人們極大興趣，其顯示出呈遞生物相關(guān)抗原、具有免疫治療作用的特性。有研究發(fā)現(xiàn)成熟DC分泌的Exosomes （mDex）激活抗原特異性T細(xì)胞的能力比未成熟DC分泌的Exosomes（imDex）強(qiáng)，進(jìn)一步比較其分子組成顯示，與imDex相比，mDex含較豐富的B7.2、MFG-E8較少且?guī)缀鯚oFasL［29］。任亞娜等［30］發(fā)現(xiàn)DC來源的Exosomes可通過其表面分子引起T細(xì)胞免疫應(yīng)答，他們通過實(shí)驗(yàn)阻斷DC來源Exosomes上部分分子（CD11a、CD11b、CD11c、CD54、MFG-E8及CD83）后檢測Exosomes免疫學(xué)功能，結(jié)果顯示阻斷這些分子均能不同程度地抑制Dex對T細(xì)胞刺激的作用。

綜上所述，Exosomes的發(fā)現(xiàn)豐富了我們對細(xì)胞間通訊方式的認(rèn)識，有利于加深我們對機(jī)體生理、病理過程的理解。目前對Exosomes的研究主要集中于疾病的標(biāo)記物探索及對疾病的治療作用上。但介導(dǎo)相應(yīng)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)入Exosomes的轉(zhuǎn)運(yùn)信號機(jī)制仍不清楚，且Exosomes的分泌機(jī)制、融合機(jī)制亦需進(jìn)一步研究，才能更好地將其利用于研究或臨床應(yīng)用中。

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R730

A

1002-266X（2016）25-0107-04

廣州市屬高?？蒲许?xiàng)目（1201430440）。

李勝活（E-mail：chrisleeone@qq.com）

2016-03-24）