曾小峻，陶華林，汪碧瓊，于卉（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000）

人類(lèi)肝癌細(xì)胞HepG2、Bel-7402和Li-7植入裸鼠體內(nèi)后微量蛋白表達(dá)分析

曾小峻，陶華林，汪碧瓊，于卉
（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000）

目的 探討HepG2、Bel-7402和Li-7不同肝癌細(xì)胞系在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)過(guò)程中血清蛋白譜的表達(dá)情況，尋求與肝癌早期診斷相關(guān)的微量蛋白標(biāo)志物。方法 將40只BALB/cA-nu裸鼠隨機(jī)均分為4組，分別為HepG2、Li-7和Bel-7402組以及對(duì)照組，對(duì)HepG2、Bel-7402和Li-7三種癌細(xì)胞分別進(jìn)行培養(yǎng)和傳代，制備濃度為1.5×107/ mL癌細(xì)胞懸液，在每組裸鼠皮下分別注射相應(yīng)的癌細(xì)胞懸液0.2 mL，對(duì)照組注射RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，觀察裸鼠的生長(zhǎng)情況，于注射后20、40和60 d通過(guò)摘眼球法采集裸鼠血液樣本，用表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（SELDI-TOF-MS）檢測(cè)微量蛋白譜，采用Ciphergen ProteinChip 3.0和Ciphergen Biomaker Wizard 3.1軟件和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS16.0對(duì)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出差異性蛋白。結(jié)果 HepG2組將HepG2細(xì)胞注射裸鼠后，在裸鼠血清中出現(xiàn)29個(gè)差異蛋白，規(guī)律變化明顯的有8個(gè)，其中上調(diào)的有5個(gè)，下調(diào)的有3個(gè)。Li-7組將Li-7細(xì)胞注射裸鼠后，出現(xiàn)12個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中表達(dá)增強(qiáng)的有7個(gè)，表達(dá)減弱的有5個(gè)。Bel-7402組將Bel-7402細(xì)胞注射裸鼠后，血清中出現(xiàn)5個(gè)差異蛋白，其中表達(dá)增強(qiáng)的有4個(gè)，表達(dá)減弱的有1個(gè)。結(jié)論 不同類(lèi)型的肝癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生不同的微量差異蛋白，這些蛋白經(jīng)鑒定、檢測(cè)開(kāi)發(fā)有望成為臨床不同細(xì)胞類(lèi)型肝癌早期診斷的蛋白標(biāo)志物。

肝腫瘤；表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀；蛋白質(zhì)組學(xué)；差異性蛋白；質(zhì)荷比；裸鼠

肝癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率逐年上升，其病因與誘因多種多樣，尤其肝細(xì)胞性肝癌（HCC），病死率高［1］。肝癌實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)主要有甲胎蛋白（AFP）及其異質(zhì)體、血清酶、異常凝血酶原、鐵蛋白等，但上述指標(biāo)均有一定局限性，尤其敏感性和特異性在不同細(xì)胞類(lèi)型的肝癌早期診斷中效果不佳，如何尋找肝癌早期診斷指標(biāo)是目前倍受關(guān)注的問(wèn)題之一［2，3］。2013年3月～2015年5月，我們通過(guò)在裸鼠皮下注射人類(lèi)不同類(lèi)型的肝癌細(xì)胞HepG2、Bel-7402和Li-7，分析在裸鼠體內(nèi)與肝癌相關(guān)的蛋白表達(dá)情況?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 BALB/cA-nu裸鼠40只，4周齡，均為雌性，購(gòu)于重慶騰鑫科技公司。HepG2、Li-7和Bel-7402細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。主要試劑和儀器：RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基（GIBCO BRL公司，美國(guó)），胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司），二甲基亞砜、甲醇、三氟乙酸、芥子酸、乙腈、HPLC級(jí)超純水等（美國(guó)Sigma公司），臺(tái)式高速離心機(jī)（安亭科學(xué)儀器廠，中國(guó)），二氧化碳恒溫孵育箱（Thermo，美國(guó)），超低溫冰箱（Thermo，美國(guó)），H50蛋白芯片（Ciphergen，美國(guó)），PBSⅡ/C型蛋白指紋圖譜分析儀（Ciphergen公司，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 肝癌細(xì)胞株經(jīng)復(fù)蘇后加入配制好的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液（90%RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基+10%胎牛血清）約5 mL，擰松瓶蓋置于恒溫孵箱（37℃，5%CO2）中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁面積大于80%時(shí)，立即傳代，棄原有培養(yǎng)液，PBS工作液洗滌2次，加入約1 mL的胰酶細(xì)胞消化液，將瓶底完全覆蓋，待細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變圓，細(xì)胞間隙增大時(shí)，立即棄去胰酶細(xì)胞消化液，加入培養(yǎng)液以終止消化，用吸管將細(xì)胞輕輕吹打下來(lái)，使其分散開(kāi)，成為單個(gè)細(xì)胞懸液。根據(jù)具體情況，將細(xì)胞懸液傳至2 ～3個(gè)新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，同時(shí)加入新的培養(yǎng)液，使總液體維持在5 mL左右，隨后，擰松瓶蓋輕放入孵箱并輕晃培養(yǎng)瓶使細(xì)胞均勻分散于瓶底。

1.3 癌細(xì)胞懸液制備 選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2、Bel-7402和Li-7細(xì)胞，按照細(xì)胞傳代的步驟進(jìn)行消化，離心（4 000 r/min，3 min）后棄上清液，加入RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基（無(wú)胎牛血清）重懸細(xì)胞，隨后混勻計(jì)數(shù)，配制濃度約為1.5×107/mL的癌細(xì)胞懸液。

1.4 細(xì)胞分組及處理 將40只BALB/cA-nu雌性裸鼠隨機(jī)均分為4組，分別為HepG2組、Bel-7402組、Li-7組和對(duì)照組，每組裸鼠分別用相應(yīng)的癌細(xì)胞懸液（1.5×107/mL）作皮下接種，劑量為0.2 mL，對(duì)照組接種RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.5 裸鼠血清標(biāo)本微量蛋白譜測(cè)定 各種癌細(xì)胞注射裸鼠后，分別于第20、40和60天時(shí)，采用摘取眼球法采集血標(biāo)本，待血液凝固后離心（6 min，6 000 r/min），將獲得的血清分裝在新的Eppendof管中，做好標(biāo)記，凍存于超低溫冰箱中備用。委托北京伯奧克蛋白指紋圖譜技術(shù)有限公司檢測(cè)微量蛋白譜。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用Ciphergen ProteinChip3.0和Ciphergen Biomaker Wizard 3.1軟件和對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出差異性蛋白，對(duì)兩組樣本進(jìn)行差異表達(dá)增強(qiáng)或減弱的質(zhì)荷比（M/Z）計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 HepG2細(xì)胞注射裸鼠皮下后血清中蛋白表達(dá)HepG2組將HepG2癌細(xì)胞注射裸鼠后，血清中出現(xiàn)29個(gè)差異蛋白，規(guī)律變化較強(qiáng)的有8個(gè)，其中上調(diào)的有5個(gè)，M/Z分別為3 701.15、4 560.87、8 169.14、8 258.08和1 2047.4；下調(diào)的有3個(gè)，M/Z分別為1 025.35、1 045.15和4 319.54。

2.2 Li-7細(xì)胞注射裸鼠皮下后血清中蛋白表達(dá)Li-7細(xì)胞注射裸鼠后，在Li-7組和對(duì)照組中同時(shí)出現(xiàn)12個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中表達(dá)增強(qiáng)的有7個(gè)，M/ Z分別為1 087.44、1 179.59、1 192.62、1 483.17、1 563.21、6 646.16和3 763.01，表達(dá)減弱的有5個(gè)，M/Z分別為1 027.39、3 869.26、4 319.54、8 793.72和9 259.75。

2.3 Bel-7402細(xì)胞注射裸鼠皮下后血清中蛋白表達(dá) Bel-7402細(xì)胞注射裸鼠后，在Bel-7402組和對(duì)照組裸鼠血清中同時(shí)出現(xiàn)的差異蛋白有5個(gè)，其中表達(dá)增強(qiáng)的有4個(gè)蛋白，M/Z分別為2 016、3 309、3 442、3 745，表達(dá)減弱的有1個(gè)蛋白，M/Z為2 747。

3 討論

在病理分類(lèi)中，每一種腫瘤均有不同的亞型，其臨床表現(xiàn)和治療方法均存在差異，同一種腫瘤，細(xì)胞系也存在多個(gè)，不同細(xì)胞系的腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，在體內(nèi)的蛋白表達(dá)是否有差異，為了給臨床腫瘤早期診斷和治療提供更多的依據(jù)，全面了解腫瘤的特征，本研究根據(jù)中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心所提供的肝癌細(xì)胞系的情況，針對(duì)HepG2、Li-7和Bel-7402三種肝癌細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)情況進(jìn)行研究。

HepG2、Li-7和Bel-7402三種肝癌細(xì)胞在裸鼠中的致瘤性不同，只有Bel-7402肝癌細(xì)胞具有致瘤性，其他兩種細(xì)胞均不致瘤，可能原因：①每個(gè)作者研究所用裸鼠的品種及性別不完全相同；②有的研究使用的是自己實(shí)驗(yàn)室保存的細(xì)胞系，可能是細(xì)胞在長(zhǎng)期傳代過(guò)程中，出現(xiàn)了變異，造成其在裸鼠中致瘤的現(xiàn)象，亦可能是長(zhǎng)期使用的細(xì)胞受到了其他腫瘤細(xì)胞的污染，使其具有了對(duì)裸鼠的致瘤特性；③有的肝癌細(xì)胞可能存在亞型，如國(guó)外有的作者使用的Li-7細(xì)胞形態(tài)與本研究所用細(xì)胞形態(tài)不同，表現(xiàn)出致瘤性不一。

同種腫瘤的不同細(xì)胞系代表了這種腫瘤的不同特性，它們之間在某些特性上可能存在差異，正如肝母細(xì)胞瘤和肝內(nèi)膽管癌，它們同屬于肝癌，是肝癌的不同亞型，但它們?cè)谂R床表現(xiàn)和治療上均有差異，同時(shí)本研究結(jié)果顯示，HepG2、Li-7和Bel-7402三種肝癌細(xì)胞注射到裸鼠皮下后，在裸鼠血清中出現(xiàn)不同的微量蛋白表達(dá)，說(shuō)明在不同細(xì)胞類(lèi)型肝癌的早期診斷中應(yīng)采用不同的腫瘤標(biāo)志物，以提高臨床肝癌早期診斷的特異性。

SELDI-TOF-MS是蛋白組學(xué)研究的一種新技術(shù)，尚處在發(fā)展階段，尤其檢測(cè)過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)化、如何解決激光的衰減給結(jié)果帶來(lái)的影響等還需進(jìn)一步完善，但其為我們篩選疾病的早期診斷指標(biāo)提供了新思路，具有高通量、高靈敏度的特點(diǎn)，不僅可作為篩選指標(biāo)診斷疾病的工具，亦是重要的科研手段。本研究所獲得的這些差異蛋白，很有潛力成為疾病的篩選指標(biāo)，特別有助于腫瘤疾病的早期診斷。

［1］Xia H，Chen J，Shi M，et al.The over-expression of survivin enhances the chemotherapeutic efficacy of YM155 in human hepatocellular carcinoma［J］.Oncotarget，2015，6（8）：5990-6000.

［2］Zeng X，Tao H.Diagnostic and prognostic serum marker of cholangiocarcinoma［J］.Oncol Lett，2015，9（1）：3-8.

［3］Li X，Zou K，Gou J，et al.Effect of baicalin-copper on the induction of apoptosis in human hepatoblastoma cancer HepG2 cells［J］. Med Oncol，2015，32（3）：72.

［4］周薇，戴奇剛，鄧鑫，等.EGCG對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2裸鼠移植瘤COX-2、VEGF和bFGF表達(dá)的調(diào)控［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2013，34（3）：364-370.

［5］于卉，陶華林.肝癌實(shí)驗(yàn)室診斷的研究進(jìn)展［J］.瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，36（3）：305-307.

［6］常林，楊瑞麗.肝癌實(shí)驗(yàn)室診斷研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通訊，2010，21（1）：136-138.

［7］羅福東，丁海明.腫瘤標(biāo)志物聯(lián)檢對(duì)原發(fā)性肝癌診斷的研究進(jìn)展［J］.國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)，2010，16（1）：122-124.

［8］李軍，李福濤，開(kāi)麗，等.采用HepG2細(xì)胞株建立裸鼠肝癌模型的方法［J］.四川生理科學(xué)雜志，2002，24（2）：80-81.

［9］Genda T，Sakamoto M，Ichida T，et al.Cell motilitymediated by rho and Rho-associatedprotein kinase plays a critical role in intrahepatic metastasis of human hepatocellular carcinoma［J］.Hepatol，1999，30（4）：1027-1036.

［10］Takamura M，Sakamoto M，Genda T，et al.Inhibition of Intrahepatic Metastasis of Human HepatocellularCarcinoma by Rho-Associated Protein Kinas Inhibitor Y-27632［J］.Hepatol，2001，33（3）：577-581.

［11］陶華林，汪碧瓊，楊洋.SELDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)鼻咽癌裸鼠移植模型早期蛋白組學(xué)研究［J］.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，24（5）：21-25.

Expression of microproteins in nude mice injected with hepatoma cell lines of HepG2，Bel-7402 and Li-7

ZENG Xiaojun，TAO Hualin，WANG Biqiong，YU Hui
（The Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou 646000，China）

Objective To investigate the serum proteinogram of hepatoma cell lines（HepG2，Bel-7402 and Li-7）which grow in the nude mice in order to find the microprotein markers which are associated with early diagnosis of hepatoma.Methods We classified 40 BALB/cA-nu nude mice into 4 groups randomly and marked them as HepG2 group，Li-7 group，Bel-7402 group and control group，respectively.Three types of hepatoma cell lines（HepG2，Bel-7402 and Li-7）were cultured and the cells were prepared into cell suspension（1.5×107/ml），respectively.We injected the cell suspension into the relevant groups with 0.2 mL in every mouse and the control group was injected with RPMI1640 medium. These nude mice were observed for 2 months and we got their blood on the 20th，40th，60th day by eyeball extirpating.We detected the proteinogram using surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry（SELDI-TOFMS）and then，we analyzed the data by Ciphergen ProteinChip 3.0 and Ciphergen Biomaker Wizard 3.1 and SPSS 16.0 to screen the differentiated proteins.Results After the mice in HepG2 group were injected with cell line HepG2，there were 29 differentiated proteins.Among them，8 proteins changed significantly and 5 proteins were up-regulated and 3 were downregulated.After the mice in Li-7 group were injected with cell line Li-7，there were 12 differentiated proteins.Among them，7 proteins enhanced，and 5 proteins weakened.After the mice in Bel-7402 group were injected with cell line Bel-7402，there were 5 differentiated proteins.Among them，4 proteins enhanced and 1 protein weakened.Conclusions Different subtypes of hepatoma cell lines injecting into nude mice can express different microproteins in the serum of mice. These proteins could be identified and detected to be promising markers of different subtypes of hepatoma for the early diag-nosis.

liver neoplasms；surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry；proteomics；differential protein；mass-to-charge ration；nude mice

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.002

R735.7

A

1002-266X（2016）25-0005-03

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013JY0102）。

曾小峻（1989-），女，技師，主要研究方向?yàn)槟[瘤分子診斷。E-mail：393461933@qq.com

簡(jiǎn)介：陶華林（1964-），男，主任技師，主要研究方向?yàn)槟[瘤蛋白組學(xué)。E-mail：lzyxyjyx@163.com

2016-01-22）