王軍，陳鵬（山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟南250033）

姜黃素對骨肉瘤U2OS細胞系增殖、凋亡及侵襲的影響

王軍，陳鵬
（山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟南250033）

目的 探討姜黃素對人骨肉瘤U2OS細胞系增殖、凋亡及侵襲的影響。方法 取處于對數(shù)生長期的人骨肉瘤U2OS細胞，隨機分為4組，A、B、C、D組分別加入PBS緩沖液、姜黃素5、10、20 μmol/L，采用MTT法測算各組細胞生長抑制率，流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡情況，Transwell細胞侵襲實驗觀察細胞侵襲能力變化。結(jié)果A、B、C、D組第48小時細胞生長抑制率分別為0、13.2±2.5、23.6±4.3、41.5±6.2，第72小時細胞生長抑制率分別為0、23.1±5.1、43.2±2.7、65.7±7.3，與同組48 h比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。隨著姜黃素濃度的升高，U2OS細胞的凋亡指數(shù)明顯增高，呈濃度依賴性。U2OS細胞培養(yǎng)24 h后A、B、C、D組細胞凋亡指數(shù)分別為10.01%、18.76%、24.68%、42.81%。四組間兩兩比較，P均＜0.05。U2OS細胞培養(yǎng)72 h后A、B、C、D組每高倍鏡下穿膜細胞數(shù)目分別為96.8±8.2、82.4±7.1、76.3±6.5、53.4±3.3，C、D組與A組比較，P均＜0.05。結(jié)論 姜黃素對人骨肉瘤細胞系增殖有明顯的抑制作用，且呈濃度及時間依賴性，能誘導(dǎo)細胞凋亡，降低細胞侵襲能力。

骨肉瘤；姜黃素；細胞凋亡；細胞侵襲

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.012

骨肉瘤發(fā)病約占所有骨惡性腫瘤的30%，目前用于化療的藥物不良反應(yīng)較大，有可能進一步降低骨肉瘤患者的生存率［1］。姜黃素是傳統(tǒng)中藥，人體耐受性良好［2］。研究表明，姜黃素對肝癌、胃癌、胰腺癌等腫瘤具有較明顯的抗癌作用，但目前關(guān)于姜黃素對人骨肉瘤細胞作用規(guī)律的研究較少［3］。2014 年5月～2015年12月，我們通過觀察不同濃度姜黃素對人骨肉瘤U2OS細胞系的抑制作用，分析姜黃素對U2OS細胞系增殖、凋亡及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤U2OS細胞系（中國科學(xué)院上海細胞庫）；DMEM培養(yǎng)基（GIBCO-BR公司）、新生牛血清（杭州四季青生物制品有限公司）；細胞培養(yǎng)箱（英國Galaxy公司）；姜黃素（Sigma公司）；細胞凋亡檢測試劑盒（eBioscience，San Diego）；FACSCalibur細胞分析儀（Becton Dickinson，MountainView）。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 人骨肉瘤U2OS細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁生長。實驗細胞隨機分為4組，A組為空白對照組，加入PBS緩沖液；B、C、D組培養(yǎng)液中姜黃素的濃度分別為5、10、20 μmol/L。

1.3 細胞增殖能力檢測 采用MTT法。取對數(shù)生長期人骨肉瘤U2OS細胞，以1×104/孔接種于96孔板，培養(yǎng)12 h，按照預(yù)先分組，A、B、C、D組分別加入PBS緩沖液和5、10、20 μmol/L姜黃素，繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h。向各孔中分別加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。向各孔中分別加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解。于酶標(biāo)儀490 nm波長處分別測量各孔的吸光度值。細胞生長抑制率（IR）=（1-加藥組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。

1.4 細胞凋亡檢測 采用流式細胞術(shù)。取對數(shù)生長期U2OS細胞接種于12孔板（1.5×105/孔），A、B、C、D組分別加入PBS緩沖液和5、10、20 μmol/L姜黃素，培養(yǎng)24 h，收集細胞。采用凋亡檢測試劑盒進行檢測。懸浮于緩沖液中的細胞，室溫下于暗室用AnnexinV-FITC和碘化丙啶孵育15 min。應(yīng)用CellQuest軟件，通過FACSCalibur細胞分析儀進行分析。Annexin V陽性的細胞為凋亡細胞，記錄各組細胞凋亡指數(shù)。

1.5 細胞侵襲能力檢測 用無血清DMEM培養(yǎng)基按1∶19稀釋Matrigel，取50 μL鋪于Transwell小室上室，A、B、C、D組U2OS細胞分別加入PBS緩沖液和5、10、20 μmol/L姜黃素處理，取處理過的U2OS細胞100 μL；下室加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)基500 μL；24 h后取出小室，膜下表面的細胞用PBS洗一遍；甲醇固定并結(jié)晶紫染色。將附著于膜下表面的細胞于高倍鏡下（×100）隨機取5個視野計數(shù)，取平均數(shù)。重復(fù)實驗2次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對U2OS細胞增殖能力的影響 隨著姜黃素濃度的升高，U2OS細胞系增殖受到顯著抑制，受抑制程度呈濃度依賴性。A、B、C、D組第48小時細胞生長抑制率分別為0、13.2%±2.5%、23.6%±4.3%、41.5%±6.2%，第72小時細胞生長抑制率分別為0、23.1%±5.1%、43.2%± 2.7%、65.7%±7.3%，與同組48 h比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

2.2 姜黃素對U2OS細胞凋亡的影響 隨著姜黃素濃度的升高，U2OS細胞的凋亡指數(shù)明顯增高，呈濃度依賴性。U2OS細胞培養(yǎng)24 h后A、B、C、D組細胞凋亡指數(shù)分別為10.01%、18.76%、24.68%、42.81%。四組間兩兩比較，P均＜0.05。

2.3 姜黃素對U2OS細胞侵襲能力的影響 U2OS細胞培養(yǎng)72 h后，A、B、C、D組每100倍鏡下穿膜細胞數(shù)分別為96.8±8.2、82.4±7.1、76.3±6.5、53.4±3.3，C、D組與A組比較，P均＜0.05。

3 討論

骨肉瘤是最常見的骨惡性腫瘤，小兒發(fā)病率較高。骨肉瘤發(fā)病的第一個高峰是青春期，第二個高峰是65歲以后。美國骨肉瘤的發(fā)生率約為400例/年。在中國的發(fā)病率約為4/100萬。骨肉瘤的10生存率為60%～75%。目前骨肉瘤的治療一般采取術(shù)前化療，截肢術(shù)或保留肢體的腫瘤切除術(shù)，術(shù)后化療。目前用于化療的藥物對于骨肉瘤細胞和人體正常細胞均有明顯的殺傷作用，不良反應(yīng)較大。

姜黃素對多種腫瘤有抗癌作用，其可作用于多種分子及細胞傳導(dǎo)通路，在基因表達、轉(zhuǎn)錄、細胞增殖和細胞外基質(zhì)合成等過程中發(fā)揮重要作用［4］。姜黃素不僅通過抑制多個基因而抑制腫瘤的細胞增殖，且能影響腫瘤增殖相關(guān)的多種生長受體和細胞黏附分子［5］。在包括骨肉瘤的多種腫瘤細胞系中，姜黃素均能上調(diào)腫瘤抑制基因的表達［6］。

既往研究［7，8］表明，Bax、Cleaved PARP表達增高，Bcl-2表達降低均會明顯促進骨肉瘤細胞的凋亡。miR-138被認為與骨肉瘤的凋亡有關(guān)，miR-138的表達量增大，將會抑制Smad4、NF-κB、p65和Cyclin D3等基因的表達，從而抑制骨肉瘤細胞的增殖，促進骨肉瘤細胞的凋亡［9］。研究表明，姜黃素能對多個靶點、多個傳導(dǎo)通路發(fā)生作用；以上傳導(dǎo)通路均可能受到姜黃素調(diào)節(jié)，從而發(fā)揮促進骨肉瘤細胞凋亡的作用。

本實驗結(jié)果顯示，姜黃素干預(yù)后骨肉瘤細胞系的增殖受到明顯抑制，凋亡水平明顯增高，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。姜黃素對骨肉瘤細胞的抑制呈濃度依賴性和時間依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究中Transwell細胞侵襲實驗證明，相對于A組，C、D組骨肉瘤細胞的侵襲能力明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；表明在較高濃度姜黃素作用下，骨肉瘤細胞的侵襲能力會受到抑制。

目前關(guān)于姜黃素對人骨肉瘤U2OS細胞影響的研究較少，本研究結(jié)果顯示，姜黃素對人骨肉瘤細胞系增殖有明顯的抑制作用，且呈濃度及時間依賴性，能誘導(dǎo)細胞凋亡，降低細胞侵襲能力。姜黃素在水中的溶解度低，且在人體中的代謝率高，臨床應(yīng)用受限。未來研究中需為姜黃素尋找一種合適的載體，使其既能溶于水，又能避免退變，并能有效地釋放到作用靶區(qū)。

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［4］Strimpakos AS，Sharma RA.Curcumin：preventive and therapeutic properties in laboratory studies and clinical trials［J］.Antioxid Redox Signal，2008，10（3）：511-545.

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［9］Yu D，An F，He X，et al.Curcumin inhibits the proliferation and invasion of human osteosarcoma cell line MG-63 by regulating miR-138［J］.Int J Clin Exp Pathol，2015，8（11）：14946-14952.

R738

A

1002-266X（2016）25-0039-03

陳鵬（E-mail：0356154@fudan.edu.cn）

2016-03-10）