白國立，譚雪瑩，史光軍（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院，山東青島266000）

PDX-1在人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島分泌細(xì)胞中的作用

白國立，譚雪瑩，史光軍
（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市市立醫(yī)院，山東青島266000）

目的 探討胰十二指腸同源盒基因1（PDX-1）在人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSC）分化為胰島分泌細(xì)胞中的作用。方法 取復(fù)蘇凍存的ADSC，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對照組，實(shí)驗(yàn)組采用腺病毒轉(zhuǎn)染方法將PDX-1轉(zhuǎn)入ADSC，對照組無腺病毒感染。Western blotting法檢測實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染結(jié)果，ELISA法檢測兩組細(xì)胞胰島素分泌量，RT-PCR法檢測兩組胰島分泌相關(guān)基因Ngn3和Islet-1表達(dá)。結(jié)果 轉(zhuǎn)染PDX-1的ADSC于48 h后可檢測到PDX-1基因的轉(zhuǎn)錄，而對照組則無PDX-1基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)染后15 d，實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞在低糖環(huán)境下分泌的胰島素量分別為（6.98±0.74）、（6.78±0.54）ng/mL，兩組比較，P＞0.05；高糖環(huán)境下分泌的胰島素量分別為（13.38±0.62）、（6.50±0.66）ng/mL，兩組比較，P＜0.05。對照組中Ngn3和Islet-1不表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組與對照組Islet-1相對表達(dá)量分別為5.150±0.177、1.000±0.089，Ngn3相對表達(dá)量分別為5.819±1.629、1.000±0.120，兩組比較，P均＜0.05。結(jié)論 PDX-1基因?qū)θ酥鹃g充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞有促進(jìn)作用。

糖尿病；脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；腺病毒；胰十二指腸同源盒基因1；胰島分泌細(xì)胞

1型糖尿病主要由胰島β細(xì)胞破壞導(dǎo)致胰島素絕對缺乏引起［1，2］，利用干細(xì)胞技術(shù)來克服胰島短缺的問題成為研究焦點(diǎn)。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSC）與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有相似的細(xì)胞表型，在特定誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下可向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等定向分化，甚至可將其定向誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞、角膜細(xì)胞［3，4］等。胰十二指腸同源盒基因-1（PDX-1）作為一種在胰腺發(fā)育中起重要作用的特異性轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞功能的相關(guān)基因表達(dá)，將PDX-1基因轉(zhuǎn)染某些非胰島β細(xì)胞（如肝細(xì)胞、小腸上皮細(xì)胞）后，這些細(xì)胞可產(chǎn)生胰島素［5］。2015年1～12月，我們探討了PDX-1基因在誘導(dǎo)人ADSC向胰島分泌細(xì)胞分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人ADSC來自青島市市立醫(yī)院肝膽外科衛(wèi)生部細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)室。DMEM/F12、DMEM-低糖和DMEM-高糖培養(yǎng)液購自美國HyClone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，雙硫腙購自美國Sigma公司，人胰島素ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物公司，兔抗人PDX-1單克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，攜帶PDX-1基因的腺病毒由美國ViGene Biosciences公司中國辦事處合成，引物由Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)，上海生物工程股份有限公司完成引物設(shè)計(jì)。

1.2 人ADSC復(fù)蘇 離心管加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基3 mL；從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，迅速置37℃水浴1 min至融化；打開凍存管，吸取細(xì)胞懸液至離心管，輕輕混勻；1 500 r/min離心3 min，棄上清；細(xì)胞沉淀中加入4 mL完全培養(yǎng)基，吹打混勻，轉(zhuǎn)入35 cm培養(yǎng)瓶37℃常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞至80%～90%融合時(shí)傳代，標(biāo)注代數(shù)及日期。

1.3 攜帶PDX-1基因的腺病毒制備及ADSC轉(zhuǎn)染攜帶PDX-1基因的腺病毒由山東維真生物科技有限公司暨美國ViGene Biosciences公司中國辦事處合成：pdx-1基因由NM 00029基因序列克隆至pAD-Amp載體，本研究選用的腺病毒載體為人類血清5型腺病毒，腺病毒對其包裝，載體C端帶有His，F(xiàn)lag標(biāo)簽。實(shí)驗(yàn)組將復(fù)蘇后生長狀態(tài)良好的細(xì)胞傳代到6孔板，保證第2天進(jìn)行病毒感染的時(shí)候細(xì)胞匯合率介于50%～70%。將病毒液感染復(fù)數(shù)（MOI）=50加入細(xì)胞中，培養(yǎng)4 h后吸去含病毒的培養(yǎng)液，換上新鮮的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)37℃培養(yǎng)48 h，收獲感染后細(xì)胞。對照組采用無腺病毒感染的ADSC，其余處理同實(shí)驗(yàn)組。

1.4 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞PDX-1表達(dá)檢測 采用Western blotting法。留取實(shí)驗(yàn)組、對照組轉(zhuǎn)染后48 h貼壁生長的細(xì)胞用PBS沖洗2次，將細(xì)胞移至EP管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入蛋白裂解液裂解細(xì)胞，取50 μL蛋白液與10 μL 5×上樣緩沖液混合，100℃變性10 min。取提取蛋白樣品，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PYDF膜，5%脫脂奶粉封閉，兔抗人單克隆抗體作為一抗（1∶800）孵育、4℃過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為二抗（1∶1 000）孵育2 h，化學(xué)曝光顯影，β-actin做內(nèi)參。測定轉(zhuǎn)染后PDX-1表達(dá)情況。

1.5 葡萄糖刺激誘導(dǎo)后細(xì)胞胰島素分泌水平檢測采用ELISA法。細(xì)胞轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)15 d后，用1× PBS緩沖液緩慢沖洗2次，分別用含不同葡萄糖濃度（5.5 mmol/L和25 mmol/L）的DMEM/F12培養(yǎng)液孵育細(xì)胞1 h，取細(xì)胞培養(yǎng)液，用ELISA法測定培養(yǎng)液中的胰島素含量。

1.6 胰島分泌相關(guān)基因Islet-1、Ngn3表達(dá)檢測采用RT-PCR法。將轉(zhuǎn)染后15 d細(xì)胞中的培養(yǎng)液棄去，加入1 mL TRIzol，用1 mL槍頭粗口研磨細(xì)胞至全部溶于TRLzol中，將細(xì)胞吸入1.5 mL EP管中。加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，靜置5 min后，12 000 r/min，離心15 min，將水相移出，加500 μL異丙醇，輕柔混勻，靜置10 min后，12 000 r/ min，離心10 min，棄上清。加1 mL 75%乙醇，上下輕微搖動，洗滌沉淀；13 000 r/min，離心5 min，棄上清。將含沉淀的EP管置于通風(fēng)附近，令EP管干燥完全。加DEPC 10 μL，混勻。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)：95℃變性30 s，95℃變性5 s，58℃退火20 s，60個(gè)循環(huán)。Ngn3正向序列：5′-AGAGCGAGTTGGCACTGAG-3′；Ngn3反向序列：5′-CTGAGAAAGCCAGACTGCC-3′；Islet-1正向序列：5′-GCCTTTGTGAACCAACACCTG-3′；Islet-1反向序列：5′-GTTGCAGTAGTTCTCCAGCTG-3′；GAPDH正向序列：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′；GAPDH反向序列5′-ATGTCGTTGTCCCACCACCT-3′。Islet-1、Ngn3表達(dá)相對量以2-ΔΔCt表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用方差分析及t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞PDX-1表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染PDX-1的ADSC于48 h后可檢測到PDX-1基因的轉(zhuǎn)錄，而對照組則無PDX-1基因的轉(zhuǎn)錄。

2.2 兩組葡萄糖刺激誘導(dǎo)后細(xì)胞胰島素分泌水平比較 實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞在低糖環(huán)境下分泌的胰島素量分別為（6.98±0.74）、（6.78±0.54）ng/mL，兩組比較，P＞0.05；高糖環(huán)境下分泌的胰島素量分別為（13.38±0.62）、（6.50±0.66）ng/mL，兩組比較，P＜0.05。

2.3 兩組Islet-1、Ngn3表達(dá)比較 對照組中Ngn3 和Islet-1不表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組與對照組Islet-1相對表達(dá)量分別為5.150±0.177、1.000±0.089，Ngn3相對表達(dá)量分別為5.819±1.629、1.000±0.120，兩組比較，P均＜0.05。

3 討論

ADSC具有提取方法簡便、成本低廉、供體豐富等優(yōu)點(diǎn)。目前將其誘導(dǎo)為胰島分泌細(xì)胞的誘導(dǎo)方法主要是使用堿性成纖維生長因子、尼克酰胺、胰高血糖素樣肽-1或與胰腺組織共培養(yǎng)等方法，但皆成本較高，不適宜進(jìn)一步大規(guī)模動物實(shí)驗(yàn)。

PDX-1屬于器官同源結(jié)構(gòu)域蛋白，研究發(fā)現(xiàn)PDX-1基因與胰腺發(fā)育至關(guān)重要，是胰腺發(fā)育和胰腺前體細(xì)胞分化為β細(xì)胞的主要調(diào)控因子，在胚胎發(fā)育早期，PDX-1在內(nèi)分泌細(xì)胞和外分泌細(xì)胞中均有表達(dá)，其能誘導(dǎo)內(nèi)胚層向胰腺定向發(fā)育和成熟，激活后其編碼的PDX-1蛋白特異性結(jié)合Ngn3基因上游啟動子使其表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控Islet-1、INSM2等胰島轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)；其中Islet-1在胰腺發(fā)育早期和胰腺增殖階段胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞成熟、增殖和存活中起重要作用，隨著胰腺的發(fā)育，PDX-1最終僅限于在β細(xì)胞內(nèi)表達(dá)［6～8］。近年來，由于PDX-1基因在胰島素分泌過程中不可缺少，PDX-1在胰腺發(fā)育、分化、再生及胰島素分泌過程中的作用受到關(guān)注［9～11］。將PDX-1基因轉(zhuǎn)染某些非胰島β細(xì)胞（如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、肝細(xì)胞）后，這些細(xì)胞均可產(chǎn)生胰島素［12，13］。

重組腺病毒是進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的工具，在實(shí)驗(yàn)操作腺病毒過程中，需采取一定的預(yù)防措施，以保證腺病毒的安全性和轉(zhuǎn)染效率。我們用攜帶PDX-1基因的人類血清5型腺病毒感染ADSC 48 h后，通過Western blotting法證實(shí)腺病毒對ADSC具有較高的感染能力。將PDX-1基因?qū)肴酥鹃g充質(zhì)干細(xì)胞后15 d，RT-PCR法檢測到胰島分泌相關(guān)基因Ngn3和Islet-1的表達(dá)，PDX-1基因是如何誘導(dǎo)人ADSC分化為胰島分泌細(xì)胞還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)通過腺病毒攜帶PDX-1基因轉(zhuǎn)染人ADSC的方式，能誘導(dǎo)其向胰島分泌細(xì)胞方向分化，且在周圍環(huán)境中的葡萄糖濃度升高條件下分泌胰島素；PDX-1基因?qū)?xì)胞的誘導(dǎo)分化具有促進(jìn)作用。ADSC將有望成為治療糖尿病的細(xì)胞來源。

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Effect of PDX gene 1 in human adipose-derived mesenchymal stem cells differentiating into insulin-secreting cells

BAI Guoli，TAN Xueying，SHI Guangjun
（The Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University Medical College，Qingdao 266000，China）

Objective To invesitigate the effect of PDX gene 1（PDX-1）in human adipose-derived mesenchymal stem cells（ADSC）differentiating into insulin-secreting cells.Methods ADSC after cryopreservation and anabiosis were selected and then were divided into the experimental group and control group.In the experimental group，transfering PDX-1 gene into human ADSC by using the skill of adenoviral transfection method，and the control group without the adenovirus infection.The gene transfection results were detected by Western blotting，the amount of insulin secretion in the transfected cells was detected by ELISA，the expression of Ngn3 and Islet-1 was detected by RT-PCR in the two groups.Results Fifteen days after transfection，the insulin secretion under hypoglycemia of the experimental group and the control group was （6.98±0.74）and（6.98±0.74）ng/mL，respectively（P＞0.05）；the insulin secretion under hyperglycemia was （13.38±0.62）and（6.50±0.66）ng/mL，respectively；the expression of Islet-1 in the experimental group and the control group was 5.150±0.177 and 5.150±0.177，respectively；and the expression of Ngn3 in the experimental group and the control group was 5.819±1.629 and 1.000±0.120，respectively.The insulin secretion under hyperglycemia，and expression of Islet-1 and Ngn3 was higher in the experimental group as compared with that of the control group，and the difference was significant（all P＜0.05）.Conclusion PDX-1 gene plays a positive role in promoting the differentiation of human ADSC into islet-like cells.

diabetes mellitus；adipose-derived mesenchymal stem cells；adenoviruses；PDX-1；insulin-secreting cells

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.005

R329

A

1002-266X（2016）25-0017-03

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2014WS0217）。

白國立（1989-），在讀研究生，主要研究方向?yàn)楦文懸绕⒓膊?。E-mail：bybaiguoli@163.com

簡介：史光軍（1966-），主任醫(yī)師，博士，主要研究方向?yàn)楦文懸绕⒓膊?。E-mail：sgjzp@hotmail.com

2016-02-01）