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安腸愈瘍湯對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織中TFF3、MUC2和TLR4基因表達的影響*

遲莉麗1#袁浩1宋欽蘭1程艷1孫大娟1閆華1王帥1梁峻尉1張晶晶2

山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院脾胃病科1(250011)山東中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合專業(yè)2

背景：TLR4可介導免疫和炎癥反應，TFF3、MUC2為腸黏膜保護因子，維持腸黏膜屏障功能。目的：觀察安腸愈瘍湯對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織中TFF3、MUC2和TLR4基因表達的影響。方法：應用TNBS制備潰瘍性結腸炎大鼠模型。將90只Wistar大鼠隨機分為空白對照組、模型組、安腸愈瘍湯低、中、高劑量組和美沙拉嗪組，分別給予蒸餾水、不同劑量安腸愈瘍湯和美沙拉嗪。21 d后處死大鼠，行結腸黏膜組織病理學評分，采用RT-PCR法檢測結腸組織中TFF3、MUC2和TLR4基因表達。結果：與模型組相比，安腸愈瘍湯中、高劑量組和美沙拉嗪組組織病理學評分、TLR4表達均顯著降低(P<0.05)，TFF3、MUC2表達均顯著升高(P<0.05)。與安腸愈瘍湯中劑量組相比，安腸愈瘍湯高劑量組和美沙拉嗪組組織病理學評分顯著降低(P<0.05)，TFF3表達顯著升高(P<0.01)。與安腸愈瘍湯中劑量組和美沙拉嗪組相比，安腸愈瘍湯高劑量組MUC2表達顯著升高(P<0.01)，TLR4表達顯著降低(P<0.01)。結論：安腸愈瘍湯可明顯促進潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜修復，其作用機制可能與上調TFF3和MUC2基因表達以及下調TLR4基因表達有關。

關鍵詞結腸炎，潰瘍性；安腸愈瘍湯；三葉因子3；黏蛋白2；Toll樣受體4；治療

Effect of Anchang Yuyang Decoction on Colon Tissue TFF3, MUC2 and TLR4 Gene Expressions in Rats with Ulcerative Colitis

CHILili1,YUANHao1,SONGQinlan1,CHENGYan1,SUNDajuan1,YANHua1,WANGShuai1,LIANGJunwei1,ZHANGJingjing2.1DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan(250011);2IntegratedTraditionalandWesternMedicine,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan

Background: TLR4 can mediate immune and inflammatory responses, TFF3, MUC2 are the intestinal mucosa protection factor and can maintain the intestinal barrier function. Aims: To investigate the effect of Anchang Yuyang decoction on colon tissue TFF3, MUC2 and TLR4 gene expressions in rats with ulcerative colitis. Methods: TNBS was used to establish ulcerative colitis model in rats. Ninety Wistar rats were randomly divided into normal control group, model group, low, moderate and high dose Anchang Yuyang decoction groups and mesalazine group, and distilled water, different concentrations of Anchang Yuyang decoction and mesalazine were given respectively. All the rats were sacrificed after 21 days. Colonic histopathological score was assessed, and RT-PCR was used to detect gene expressions of colon tissue TFF3, MUC2 and TLR4. Results: Compared with model group, histopathological score and TLR4 expression were significantly decreased in moderate, high dose Anchang Yuyang decoction groups and mesalazine group (P<0.05), expressions of TFF3 and MUC2 were significantly increased (P<0.05). Compared with moderate dose Anchang Yuyang decoction group, histopathological score in high dose Anchang Yuyang decoction group and mesalazine group was significantly decreased (P<0.05), and TFF3 expression was significantly increased (P<0.01). Compared with moderate dose Anchang Yuyang decoction group and mesalazine group, MUC2 expression in high dose Anchang Yuyang decoction group was significantly increased (P<0.01), and TLR4 expression was significantly decreased (P<0.01). Conclusions: Anchang Yuyang decoction can promote the repair of colonic mucosa in rats with ulcerative colitis, and its mechanism may be related to the increase of TFF3 and MUC2 gene expressions and down regulation of TLR4 gene expression.

Key wordsColitis, Ulcerative;Anchang Yuyang Decoction;Trefoil Factor 3;Mucin-2;

Toll-Like Receptor 4;Therapy

潰瘍性結腸炎(UC)是一種主要累及直腸、結腸黏膜和黏膜下層的慢性非特異性炎癥，其病因和發(fā)病機制目前尚未完全闡明。西醫(yī)治療UC以氨基水楊酸類、激素等藥物為主，存在不良反應多、費用昂貴、易復發(fā)等缺點，中醫(yī)藥治療UC已成為研究熱點。本研究的前期研究[1-3]發(fā)現(xiàn)，中藥安腸愈瘍湯可通過下調促炎因子白細胞介素(IL)-1、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平以及上調抗炎因子IL-10、IL-13水平，從而起治療UC的作用。在此基礎上，本研究通過評估安腸愈瘍湯對UC大鼠結腸組織中腸三葉因子(TFF3)、黏蛋白2(MUC2)和Toll樣受體4(TLR4)基因表達的影響，旨在從基因水平上探討安腸愈瘍湯治療UC的機制。

材料與方法

一、實驗動物、藥物、主要試劑和儀器

SPF級Wistar大鼠90只，鼠齡10~11周，雌雄各半，體質量(200±10) g，由魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供，動物合格證號：SCXK(魯)2013 0001。

2, 4, 6-三硝基苯磺酸(TNBS)溶液(上海源葉生物科技有限公司)；安腸愈瘍湯(含生黃芪、薏苡仁、炒白術、黃連、黃芩、敗醬草、白及、地榆炭、木香、檳榔、當歸、白芍、防風、生甘草)由山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥制劑室提供，含生藥量為3.00 g/mL；美沙拉嗪緩釋顆粒[Ethypharm(法國)]；Trizol Reagent、2×Taq MasterMix(北京康為世紀生物科技有限公司)；dNTP、RNA酶抑制劑[生工生物工程(上海)股份有限公司]，M-MLV逆轉錄酶(北京Promega公司)。

凝膠成像分析系統(tǒng)型號GL2200(美國Alpha)，EC250-90電泳儀(德國Biometro)，PCR儀(英國Thermo Hybaid)。

二、研究方法

1. 模型制備和實驗分組：大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為6組：空白對照組、模型組、安腸愈瘍湯低、中、高劑量組、美沙拉嗪組，每組15只，各組大鼠體質量無明顯差異(P>0.05)。參照王皓等[4]的研究，采用TNBS灌腸法制備UC大鼠模型：大鼠禁食、不禁水24 h，腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉。將直徑2.0 mm、長12 cm的硅膠管插入結腸距肛門約8 cm處，以100 mg/kg TNBS加50%乙醇0.25 mL的混合試劑快速注入肛門，提尾倒立1 min，待大鼠自然蘇醒后常規(guī)飼養(yǎng)。

制備UC大鼠模型的第3 d，安腸愈瘍湯低、中、高劑量組分別給予含生藥為0.75 g/mL、1.5 g/mL、3 g/mL的藥物灌胃，美沙拉嗪組給予0.035 g/mL美沙拉嗪混懸液灌胃，空白對照組、模型組以蒸餾水灌胃。各組灌胃溶液體積均為2 mL，每天2次，連續(xù)21 d。

實驗過程中，模型組、安腸愈瘍湯低劑量組、美沙拉嗪組各死亡1只大鼠。另因客觀條件限制，每組各選取6只大鼠用于后續(xù)實驗研究。

2. 觀察結腸病理改變情況：灌胃21 d后，處死大鼠，取距肛門8 cm以上的結腸組織，沿腸系膜縱軸剪開，0.9% NaCl溶液沖洗。取病變最明顯的組織0.5 cm左右，以4.0%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片，行HE染色。光鏡下觀察結腸黏膜炎癥浸潤情況，并采用Dieleman等[5]的標準行組織病理學評分。

3. RT-PCR法檢測結腸組織TFF3、MUC2、TLR4基因表達：采用Trizol一步法提取組織總RNA，紫外分光光度儀驗證RNA純度和濃度。采用oligo dT為RT反應引物，總反應體系為60 μL，含4 μg總RNA、5×RT緩沖液12 μL、RNA酶抑制劑120 U、10 mmol/L dNTP 6 μL，M-MLV 600 U，DEPC水補足至60 μL。反應條件：70 ℃ 5 min，37 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 10 min，逆轉錄成cDNA。各基因PCR引物(表1)由上海博尚生物技術有限公司合成，總反應體積25 μL，包括2× Taq MasterMix 12.5 μL，cDNA 4 μL，上、下游目的基因引物 10 μmol/L 2 μL，DEPC水補足至25 μL。反應條件：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性1 min，58~60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共26個循環(huán)；70 ℃終延伸10 min。PCR產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠成像分析系統(tǒng)進行分析，以β-actin為內參照，以各基因與β-actin灰度值的比值作為各基因相對表達量。

三、統(tǒng)計學分析

結果

一、結腸組織病理學變化

空白對照組大鼠結腸黏膜組織結構完整，未見黏膜糜爛潰瘍形成，間質偶見散在少量炎性細胞浸潤。模型組大鼠可見較大面積的潰瘍，部分深達肌層；腺體破壞，結構不完整，杯狀細胞減少，炎性細胞大量浸潤，以中性粒細胞為主。安腸愈瘍湯不同劑量組和美沙拉嗪組結腸組織表現(xiàn)為輕、中度慢性炎癥，黏膜和黏膜下層仍有中等量炎性細胞浸潤，局部黏膜可見糜爛、潰瘍愈合，但較模型組明顯好轉(圖1)。

二、結腸黏膜組織病理學評分

模型組結腸組織病理學評分較空白對照組顯著升高(P<0.01)，說明UC大鼠造模成功。與模型組相比，安腸愈瘍湯中、高劑量組和美沙拉嗪組評分均不同程度降低(P<0.05或P<0.01)，安腸愈瘍湯高劑量組和美沙拉嗪組評分又顯著低于安腸愈瘍湯中劑量組(P<0.05)，但安腸愈瘍湯高劑量組與美沙拉嗪組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

三、結腸組織TFF3、MUC2、TLR4基因表達

與空白對照組相比，模型組TFF3、MUC2表達顯著降低(P<0.05)，TLR4表達顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，安腸愈瘍湯低、中、高劑量組和美沙拉嗪組TFF3表達均顯著升高(P<0.05或P<0.01)，安腸愈瘍湯高劑量組和美沙拉嗪組又顯著高于安腸愈瘍湯中劑量組(P<0.01)，但安腸愈瘍湯高劑量組與美沙拉嗪組無明顯差異(P>0.05)； 安腸愈瘍湯低、中、高劑量組和美沙拉嗪組MUC2表達均顯著升高(P<0.05或P<0.01)，安腸愈瘍湯高劑量組又顯著高于安腸愈瘍湯中劑量組和美沙拉嗪組(P<0.01)；安腸愈瘍湯中、高劑量組和美沙拉嗪組TLR4表達顯著降低(P<0.01)，安腸愈瘍湯高劑量組又顯著低于安腸愈瘍湯中劑量組和美沙拉嗪組(P<0.01)(表2、圖2)。

表1　PCR引物和產物長度

A：空白對照組；B：模型組；C：安腸愈瘍湯低劑量組；D：安腸愈瘍湯中劑量組；E：安腸愈瘍湯高劑量組；F：美沙拉嗪組

組 別例數(shù)組織病理學評分TFF3MUC2TLR4空白對照組60.500±0.577**0.502±0.137*0.174±0.009*0.649±0.184*模型組67.333±1.1540.440±0.4410.162±0.0090.805±0.094安腸愈瘍湯組 低劑量65.800±1.6430.521±0.078*0.205±0.016*0.789±0.150 中劑量64.800±0.837*0.602±0.033**0.264±0.006**0.328±0.034** 高劑量63.200±0.837**▲0.758±0.013**▲▲0.350±0.023**##▲▲0.283±0.013**##▲▲美沙拉嗪組63.600±0.548*▲0.789±0.090**▲▲0.228±0.011**▲▲0.414±0.041**▲▲

與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與安腸愈瘍湯中劑量組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與美沙拉嗪組比較，#P<0.05，##P<0.01

泳道1：空白對照組；泳道2：模型組；泳道3：安腸愈瘍湯低劑量組；泳道4：安腸愈瘍湯中劑量組；泳道5：安腸愈瘍湯高劑量組；泳道6：美沙拉嗪組

圖2各組大鼠結腸組織TFF3、MUC2、TLR4基因表達(RT-PCR法)

討論

雖然UC的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，但免疫反應異常被認為在其發(fā)病中扮演重要角色，其中細胞因子在UC發(fā)病中的作用已得到公認[1-3,6-8]。近年研究[9-13]顯示TLRs/NF-κB通路對調控細胞因子的釋放具有重要作用。TLR4蛋白主要表達于胃和結腸組織[14]，其作為一種模式識別受體，可對腸腔內病原模式識別分子(PAMPs)進行模式識別，經一系列信號轉導分子最終促使核因子NF-κB的激活，促進多種細胞因子的釋放，進而調節(jié)炎癥遞質水平。過量TLR4會導致NF-κB的過度激活，產生持續(xù)擴大的炎癥反應，因此TLR4是介導免疫和炎癥反應的主體。

TFF3是三葉因子家族成員之一，由杯狀細胞分泌并特異性分布于腸黏膜表面，其既是腸道特異性黏膜修復因子，又是黏膜損傷的快速反應肽，具有保護和重建腸上皮、維持腸上皮細胞屏障功能的作用[15-16]，同時還可明顯抑制炎癥介質[17]。MUC2基因是一種黏蛋白核心肽基因，廣泛表達于腸黏膜，研究[18-21]表明MUC2對腸黏膜有直接的保護作用，一旦表達下降，腸道屏障功能受損，通透性增高，腸腔內的抗原、內毒素等促炎物質誘發(fā)免疫反應，從而促進UC的發(fā)生、發(fā)展。

中醫(yī)雖然無UC之病名，但根據其臨床表現(xiàn)歸屬 “休息痢”、“久痢”之范疇。本課題組通過復習文獻并結合多年的臨床經驗，認為本病為本虛標實之證，脾氣虧虛為發(fā)病之本，濕熱邪毒為致病之標，濕熱蘊腸，氣滯絡瘀為基本病機。濕熱瘀毒病邪不能及時清除，糟粕之物從腸道入侵人體，以致疾病反復發(fā)作，纏綿難愈，毒邪留戀，正氣愈虛，毒邪彌漫，侵及他臟，使疾病沉重難愈?；谝陨喜C確立了健脾益氣以固本，清熱化濕以治標，同時注重調氣行血的治療大法。中藥復方安腸愈瘍湯補中有瀉，寓瀉于補，相反相成，集健脾益氣、清熱化濕、調氣活血、涼血止血于一爐，標本兼治，切合病機。

本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量安腸愈瘍湯具有明確治療UC的作用，不僅可明顯改善和修復UC大鼠的結腸組織黏膜，還可上調結腸組織中TFF3、MUC2表達，下調TLR4表達。由此推測，安腸愈瘍湯可能是通過抑制TLRs識別受體的表達，抑制了其作為啟動蛋白的炎癥反應鏈的擴大，減少炎癥介質的釋放，發(fā)揮抗炎作用。另一方面，安腸愈瘍湯還通過上調腸黏膜保護因子的表達，從而達到防治UC的作用。但本研究未從蛋白水平進行分析，后續(xù)將進一步從蛋白水平研究安腸愈瘍湯治療UC的作用機制。此外，這些腸黏膜保護因子是直接作用于腸黏膜組織發(fā)揮修復作用還是通過抑制TLR4/NF-κB通路的信號轉導和炎癥反應而發(fā)揮增強黏膜修復的作用，其深層機制有待進一步研究。

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(2015-07-10收稿；2015-08-14修回)

*基金項目：山東省自然科學基金，編號：ZR2012HL11

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.02.005

#Email: chililiyl@163.com