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·論著·

蓽茇酰胺對(duì)人胃癌細(xì)胞株MKN45增殖、凋亡的影響及其機(jī)制研究

段超勤*鄧超鄒曉平#

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科(210008)

背景：近年研究顯示，蓽茇酰胺(PL)在諸多惡性腫瘤中可通過升高活性氧(ROS)水平選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，然而其對(duì)胃癌細(xì)胞的作用仍有待進(jìn)一步研究。目的：探討PL對(duì)人胃癌細(xì)胞株MKN45增殖、凋亡的影響及其可能機(jī)制。方法：以不同濃度PL以及caspase抑制劑、抗氧化劑單獨(dú)或聯(lián)合處理MKN45細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)ROS水平，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白XIAP、cleaved-caspase3、7、9、cleaved-PARP、p53及其下游靶基因p21、GADD45α、PUMA表達(dá)。結(jié)果：PL可劑量和時(shí)間依賴性地抑制MKN45細(xì)胞增殖，經(jīng)PL處理的MKN45細(xì)胞G1期細(xì)胞比率、細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，抗凋亡蛋白XIAP表達(dá)下調(diào)，caspase依賴性凋亡途徑、p53及其下游靶基因激活?？寡趸瘎㎞AC或廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)PL的促ROS生成以及增殖抑制和促凋亡作用。結(jié)論：PL能抑制MKN45細(xì)胞增殖，使細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其抗腫瘤效應(yīng)的作用機(jī)制可能為升高腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平，進(jìn)而激活p53和caspase依賴性凋亡途徑。

關(guān)鍵詞蓽茇酰胺；活性氧；腫瘤抑制蛋白p53；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；細(xì)胞凋亡；胃腫瘤

Effect and Underlying Mechanism of Piperlongumine on Proliferation and Apoptosis of Human Gastric Cancer Cell Line MKN45

DUANChaoqin,DENGChao,ZOUXiaoping.DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing(210008)

Correspondence to: ZOU Xiaoping, Email: zouxiaoping795@hotmail.com

Background: Recently, studies have shown that piperlongumine (PL) selectively killed cancer cells by elevating reactive oxygen species (ROS) in various cancers. However, the effect of PL on gastric cancer cells remained to be further studied. Aims: To investigate the effect of PL on proliferation and apoptosis of human gastric cancer cell line MKN45 and its underlying mechanism. Methods: MKN45 cells were treated with different doses of PL, caspase inhibitor, antioxidant, and their combinations, respectively. Cell viability was assessed by CCK-8 assay; cell cycle, apoptosis and intracellular ROS level were measured by flow cytometry; and Western blotting was employed to determine the expression of apoptosis-related proteins (XIAP, cleaved-caspase3, 7, 9 and cleaved-PARP), p53 and its downstream target genes (p21, GADD45α and PUMA). Results: PL inhibited the proliferation of MKN45 cells in a dose- and time-dependent manner. In MKN45 cells treated with PL, the proportion of cells in G1 phase, apoptotic rate and intracellular ROS level were significantly increased, the expression of inhibitor of apoptosis protein XIAP was down-regulated, and the caspase-dependent apoptosis pathway, p53 and its downstream target genes were activated. Pretreatment with antioxidant NAC or Z-VAD-FMK, a general caspase inhibitor could partially abolish the effect of PL on ROS production and its antitumor effect. Conclusions: PL can inhibit cell proliferation and induce cell cycle G1 phase arrest and apoptosis in MKN45 cells. Its antitumor effect may be associated with a ROS-mediated p53 activation and subsequent triggering of caspases cascade of cell apoptosis.

Key wordsPiperlongumine;Reactive Oxygen Species;Tumor Suppressor Protein p53;Caspases;

Apoptosis;Stomach Neoplasms

盡管胃癌發(fā)病率已從1975年位居世界第一位下降至2012年的世界第五位，但胃癌致死率仍居癌癥相關(guān)死亡率的第三位[1]。大部分胃癌患者確診時(shí)已屬晚期，且半數(shù)以上的局部進(jìn)展期胃癌患者術(shù)后可能復(fù)發(fā)，3年生存率低于40%[2]。近年來，隨著免疫治療、新輔助治療、分子靶向藥物等治療方法的不斷進(jìn)步，胃癌患者的長期生存率有所提高。化療仍是進(jìn)展期胃癌患者最主要的治療方法[3]，然而其所面臨的藥物毒性大、患者反應(yīng)率低、并發(fā)癥多等問題導(dǎo)致患者的生存質(zhì)量和生存率均不容樂觀[4-5]，因此尋找新的有效治療胃癌的方法是一個(gè)亟待解決的問題。蓽茇酰胺(piperlongumine, PL)是提取自中藥蓽茇的一種生物堿，既往研究表明其具有抗血小板[6]、抗焦慮和抑郁[7]、抗炎和血管屏障保護(hù)[8]等活性，并能對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株和小鼠移植瘤模型發(fā)揮抑制生長、誘導(dǎo)凋亡和抗癌效應(yīng)[9-12]，然而PL對(duì)胃癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本研究探討了PL對(duì)人胃癌細(xì)胞株MKN45增殖、凋亡的影響及其可能機(jī)制。

材料與方法

一、腫瘤細(xì)胞株和主要試劑

人胃癌細(xì)胞株MKN45購自中科院上海細(xì)胞庫，由南京鼓樓醫(yī)院消化科實(shí)驗(yàn)室凍存保管；PL、N-乙酰半 胱氨酸(NAC)、2’,7’-二氯熒光素二乙酸鹽(DCFH-DA)(Sigma-Aldrich Co. LLC.)，Z-VAD-FMK(Selleck Chemicals)，CCK-8細(xì)胞增殖/細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒[東仁化學(xué)科技(上海)有限公司]，細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD Biosciences)，p21抗體、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抗體、p53 抗體、生長停滯DNA損傷可誘導(dǎo)蛋白α(GADD45α)抗體、p53上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)因子(PUMA)抗體(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)，X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)抗體(R&D Systems)，caspase3、caspase7、caspase9抗體、羊抗鼠、羊抗兔二抗(Cell Signaling Technology, Inc.)。

二、方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：MKN45細(xì)胞以含10%胎牛血清和1%雙抗(100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素) 的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于5% CO2、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，常規(guī)消化傳代。

2. 細(xì)胞處理：取對(duì)數(shù)生長期MKN45細(xì)胞，按后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求以5×103/孔接種于96孔板(細(xì)胞活性檢測(cè))或以2×105/孔接種于6孔板(除細(xì)胞活性檢測(cè)外的其余檢測(cè))，孵育24 h后進(jìn)行相應(yīng)處理。具體分組處理方式包括：①加入終濃度為0、1、2、4、6、8、10 μmol/L的PL，孵育24 h、48 h；②加入終濃度為0、5、7.5、10 μmol/L的PL，孵育3 h、12 h、24 h、36 h、48 h；③加入7.5 μmol/L PL孵育24 h、20 μmol/L Z-VAD-FMK孵育1 h或Z-VAD-FMK預(yù)處理1 h+PL 24 h，并設(shè)置不予任何處理的對(duì)照組；④加入7.5 μmol/L PL孵育3 h/24 h、3 mmol/L NAC孵育1 h或NAC預(yù)處理1 h+PL 3 h/24 h，并設(shè)置不予任何處理的對(duì)照組。

3. 細(xì)胞活性檢測(cè)(CCK-8法)：MKN45細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，棄培養(yǎng)基，加入含10% CCK-8 的培養(yǎng)基避光孵育1.5 h，以酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長處吸光度(A)值。細(xì)胞相對(duì)存活率=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

4. 細(xì)胞周期檢測(cè)：MKN45細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，胰酶消化、收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌3次，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入A液固定10 min，加入B液處理10 min，加入C液(PI)染色30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

5. 細(xì)胞凋亡檢測(cè)：MKN45細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，胰酶消化、收集細(xì)胞，預(yù)冷 PBS洗滌2次，以100 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V/FITC和5 μL PI，混勻后室溫避光放置15 min，加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

6. 活性氧(ROS)檢測(cè)：MKN45細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，胰酶消化、收集細(xì)胞，10 μmol/L DCFH-DA 37 ℃孵育30 min，預(yù)冷PBS洗滌2次，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

7. 蛋白質(zhì)印跡法：MKN45細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后，胰酶消化、收集細(xì)胞，預(yù)冷 PBS洗滌2次，加入適當(dāng)裂解液4 ℃或冰上裂解15 min，12 000 r/min離心15 min，BCA法蛋白定量，將各組蛋白調(diào)整為同一濃度，沸水煮5 min。取20~40 μg總蛋白上樣，8%~12% SDS-PAGE電泳分離1~2 h，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入1∶1 000~1∶2 000稀釋的相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入相應(yīng)二抗孵育2 h，TBST洗滌3次，ECL顯影，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)捕獲并保存圖像。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

一、PL抑制MKN45細(xì)胞增殖

以0、1、2、4、6、8、10 μmol/L PL處理MKN45細(xì)胞24 h或48 h后，CCK-8法檢測(cè)顯示，PL可抑制MKN45細(xì)胞增殖，作用呈劑量依賴性(圖1A)。以0、7.5、10 μmol/L PL處理MKN45細(xì)胞12 h、24 h、36 h、48 h后，CCK-8法檢測(cè)顯示，PL對(duì)MKN45細(xì)胞的增殖抑制作用呈時(shí)間依賴性(圖1B)。

二、PL誘導(dǎo)MKN45細(xì)胞G1期阻滯

以0、5、7.5、10 μmol/L PL處理MKN45細(xì)胞24 h 后，流式細(xì)胞分析顯示，PL可誘導(dǎo)MKN45細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯(圖2A、2B)；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，PL可上調(diào)細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子p21蛋白表達(dá)(圖2C)，與流式細(xì)胞分析結(jié)果相符。

三、PL誘導(dǎo)MKN45細(xì)胞凋亡

以0、5、7.5、10 μmol/L PL處理MKN45細(xì)胞24 h 后，流式細(xì)胞分析顯示，PL可誘導(dǎo)MKN45細(xì)胞凋亡(圖3A、3B)；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，PL可下調(diào)抗凋亡蛋白XIAP表達(dá)，上調(diào)cleaved-caspase3、7、9、cleaved-PARP表達(dá)(圖3C)，即激活caspase依賴性凋亡途徑，與流式細(xì)胞分析結(jié)果相符。

四、caspase抑制劑可部分逆轉(zhuǎn)PL的促凋亡作用

以廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK(20 μmol/L)預(yù)處理MKN45細(xì)胞1 h后，再加入7.5 μmol/L PL處理24 h，流式細(xì)胞分析顯示，與僅予PL處理相比，Z-VAD-FMK預(yù)處理可部分逆轉(zhuǎn)PL的促凋亡作用(圖4A、4B)；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，Z-VAD-FMK預(yù)處理可下調(diào)cleaved-caspase3、9、cleaved-PARP表達(dá)(圖4C)。

圖1　PL對(duì)MKN45細(xì)胞的增殖抑制作用呈劑量(A)和時(shí)間(B)依賴性

圖2　PL上調(diào)p21蛋白表達(dá)(C)，誘導(dǎo)MKN45細(xì)胞G1期阻滯(A、B)

圖3　PL下調(diào)XIAP表達(dá)，激活caspase依賴性凋亡途徑(C)，誘導(dǎo)MKN45細(xì)胞凋亡(A、B)

圖4　caspase抑制劑可抑制caspase依賴性凋亡途徑(C)，部分逆轉(zhuǎn)PL對(duì)MKN45細(xì)胞的促凋亡作用(A、B)

五、PL通過ROS-p53途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

以0、5、7.5、10 μmol/L PL處理MKN45細(xì)胞3 h 后，流式細(xì)胞分析顯示，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，而抗氧化劑NAC(3 mmol/L, 1 h)預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)PL(7.5 μmol/L, 3 h)的促ROS生成作用(圖5A、5B)；以0、5、7.5、10 μmol/L PL處理MKN45細(xì)胞24 h后，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，p53及其下游靶基因p21、GADD45α、PUMA蛋白表達(dá)上調(diào)(圖5C)。上述發(fā)現(xiàn)提示PL可能通過升高M(jìn)KN45細(xì)胞內(nèi)ROS水平激活p53，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

六、抗氧化劑可逆轉(zhuǎn)PL的增殖抑制作用

以抗氧化劑NAC(3 mmol/L)預(yù)處理MKN45細(xì)胞1 h后，再加入7.5 μmol/L PL處理24 h，CCK-8法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)顯示，與僅予PL處理相比，NAC預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)PL的增殖抑制作用(圖6A)，同時(shí)下調(diào)p53、cleaved-PARP表達(dá)(圖6B)，進(jìn)一步證實(shí)PL系通過ROS-p53途徑誘導(dǎo)MKN45細(xì)胞凋亡。

討論

近年研究顯示，PL在諸多惡性腫瘤中可通過升高ROS水平選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，在體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)中均顯現(xiàn)出明顯的抗腫瘤效應(yīng)。本研究結(jié)果證實(shí)PL對(duì)人胃癌細(xì)胞株MKN45具有顯著抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。與既往研究[9,13-14]結(jié)果相符，本研究發(fā)現(xiàn)PL能升高M(jìn)KN45細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，繼而上調(diào)p53及其下游靶基因表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白XIAP表達(dá)，激活caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，細(xì)胞凋亡增多，增殖受抑。

p53作為抑癌基因可直接調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，氧化應(yīng)激和DNA損傷可激活p53，導(dǎo)致p53蛋白表達(dá)上調(diào)[15]。作為p53靶基因之一的p21是細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子，p53激活可上調(diào)其表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯[16-17]。本研究結(jié)果表明，PL可通過升高M(jìn)KN45細(xì)胞內(nèi)ROS水平激活p53及其下游靶基因p21、GADD45α、PUMA， 從而使MKN45細(xì)胞阻滯于G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為明確ROS在PL誘導(dǎo)MKN45細(xì)胞凋亡中的作用，進(jìn)一步以抗氧化劑NAC預(yù)處理MKN45細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NAC預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)PL的促ROS生成和增殖抑制作用，下調(diào)p53、cleaved-PARP表達(dá)，證實(shí)PL系通過ROS-p53途徑發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)。

圖5　PL升高M(jìn)KN45細(xì)胞內(nèi)活性氧水平(A、B)，上調(diào)p53及其下游靶基因表達(dá)(C)

圖6　抗氧化劑可下調(diào)p53、cleaved-PARP表達(dá)(B)，逆轉(zhuǎn)PL對(duì)MKN45細(xì)胞的增殖抑制作用(A)

凋亡抑制蛋白(IAPs)是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，而XIAP為IAPs家族的重要成員之一，可通過抑制caspase3、7、9激活而阻斷caspase依賴性凋亡途徑[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，以PL處理MKN45細(xì)胞可下調(diào)XIAP表達(dá)，激活caspase3、7、9及其下游PARP，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理可部分逆轉(zhuǎn)PL的促凋亡作用，表明PL至少是部分通過caspase依賴性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果表明PL能抑制人胃癌細(xì)胞株MKN45增殖，使細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其抗腫瘤效應(yīng)的作用機(jī)制可能為升高腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平，進(jìn)而激活p53和caspase依賴性凋亡途徑，PL有望成為胃癌的潛在治療藥物。

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(2015-10-23收稿；2015-11-25修回)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.02.002

*Email: duanchaoqin@126.com

#本文通信作者，Email: zouxiaoping795@hotmail.com