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小腸類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)的建立和優(yōu)化*

宋東娟#童錦祿&冉志華鄭青&

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科上海市消化疾病研究所

上海市炎癥性腸病研究中心(200001)

背景：小腸類(lèi)器官是體外研究腸道上皮最好的工具，應(yīng)用前景廣泛，然而目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。目的：在國(guó)內(nèi)建立并優(yōu)化小腸類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)，為小腸上皮細(xì)胞的基礎(chǔ)研究提供平臺(tái)。方法：常規(guī)培養(yǎng)L-WRN細(xì)胞，收集含不同濃度胎牛血清(FBS)的條件培養(yǎng)基。處死6~8周齡C57BL/6小鼠，自末端回腸起取約15 cm腸段，縱向剖開(kāi)，EDTA法分離、收集隱窩上皮，以基質(zhì)膠包埋多聚化后加入不同濃度梯度的L-WRN條件培養(yǎng)基，顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察出芽情況，待出芽達(dá)一定長(zhǎng)度后，重新包埋傳代培養(yǎng)。結(jié)果：與含20% FBS的L-WRN條件培養(yǎng)基相比，含10% FBS的條件培養(yǎng)基更有利于小腸類(lèi)器官的體外培養(yǎng)。條件培養(yǎng)基濃度為10%、15%、20%、25%、30%均可促使小腸類(lèi)器官形成，15%條件培養(yǎng)基的出芽率最高。結(jié)論：本研究在國(guó)內(nèi)首次成功建立了小腸類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)，并發(fā)現(xiàn)15% L-WRN條件培養(yǎng)基(含10% FBS)更有利于小腸類(lèi)器官出芽。

關(guān)鍵詞小腸類(lèi)器官；原代細(xì)胞培養(yǎng)；L-WRN細(xì)胞；培養(yǎng)基，條件性；隱窩；干細(xì)胞

Establishment and Optimization of Culture Technique for Enteroids

SONGDongjuan,TONGJinlu,RANZhihua,ZHENGQing.DivisionofGastroenterologyandHepatology,RenJiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity;ShanghaiInstituteofDigestiveDisease;ShanghaiInflammatoryBowelDiseaseResearchCenter,Shanghai(200001)

Co-correspondence to: TONG Jinlu, Email: tongjinlu490@126.com; ZHENG Qing, Email: qingzheng101@163.com

Background: Enteroids are considered to be the best tool for studies on intestinal epitheliuminvitroand have a widely application prospects, however, there are no associated reports in China. Aims: To establish and optimize the culture technique for enteroids and provide a fantastic platform for the basic research of small intestinal epithelial cells in China. Methods: L-WRN cells were cultured routinely and the conditioned medium with different concentrations of fetal bovine serum (FBS) was collected. Six to eight weeks old C57BL/6 mice were sacrificed and 15 cm small intestine from the terminal ileum was removed and cut longitudinally. Crypts were digested with EDTA and then collected and embedded in Matrigel?Matrix; after polymerization of Matrigel?Matrix, L-WRN conditioned medium at different concentration gradient was added. The budding ratio and length of buds were measured dynamically under microscope. The enteroids were re-embedded for subculture when certain length of buds was reached. Results: Compared with L-WRN conditioned medium containing 20% FBS, the conditioned medium containing 10% FBS was more favorable for enteroids cultureinvitro. When conditioned medium accounted for 10%, 15%, 20%, 25% or 30% of the mixed medium, they all promoted the growth of enteroids and the 15% one seemed to yield better result. Conclusions: An enteroids culture technique was successfully established for the first time in China. When the L-WRN conditioned medium containing 10% FBS accounts for 15% of the mixed medium, it might promote budding better than the others.

Key wordsEnteroids;Primary Cell Culture;L-WRN Cells;Culture Media, Conditioned;Crypts;

Stem Cells

腸道上皮由隱窩和絨毛單元組成，具有快速自我更新能力，其中隱窩為增殖區(qū)域，包括小腸干細(xì)胞及其子代細(xì)胞，絨毛則是由各種終末分化細(xì)胞組成的分化區(qū)域。相對(duì)于轉(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞株，小腸類(lèi)器官(enteroids)是目前體外研究腸道上皮最好的工具，應(yīng)用前景廣泛。既往已有眾多國(guó)內(nèi)外學(xué)者探討了腸上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)問(wèn)題，然而均無(wú)法做到長(zhǎng)期體外培養(yǎng)以及維持原代細(xì)胞的分化能力[1]。2009年，荷蘭科學(xué)家Hans Clevers的團(tuán)隊(duì)成功地在體外將Lgr5+腸道干細(xì)胞培養(yǎng)成包括隱窩樣區(qū)域和絨毛樣上皮區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)[2]，即小腸類(lèi)器官，這一結(jié)構(gòu)包含所有終末分化細(xì)胞類(lèi)型，能準(zhǔn)確模擬腸道上皮生理情況，然而目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。本研究旨在在國(guó)內(nèi)建立小腸類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)，同時(shí)優(yōu)化培養(yǎng)所需的條件培養(yǎng)基，以期為小腸上皮細(xì)胞的基礎(chǔ)研究提供平臺(tái)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞和主要試劑

C57BL/6小鼠，6~8周齡，雌雄不限，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；L-WRN細(xì)胞由芝加哥大學(xué)惠贈(zèng)。

無(wú)谷氨酰胺高糖DMEM、Advanced DMEM/F-12、青霉素10 000 U/mL-鏈霉素10 000 μg/mL、胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺(200 mmol/L)、羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液(HEPES)、胰酶、N-2 Supplement、無(wú)維生素A型B-27?Supplement(GibcoTM, Thermo Fisher Scientific Inc.)；G418二硫酸鹽50 mg/mL(Sigma-Aldrich Co. LLC.)；潮霉素B 100 mg/mL(InvivoGen.)；PBS(HyClone, GE Healthcare)；EDTA 0.5 mol/L(碧云天生物技術(shù)有限公司)；基質(zhì)膠(Corning?Matrigel?Matrix, Corning Incorporated)；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)(PeproTech)；Jagged-1(Ana-Spec, Inc.)；Y-27632(Cayman Chemical)。

L-WRN細(xì)胞培養(yǎng)基：將青-鏈霉素(1%)和FBS(10%)加入至無(wú)谷氨酰胺高糖DMEM培養(yǎng)基；初始培養(yǎng)基：將青-鏈霉素(1%)、L-谷氨酰胺(1%)和FBS(10%或20%)加入至Advanced DMEM/F-12培養(yǎng)基；基礎(chǔ)培養(yǎng)基：將青-鏈霉素(1%)、L-谷氨酰胺(1%)和HEPES(1%)加入至Advanced DMEM/F-12培養(yǎng)基。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. L-WRN條件培養(yǎng)基的收集：常規(guī)復(fù)蘇L-WRN細(xì)胞，置于含G418(500 μg/mL)和潮霉素B(500 μg/mL)的L-WRN細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)；細(xì)胞數(shù)量合適時(shí)傳代至75 cm2培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代至150 cm2培養(yǎng)瓶，此次傳代無(wú)需添加G418和潮霉素B。將150 cm2培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，每瓶添加25 mL初始培養(yǎng)基(含10%或20% FBS)，培養(yǎng) 24 h 后收集培養(yǎng)液至50 mL離心管中，同時(shí)在培養(yǎng)瓶中添加新的初始培養(yǎng)基(含10%或20% FBS)。所收集的培養(yǎng)液 2 000×g離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入肖特瓶，置于4 ℃冰箱中。連續(xù)收集第1、2、3、4天的培養(yǎng)液，混勻后以500 mL抽濾瓶過(guò)濾，分裝，-80 ℃冰箱保存。

2. 小腸隱窩的分離、培養(yǎng)：腹腔麻醉后以頸椎脫臼法處死小鼠，剖腹，自末端回腸起取約15 cm腸段，置于盛有冰PBS的培養(yǎng)皿中，以鈍頭剪刀縱向剖開(kāi)，冰PBS反復(fù)漂洗去除糞便。將腸段腸腔面朝上平鋪于玻片，刮去黏液和絨毛，用刀片切成1~2 mm 的小塊。將組織塊轉(zhuǎn)入含10 mL冰PBS的50 mL 離心管中，上下顛倒離心管，靜置待組織塊沉降后負(fù)壓吸棄上層液體，重復(fù)上述過(guò)程數(shù)次，直至上清液清亮。將組織塊重懸于25 mL 2.5 mmol/L冰EDTA-PBS混合液中，置于搖床旋轉(zhuǎn)30 min。上清液轉(zhuǎn)入新的50 mL離心管中，加入冰PBS上下顛倒離心管，靜置后將上清液轉(zhuǎn)入離心管，重復(fù)此步驟3次，以70 μm細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾收集的上清液。過(guò)濾后的上清液4 ℃ 300×g離心5 min，棄上清液，以青-鏈霉素(1%)-PBS 重懸沉淀，4 ℃ 300×g離心5 min，棄上清液，以10 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸沉淀，4 ℃ 300×g離心5 min。根據(jù)沉淀量加入適當(dāng)體積的基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸沉淀，取200 μL隱窩-基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合液與400 μL基質(zhì)膠混勻，取出在培養(yǎng)箱中預(yù)熱的12孔板，于每孔中央滴加50 μL隱窩-基質(zhì)膠混合液，加樣完畢后立即將培養(yǎng)板置入培養(yǎng)箱中1 h，使基質(zhì)膠多聚化成半球形。多聚化后每孔加入1 mL不同比例的L-WRN條件培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合液以及N-2 Supplement(1%)、無(wú)維生素A型B-27?Supplement(2%)、EGF(50 ng/mL)、Jagged-1(1 μmol/L)和Y-27632(10 μmol/L)，將培養(yǎng)板重新置入培養(yǎng)箱中，每隔1 d更換培養(yǎng)基混合液和生長(zhǎng)因子。培養(yǎng)過(guò)程中顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察形態(tài)學(xué)改變，培養(yǎng)7 d左右出芽達(dá)一定長(zhǎng)度后，重新包埋傳代培養(yǎng)。

結(jié)果

一、L-WRN條件培養(yǎng)基血清含量對(duì)小腸類(lèi)器官生長(zhǎng)的影響

分別收集FBS含量為10%和20%的L-WRN條件培養(yǎng)基，將條件培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基按1∶3、1∶1、3∶1、1∶0的比例混合，培養(yǎng)結(jié)果顯示，無(wú)論是含10%還是20% FBS的條件培養(yǎng)基，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的比例為1∶3(即條件培養(yǎng)基濃度為25%)時(shí)，均可培養(yǎng)出小腸類(lèi)器官；而使用濃度為50%(1∶1)、75%(3∶1)、100%(1∶0)的條件培養(yǎng)基最終僅形成類(lèi)球體(spheroids)。與含20% FBS的L-WRN條件培養(yǎng)基相比，含10% FBS的條件培養(yǎng)基出芽率更高，更有利于小腸類(lèi)器官的體外培養(yǎng)(圖1)。

二、15% L-WRN條件培養(yǎng)基的小腸類(lèi)器官出芽率較高

為探索最佳培養(yǎng)條件，進(jìn)一步將含10% FBS L-WRN條件培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的比例細(xì)分為1∶9(10%)、3∶17(15%)、1∶4(20%)、1∶3(25%)和 3∶7(30%)，結(jié)果顯示5種比例均可促使小腸類(lèi)器官形成，15%條件培養(yǎng)基的出芽率最高(圖2)。

三、小腸隱窩培養(yǎng)體系的建立

單個(gè)小腸隱窩通過(guò)持續(xù)分裂形成隱窩-絨毛三維結(jié)構(gòu)，由襯有絨毛樣上皮的囊樣中心結(jié)構(gòu)與周?chē)[窩樣芽泡狀結(jié)構(gòu)組成(圖3e)。分離的小腸隱窩培養(yǎng)1~2 h后閉合成圓形(圖3a)，2~3 d后開(kāi)始出芽(圖3b、3c)，經(jīng)過(guò)大量出芽(圖3d)，最終形成小腸類(lèi)器官。

含10%和20% FBS的L-WRN條件培養(yǎng)基分別按1∶3、1∶1、3∶1、1∶0的比例與基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合，小腸隱窩包埋在基質(zhì)膠中(培養(yǎng)第6天，比例尺：1 mm)

圖1L-WRN條件培養(yǎng)基血清含量對(duì)小腸類(lèi)器官生長(zhǎng)的影響

10%、15%、20%、25%、30% L-WRN條件培養(yǎng)基(含10% FBS)，小腸隱窩包埋在基質(zhì)膠中(培養(yǎng)第5天，比例尺：1 mm)

圖2不同濃度L-WRN條件培養(yǎng)基出芽率比較

圖3　小腸隱窩培養(yǎng)過(guò)程中的形態(tài)學(xué)改變(箭頭所示為出芽結(jié)構(gòu)，比例尺：1 mm)

小腸干細(xì)胞位于隱窩底部，分布于Paneth細(xì)胞間，在自我更新的同時(shí)產(chǎn)生短暫擴(kuò)充細(xì)胞(transit amplifying cells, TA細(xì)胞)，后者在快速分裂并向上遷移的同時(shí)分化為腸上皮細(xì)胞等吸收型細(xì)胞以及Paneth細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、杯狀細(xì)胞等分泌型細(xì)胞，其中Paneth細(xì)胞轉(zhuǎn)向下遷移至隱窩底部，另三種細(xì)胞在向上遷移過(guò)程中逐漸成熟，到達(dá)絨毛頂端后凋亡脫落入腸腔[3]。

小腸干細(xì)胞處于特定的微環(huán)境中，該微環(huán)境能提供Wnt、Notch、EGF、骨形態(tài)生成蛋白(BMP)等信號(hào)以維持干細(xì)胞的自我更新、增殖和分化。Wnt信號(hào)在小腸隱窩-絨毛軸中呈梯度遞減，高Wnt信號(hào)的隱窩對(duì)應(yīng)于小腸干細(xì)胞區(qū)域以及增殖細(xì)胞所在部位；Wnt配體與干細(xì)胞表面的Frizzled-LRP5/6受體結(jié)合使β-catenin的穩(wěn)定性增加，β-catenin聚集并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子Tcf結(jié)合，激活Wnt通路下游靶基因轉(zhuǎn)錄，從而驅(qū)動(dòng)干細(xì)胞和TA細(xì)胞增殖[4]。Notch信號(hào)為維持細(xì)胞未分化狀態(tài)所必需，Notch受體 與DLL1/4配體結(jié)合導(dǎo)致Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)釋放并與轉(zhuǎn)錄因子RBP-J結(jié)合，抑制分泌型細(xì)胞分化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)吸收型細(xì)胞分化；如阻斷小腸干細(xì)胞和TA細(xì)胞的Notch信號(hào)，這些細(xì)胞將分化為分泌型細(xì)胞如杯狀細(xì)胞[5]。EGF通過(guò)其受體(EGFR)激活Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路，促進(jìn)干細(xì)胞和TA細(xì)胞增殖，與Wnt信號(hào)通路具有協(xié)同作用[6]。BMP信號(hào)沿小腸隱窩-絨毛軸呈梯度遞增，其與干細(xì)胞表面的受體(BMPR)結(jié)合后激活細(xì)胞內(nèi)Smad1/5/8-Smad4復(fù)合體，從而抑制干細(xì)胞自我更新和增殖，限制小腸干細(xì)胞過(guò)度激活[7]，對(duì)Wnt信號(hào)通路具有拮抗作用；同時(shí)，BMP信號(hào)在分泌型細(xì)胞的終末分化中亦發(fā)揮重要作用[8]。

基于Lgr5標(biāo)記腸道干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和對(duì)小腸干細(xì)胞微環(huán)境的深入認(rèn)識(shí)，Sato等[2]應(yīng)用含EGF、R-spondin、Noggin等的培養(yǎng)基和基質(zhì)膠，將Lgr5標(biāo)記的腸道干細(xì)胞在體外成功培養(yǎng)為隱窩-絨毛樣三維結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)包含特定組織來(lái)源的所有終末分化細(xì)胞，在形態(tài)和細(xì)胞組成上與體內(nèi)腸道極為相似。R-spondin是Lgr5的生理性配體，研究[9]發(fā)現(xiàn)經(jīng)R-spondin-1和Wnt3a刺激后，Lgr5與Wnt共受體LRP6-Frizzled5形成復(fù)合物，該復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后即被降解，從而增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號(hào)。Noggin則是BMP信號(hào)抑制劑，小鼠小腸特異性過(guò)表達(dá)Noggin時(shí)，垂直于隱窩-絨毛軸會(huì)出現(xiàn)大量異位隱窩單元[10]。隱窩底部基質(zhì)成分富含層黏連蛋白，離開(kāi)正常細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境的腸道細(xì)胞會(huì)發(fā)生失巢凋亡[11]，而Matrigel?基質(zhì)膠是一種模擬基底層富含層黏連蛋白和膠原環(huán)境的3D基質(zhì)，支持腸道上皮的三維生長(zhǎng)[12-13]。

目前國(guó)外小腸類(lèi)器官的培養(yǎng)技術(shù)有兩種：一種是在培養(yǎng)基中直接加入各種明確的化學(xué)物質(zhì)，另一種是收集L-WRN細(xì)胞的條件培養(yǎng)基用于類(lèi)器官培養(yǎng)。生長(zhǎng)因子價(jià)格昂貴，培養(yǎng)成本極高，因此利用條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)更具優(yōu)勢(shì)。L-WRN細(xì)胞來(lái)源于小鼠L細(xì)胞，系通過(guò)進(jìn)一步修飾L-Wnt3a而得到，可分泌Wnt3a、R-spondin-3和Noggin[14]。相對(duì)于由明確化學(xué)物質(zhì)組成的重組培養(yǎng)基，L-WRN條件培養(yǎng)基成本較低，且能提供相對(duì)完整的高滴度蛋白質(zhì)，激活Wnt信號(hào)通路的能力強(qiáng)。既往研究[15]發(fā)現(xiàn)，連續(xù)培養(yǎng)L-WRN細(xì)胞12 d，條件培養(yǎng)基活性不變。本研究分別使用含10%和20% FBS的初始培養(yǎng)基培養(yǎng)L-WRN細(xì)胞，連續(xù)收集前4 天的條件培養(yǎng)基，并在條件培養(yǎng)基與基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合液中加入Y-27632，Y-27632是Rho相關(guān)絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(ROCK)家族的小分子特異性抑制劑，可阻止干細(xì)胞凋亡[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是含10% FBS還是20% FBS的L-WRN條件培養(yǎng)基，其與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的比例為1∶3(條件培養(yǎng)基濃度25%)時(shí)方可觀察到小腸類(lèi)器官生長(zhǎng)，條件培養(yǎng)基濃度為50%、75%、100%時(shí)只能形成類(lèi)球體，與Miyoshi等[15]的研究結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，與含20% FBS的L-WRN條件培養(yǎng)基相比，含10% FBS的條件培養(yǎng)基出芽率相對(duì)較高，故將含10% FBS條件培養(yǎng)基的濃度梯度設(shè)置為10%、15%、20%、25%、30%作進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)5種濃度的條件培養(yǎng)基均可促使小腸類(lèi)器官形成，但濃度為15%時(shí)更有利于小腸類(lèi)器官出芽。

類(lèi)器官包含所有特化的組織細(xì)胞類(lèi)型，能模擬體內(nèi)器官的某些功能，不僅可作為有效的實(shí)驗(yàn)工具，用于研究器官發(fā)生、發(fā)展以及藥物療效和毒性，還可通過(guò)誘導(dǎo)突變以及利用某種疾病患者來(lái)源的多能干細(xì)胞研究疾病的發(fā)生、發(fā)展[17]。本研究在國(guó)內(nèi)首次成功建立了小腸類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)，是國(guó)內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域研究工作的開(kāi)端，后續(xù)將基于該平臺(tái)作更多有益的探索。

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(2015-12-23收稿)

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81401437，81170362，81370508)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.02.003

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&本文共同通信作者，童錦祿，Email: tongjinlu490@126.com；鄭青，Email: qingzheng101@163.com