顧立學(xué)，孫偉明（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外乳甲整形病區(qū)，遼寧錦州121000）

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MicroRNA-539靶向膜相關(guān)的鳥(niǎo)苷酸激酶蛋白1抑制甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲與遷移

顧立學(xué)，孫偉明
（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外乳甲整形病區(qū)，遼寧錦州121000）

摘要：目的觀察microRNA-539（miR-539）的表達(dá)對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞侵襲與遷移的影響，探究miR-539與膜相關(guān)的鳥(niǎo)苷酸激酶蛋白1（CARMA1）在甲狀腺癌中相互作用的機(jī)制。方法構(gòu)建miR-539與CARMA1高表達(dá)及低表達(dá)的細(xì)胞模型后通過(guò)transwell及MTT法檢測(cè)兩種不同的甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移及增殖能力。Western blot及RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中蛋白及mRNA表達(dá)。結(jié)果miR-539抑制甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲與遷移。通過(guò)熒光素酶報(bào)告檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-539通過(guò)靶向CARMA1的3’-UTR端從而起到抑制甲狀腺癌中CARMA1的作用。進(jìn)一步的研究證實(shí)，CARMA1可顯著促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲與遷移。而調(diào)節(jié)CARMA1的表達(dá)，miR-539隨之變化。研究還發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，甲狀腺癌中miR-539的表達(dá)量降低而CARMA1的表達(dá)量增加。結(jié)論miR-539靶向CARMA1抑制甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲與遷移。

關(guān)鍵詞：甲狀腺癌；microRNA-539；CARMA1

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤，近十年來(lái)其發(fā)病率逐年遞增[1]。miRNAs是一類天然的保守的非編碼小分子RNA，它通過(guò)與靶基因mRNA堿基配對(duì)來(lái)控制大量基因的表達(dá)，從而達(dá)到裂解、轉(zhuǎn)化mRNA的效果[2]。最近的研究表明，多種miRNA對(duì)甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展起作用[3-5]。但其具體的作用機(jī)制目前尚無(wú)研究報(bào)道，為了探尋其作用機(jī)制，筆者設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)。

1　資料與方法

1.1一般資料

收集2010年2月-2015年2月于遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院就診并經(jīng)病理證實(shí)的甲狀腺癌標(biāo)本共44例。標(biāo)本離體時(shí)間不超過(guò)30 min，將標(biāo)本一分為二，一部分送病理科，并經(jīng)病理證實(shí)，另一部分離體30 min內(nèi)凍存于液氮中。所有患者均未接受過(guò)任何形式的術(shù)前新輔助治療。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)試劑、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染miRNA類似物及抑制物（均購(gòu)自美國(guó)Ambion公司），膜相關(guān)的鳥(niǎo)苷酸激酶蛋白1（CARD domain and MAGUK domain-containing protein-1，CARMA1）及β-actin抗體（購(gòu)于美國(guó)Sigma公司），甲狀腺癌細(xì)胞【中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）】，置于DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，K1及WRO細(xì)胞按說(shuō)明書(shū)經(jīng)脂質(zhì)體3000試劑轉(zhuǎn)染（購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司）。

1.2.2細(xì)胞遷移及侵襲性分析通過(guò)transwell小室實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞的遷徙及進(jìn)展能力。轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶/EDTA處理后在含血清的DMEM培養(yǎng)基中洗1次，將細(xì)胞濃度于無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中調(diào)整至1×105并接種于下室中。除此之外，在侵襲實(shí)驗(yàn)中筆者在小室的過(guò)濾器上涂上1次45μg的基質(zhì)膠。孵育48 h后，用棉簽擦去上室中的細(xì)胞。收集下層細(xì)胞并用結(jié)晶紫染色30 min，漂洗后計(jì)數(shù)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)按說(shuō)明書(shū)操作，TRIzol法提取組織及細(xì)胞中的總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）法，TaqMan試劑盒按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。U6 snRNA作為內(nèi)參。

1.2.4RNA轉(zhuǎn)染靶向CARMA1的RNAi質(zhì)粒（購(gòu)自美國(guó)Origene公司）。

1.2.5四唑鹽比色法（MTT法）采用MTT實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞增殖能力。細(xì)胞接種于96孔板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞。孵育24 h后進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6Western blot分析放射免疫分析法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液中裂解細(xì)胞提取蛋白，BCA（bicinchonininc acid）法測(cè)蛋白濃度。采用濃度為12%凝膠進(jìn)行電泳，電泳后蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，封閉2 h后上機(jī)檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均至少重復(fù)3次。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1miR-539抑制甲狀腺癌細(xì)胞的遷移與侵襲

為了探尋miR-539對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的作用，筆者合成了1個(gè)雙鏈的miR-539類似物及1個(gè)互補(bǔ)的單鏈miR-539抑制物，并將它們轉(zhuǎn)染至K1甲狀腺癌細(xì)胞中。采用transwell實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的遷移及侵襲能力。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染了miR-539類似物的細(xì)胞遷移能力明顯下降。相反，轉(zhuǎn)染了miR-539抑制物的細(xì)胞遷移能力則明顯高于對(duì)照組。侵襲能力實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果與此相同。此外，筆者在WRO甲狀腺癌細(xì)胞中也進(jìn)行了此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與K1細(xì)胞相同。此后，筆者檢測(cè)了甲狀腺癌細(xì)胞的增殖能力，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，K1細(xì)胞及WRO細(xì)胞的增殖并不影響miR-539的量。這就表明miR-539是甲狀腺癌的1種潛在的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子。見(jiàn)圖1。

2.2miR-539作用于甲狀腺癌的靶點(diǎn)為CARMA1

miR-539可以抑制甲狀腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，因此筆者推斷存在1種特定的基因在此過(guò)程中起作用。經(jīng)過(guò)計(jì)算預(yù)測(cè)后筆者發(fā)現(xiàn)CARMA1的3’UTR端有1個(gè)miR-539的結(jié)合位點(diǎn)。為了證實(shí)筆者的推測(cè)，筆者構(gòu)建了1個(gè)野生型的CARMA1的3’UTR端及突變的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。熒光素酶活性報(bào)告顯示miR-539類似物可顯著阻礙野生型的CARMA1而對(duì)突變型則無(wú)作用，這就表明miR-539直接作用于此位點(diǎn)。緊接著，筆者檢測(cè)了miR-539對(duì)內(nèi)源性的CARMA1的表達(dá)的影響。在K1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-539可顯著降低CARMA1的mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，而抗miR-539的增加CARMA1的表達(dá)水平。這就表明miR-539直接靶向并調(diào)節(jié)CARMA1在甲狀腺癌中的表達(dá)。見(jiàn)圖2。

2.3CARMA1促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲與遷移

為了檢測(cè)CARMA1對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲與遷移的影響，筆者構(gòu)建了一系列CARMA1 RNAi的質(zhì)粒，通過(guò)RT-PCR分析顯示4#質(zhì)?？娠@著阻止K1細(xì)胞中內(nèi)源性的CARMA1的表達(dá)，而1#及2#則不能影響其表達(dá)。見(jiàn)圖3A。筆者將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至K1細(xì)胞中進(jìn)行transwell實(shí)驗(yàn)，來(lái)檢測(cè)其侵襲及遷移能力。圖3B和3C中所示，4#質(zhì)?？娠@著降低K1細(xì)胞的侵襲及遷移能力。相反，過(guò)表達(dá)CARMA1可促進(jìn)K1細(xì)胞的侵襲及遷移。綜上所述，CARMA1參與甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲及遷移。

2.4miR-539通過(guò)靶向CARMA1阻礙甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲與遷移

由于miR-539可阻礙甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲與遷移，而CARMA1是miR-539的靶向基因，那么miR-539是否通過(guò)靶向CARMA1從而在甲狀腺癌細(xì)胞中起作用的。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)CARMA1可降低miR-539對(duì)K1細(xì)胞的抑制作用。同時(shí)，miR-539的類似物及CARMA1的4#RNAi質(zhì)?？上嗷プ饔谩?yīng)用miR-539抑制劑后，K1細(xì)胞中miR-539/CARMA1信號(hào)通路的作用增加。miR-539抑制劑及CARMA1的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒相互作用可促進(jìn)K1細(xì)胞的侵襲及遷移。相反，當(dāng)用4#質(zhì)粒敲除CARMA1時(shí)K1細(xì)胞的侵襲及遷移能力下降。這些結(jié)果均證實(shí)了miR-539通過(guò)靶向CARMA1從而影響甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲與遷移。見(jiàn)圖4。

圖1　Transwell實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的遷移及侵襲能力

圖2　miR-539對(duì)內(nèi)源性的CARMA1的表達(dá)的影響

2.5甲狀腺癌細(xì)胞系及甲狀腺癌組織中miR-539 和CARMA1的表達(dá)情況

為了確定miR-539和CARMA1在甲狀腺癌中的作用，筆者檢測(cè)了人甲狀腺癌細(xì)胞系及甲狀腺癌組織中miR-539和CARMA1的表達(dá)情況。結(jié)果示：在所有甲狀腺癌細(xì)胞系中，與對(duì)照組比較miR-539的表達(dá)均較低，而CARMA1的表達(dá)量均較高。筆者又檢測(cè)了32例甲狀腺乳頭狀癌及12例甲狀腺濾泡狀癌組織，結(jié)果與細(xì)胞系的結(jié)果類似，與癌旁正常組織比較，甲狀腺乳頭狀癌及濾泡狀癌組織中miR-539表達(dá)量低而CARMA1表達(dá)量高。miR-539的表達(dá)量與CARMA1的表達(dá)量有相關(guān)性。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)miR-539和CARMA1密切相關(guān)。

圖3　Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的侵襲及遷移能力

圖4　Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的侵襲及遷移能力

3　討論

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤，近十年來(lái)其發(fā)病率逐年遞增[1]。大多數(shù)甲狀腺腫瘤起源于濾泡細(xì)胞，可分為：高分化癌，低分化癌及未分化癌[6]。高分化癌包括：濾泡狀癌和乳頭狀癌[7]，其預(yù)后較好，但總的復(fù)發(fā)率高達(dá)35%[8]。甲狀腺未分化癌則較少見(jiàn)，以侵襲性高，預(yù)后差，病死率高為特點(diǎn)[9]。

miRNAs是一類天然的保守的非編碼小分子RNA，它通過(guò)與靶基因mRNA堿基配對(duì)來(lái)控制大量基因的表達(dá)，從而達(dá)到裂解、轉(zhuǎn)化mRNA的效果[10]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明小RNAs在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖和凋亡過(guò)程中起重要的作用[11]。而關(guān)于miR-539的研究則較少。有研究表明miR-539通過(guò)抑制O-GlcNAcase的表達(dá)從而在心臟衰竭的發(fā)病過(guò)程中起作用[12]。miR-539通過(guò)靶向PHB2調(diào)節(jié)線粒體的活性[13]。最近的研究表明，多種miRNA對(duì)甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展起作用[3-5]。筆者構(gòu)建了miR-539的類似物及抑制物通過(guò)生物信息學(xué)分析及熒光素酶活性分析證實(shí)了CARMA1是miR-539的一個(gè)作用靶點(diǎn)。

CARMA1是一種細(xì)胞骨架蛋白，在T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞中參與NF-κB的激活[14-15]。大量的研究已證實(shí)CARMA1在NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用，但CARMA1在癌癥中的作用尚無(wú)研究證據(jù)表明。支架蛋白CARMA1參與TCR所致的淋巴激活過(guò)程。刺激CARMA1可激活NF-κB途徑的JNK和翻譯因子[16]。筆者的研究首次證實(shí)了CARMA1在甲狀腺癌中起作用，但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)探究其深層機(jī)制。

筆者的研究旨在探究miR-539及CARMA1對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果表明miR-539通過(guò)靶向CARMA1的3’- UTR端下調(diào)甲狀腺癌中CARMA1的表達(dá)，進(jìn)而起到抑制甲狀腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌細(xì)胞及組織中miR-539的水平與CARMA1表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。筆者的研究首次證明了甲狀腺癌細(xì)胞侵襲及遷移的機(jī)制。盡管靶向小RNA的治療方式仍處于研究中，但筆者的研究為甲狀腺癌的靶向治療提供了新的思路及理論依據(jù)，這對(duì)甲狀腺癌發(fā)病機(jī)制的探究及靶向治療有著重要的意義。

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（王榮兵編輯）

miR-539 directly targeting CARMA1 inhibits thyroid cancer cell migration and invasion

Li-xue Gu,Wei-ming Sun
(Department of Breast and Thyroid Surgery,the First Affiliate Hospital of Liaoning Medical University,Jinzhou,Liaoning 121000,China)

Abstract:Objective To observe the impact of miR-539 on the invasion and migration of human thyroid carcinoma,and to investigate the interaction mechanism between miR-539 and caspase recruitment domain-containing membrane-associated guanylate kinase protein 1 (CARMA1).Methods The ability of cells to migrate and invade was assayed using transwell inserts and MTT assay.The expressions of miR-539 and CARMA1 in thyroid cancer cells were detected by Western blot and RT-PCR.Results miR-539 inhibited the invasion and migration of thyroid cancer cells.Luciferase reporter assay confirmed that miR-539 binding to the 3'-UTR region of CARMA1 inhibited the expression of CARMA1 in thyroid cancer cells.Further studies demonstrated that CARMA1 significantly promoted the migration and invasion of thyroid cancer cells.miR-539 changed as the expression of CARMA1 was regulated.Furthermore,the expression of miR-539 decreased while the expression of CARMA1 increased in thyroid cancer cell lines and thyroid cancer tissues compared with controls.Conclusions miR-539 can regulate migration and invasion in human thyroid cancer cells by targeting CARMA1.

Keywords:thyroid cancer; microRNA; CARMA1

收稿日期：2015-11-25

文章編號(hào)：1005-8982（2016）06-0045-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.06.010

中圖分類號(hào)：R736.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A