黎力平 林淼 李龍 鄭龍 朱同玉

·論著·

大鼠腎臟皮質(zhì)中分離出新型間質(zhì)細(xì)胞
——特絡(luò)細(xì)胞

黎力平1, 2林淼3李龍1, 2鄭龍1, 2朱同玉1, 2

目的 分析SD大鼠腎臟皮質(zhì)中特絡(luò)細(xì)胞(TC)的形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)特征。方法 手術(shù)獲取4周雄性SD大鼠腎臟皮質(zhì)，使用二型膠原酶等消化酶獲取細(xì)胞，利用顯微切割的方法分離純化并原代培養(yǎng)TC。利用相差顯微鏡觀察并鑒定原代培養(yǎng)的TC。免疫熒光檢測TC、成纖維細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)中CD34、CD117、CD63、Ⅳ型膠原蛋白及層黏連蛋白(LN)的表達(dá)情況。利用透射電子顯微鏡(TEM)觀察TC形態(tài)學(xué)特征。結(jié)果 腎臟皮質(zhì)中能分離出TC，且可以體外原代培養(yǎng)，其形態(tài)學(xué)特征與其他器官中發(fā)現(xiàn)的TC相似。免疫熒光檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)TC表達(dá)CD117、CD34及CD63 3種細(xì)胞表面分子，以及腎小管和腎小球基底膜的主要成分Ⅳ型膠原蛋白及LN，明顯與成纖維細(xì)胞及MSC不同。TEM檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TC位于腎臟皮質(zhì)的間質(zhì)區(qū)域、腎小管及血管周圍。結(jié)論 大鼠腎臟皮質(zhì)存在TC，由于其表達(dá)CD117、CD34、CD63、Ⅳ型膠原蛋白及LN，提示其可能在促進(jìn)基底膜再生及腎臟損傷修復(fù)過程中發(fā)揮功能。

特絡(luò)細(xì)胞； 成纖維細(xì)胞； 間充質(zhì)干細(xì)胞； 大鼠； 腎臟皮質(zhì)

1899年，西班牙神經(jīng)解剖學(xué)家卡扎爾在人體胃腸道中首次發(fā)現(xiàn)了一種被稱為“間質(zhì)神經(jīng)元”的特殊細(xì)胞——卡扎爾細(xì)胞[1]。這種細(xì)胞被認(rèn)為是胃腸道起搏器，能夠影響胃腸道活動(dòng)及神經(jīng)傳遞[2-3]。Popescu研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一種與卡扎爾細(xì)胞形態(tài)十分相似的間質(zhì)細(xì)胞也存在于消化道以外的空腔器官，當(dāng)時(shí)這種間質(zhì)細(xì)胞被命名為卡扎爾樣間質(zhì)細(xì)胞(interstitial Cajal-like cell，ICLC)[4-5]。但進(jìn)一步研究表明，ICLC與卡扎爾細(xì)胞存在明顯差異，僅形態(tài)學(xué)特征就可將ICLC與其他間質(zhì)細(xì)胞區(qū)分開來，因此，Popescu等人[6]認(rèn)為ICLC可能是一種新型間質(zhì)細(xì)胞。

根據(jù)前期關(guān)于ICLC的研究結(jié)果，Pospesu等[6]于2010年首次提出并命名了一種特殊類型的間質(zhì)細(xì)胞——特絡(luò)細(xì)胞(telocyte，TC)；這些間質(zhì)細(xì)胞擁有非常細(xì)長的細(xì)胞延伸部分(telopod，Tp)，該部分由膨大節(jié)段及細(xì)長節(jié)段交替組成。后續(xù)研究進(jìn)一步闡明了其特征：TC胞體中胞漿含量較少，膨大部分中富含線粒體，細(xì)胞間聯(lián)系緊密。目前，TC已被證實(shí)存在于多種器官和組織中，包括心臟、肺血管、腸道、腸系膜、膽囊、子宮、輸卵管、胸膜、骨骼肌、胰腺外分泌部、乳腺以及胎盤[7-20]。

腎臟間質(zhì)可以影響腎臟功能[21-23]，細(xì)胞與急性間質(zhì)性腎炎、慢性移植物排斥反應(yīng)及缺血再灌注損傷等也有密切聯(lián)系[24-27]。傳統(tǒng)理論認(rèn)為，成纖維細(xì)胞及免疫細(xì)胞是腎臟間質(zhì)中的主要細(xì)胞[28]。但傳統(tǒng)概念中的腎臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞間存在極大的形態(tài)差異，部分細(xì)胞與TC形態(tài)有一定的相似性，因此將這些細(xì)胞籠統(tǒng)地全部稱為成纖維細(xì)胞并不合適。本研究通過原代分離培養(yǎng)、免疫熒光、透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)等方法分離、鑒定SD大鼠腎臟中的TC，根據(jù)表面標(biāo)志物比較其與成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)的區(qū)別，推測其潛在的功能。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MSC及腎成纖維細(xì)胞均購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司，MSC培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，腎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 分離純化及原代培養(yǎng)TC

4周雄性SD大鼠購自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所有動(dòng)物的使用均通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理審批。動(dòng)物等級(jí)為SPF級(jí)。無菌條件下獲取大鼠腎臟皮質(zhì)，使用無菌剪刀將組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm的塊狀，PBS(美國Gibco公司)清洗3次。消化液為使用不含鈣離子及鎂離子的PBS配置的10 mg/mL二型膠原酶(美國Sigma公司)及2 000 U/mL DNA酶(美國Sigma公司)。組織置于37 ℃振蕩器中消化4 h。收集的細(xì)胞懸液1 500轉(zhuǎn)離心5 min，移至40 μm細(xì)胞過濾器(美國BD Falcon公司)中過濾。細(xì)胞接種于10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。使用相差顯微鏡(IX51-DPT2-CCD，日本奧林巴斯公司)觀察細(xì)胞生長。原代細(xì)胞及早期幾代細(xì)胞中，雜細(xì)胞(如腎小管上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞)數(shù)量較多，可使用顯微切割方法去除。具體方法：TC成簇生長后，于相差顯微鏡下利用細(xì)胞刮刀刮除雜細(xì)胞，棄去上層雜細(xì)胞懸浮液，PBS沖洗，重復(fù)數(shù)次直至鏡下觀察效果滿意，而后行細(xì)胞傳代。

1.3 細(xì)胞免疫熒光

取大鼠原代TC、腎成纖維細(xì)胞及MSC，分別接種于放有無菌蓋玻片的24孔板，每孔接種約1×104個(gè)細(xì)胞，2～3 d后用PBS清洗3次，每次5 min；-20 ℃預(yù)冷甲醇固定20 min，PBS清洗3次，每次5 min；10%胎牛血清白蛋白(美國Gibco公司)室溫封閉1 h，滴加200 μL羊抗大鼠CD34一抗(1/300，美國R&D公司)，4 ℃孵育過夜，PBS清洗3次，每次5 min；然后加200 μL 異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的兔抗羊二抗(1/ 200，美國Jackson公司)，室溫避光孵育1 h，PBS清洗3次，每次5 min；最后用DAPI染核，室溫避光孵育15 min。同時(shí)，設(shè)立不加一抗的陰性對(duì)照，剩余步驟同前，熒光顯微鏡(IX51-DPT2-CCD，日本奧林巴斯公司)下觀察。

檢測CD117表達(dá)時(shí)使用的一抗為兔抗大鼠CD117(1/300，美國Novus公司)，二抗為Fitc標(biāo)記的羊抗兔二抗(1/ 200，美國Jackson公司)；檢測Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)時(shí)使用的一抗為兔抗大鼠Ⅳ型膠原蛋白一抗(1/300，美國R&D公司)，二抗為FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(1/200，美國Jackson公司)；檢測層黏連蛋白(laminin，LN)表達(dá)時(shí)使用的一抗為兔抗大鼠LN一抗(1/300，美國R&D公司)，二抗為FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(1/ 200；美國Jackson公司)；檢測CD63表達(dá)時(shí)使用的一抗為兔抗大鼠CD63一抗(1/100，美國Santa Cruz公司)，二抗為FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(1/200，美國Jackson公司)。

1.4 TEM

獲取SD大鼠腎臟標(biāo)本，使用0.1 mol/L的PBS(pH為7.2)配置的2.5%谷氨酰胺固定，而后使用1.0%鋨酸(美國Polysciences公司)固定1 h。去離子水沖洗標(biāo)本，乙醇梯度脫水(30%、50%、70%、85%、90%乙醇各1次，100%乙醇2次)后使用Eponate 812環(huán)氧樹脂包埋(瑞典Ted Pella公司)，梯度升溫烘干。使用超微顯微鏡薄片切片機(jī)(LKB-Ⅱ,德國Leica Microsystems公司)切取組織，厚度為50 nm，3%醋酸鈾和檸檬酸鉛染色。TEM(飛利浦CM120型)觀察，數(shù)碼相機(jī)獲取圖片。

2 結(jié) 果

2.1 TC原代培養(yǎng)

在相差顯微鏡下能觀察到富含細(xì)長念珠狀突起的紡錘形細(xì)胞，與TC的形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)相符合(見圖1)。一個(gè)典型的TC有1個(gè)Tp，該Tp中含有多個(gè)細(xì)長部分和膨大部分；另一個(gè)TC有多個(gè)Tp。TC呈紡錘形，隨著細(xì)胞密度的增加，細(xì)胞的突起也更多。

注： TC. 特絡(luò)細(xì)胞；Tp. 細(xì)胞延伸部分； 圖中可見數(shù)個(gè)TC，其中一個(gè)TC有1個(gè)Tp；另一個(gè)TC有多個(gè)Tp，并與其他TC有聯(lián)系

2.2 TC表面標(biāo)志物

我們利用細(xì)胞免疫熒光檢測CD117、CD34及CD63 3種細(xì)胞表面分子和腎小管、腎小球基底膜主要成分Ⅳ型膠原蛋白及LN的表達(dá)。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原代培養(yǎng)的TC表達(dá)CD34、CD117及CD63，高表達(dá)Ⅳ型膠原蛋白及LN(見圖2)。MSC不表達(dá)CD34，低表達(dá)CD117及CD63，高表達(dá)Ⅳ型膠原蛋白及LN；腎成纖維細(xì)胞不表達(dá)CD34、LN及CD63，表達(dá)CD117及Ⅳ型膠原蛋白(見圖3～4)。

注： 原代培養(yǎng)的特絡(luò)細(xì)胞表達(dá)CD34(圖2a)、CD117(圖2b)及CD63(圖2c)，高表達(dá)層黏連蛋白(圖2d)及Ⅳ型膠原蛋白(圖2e)

注： 間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)CD34(圖3a)，低表達(dá)CD117(圖3b)及CD63(圖3c)，高表達(dá)層黏連蛋白(圖3d)及Ⅳ型膠原蛋白(圖3e)

注： 成纖維細(xì)胞不表達(dá)CD34(圖4a)、CD63(圖4c)及層黏連蛋白(圖4d)，低表達(dá)CD117(圖4b)及IV型膠原蛋白(圖4e)

2.3 定位腎臟TC并分析其形態(tài)特征

我們使用TEM定位腎臟標(biāo)本中TC，分析其在體形態(tài)學(xué)特征。發(fā)現(xiàn)TC位于腎小管及血管的周圍，以其非常細(xì)長且彎曲Tp包繞內(nèi)皮細(xì)胞或基底膜，其細(xì)長節(jié)段及膨大節(jié)段結(jié)構(gòu)清晰可見(見圖5)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)TC在活體中不止存在1個(gè)Tp，TC的形態(tài)與Tp的數(shù)量有關(guān)。

注： 可見典型的特絡(luò)細(xì)胞(TC)，其有特征性的細(xì)胞延伸部分(Tp)、膨大節(jié)段及細(xì)長節(jié)段(圖5a)；TC位于腎小管及血管的周圍，可見到腎小管基底膜(BM)、內(nèi)皮細(xì)胞(E)、線粒體(m)及紅細(xì)胞(RBC)(圖5b)

3 討 論

研究證實(shí)多種器官與組織中都存在TC，這些研究分別利用細(xì)胞培養(yǎng)、免疫熒光及TEM等方法分離和鑒定TC[7-20]。目前TC的公認(rèn)特征如下：(1)位于腎小管外的間質(zhì)部位；(2)胞體呈紡錘形、梭形或多角邊形；(3)富含Tp，Tp能產(chǎn)生分枝并與周圍細(xì)胞及組織形成廣泛聯(lián)系；(4)膨大節(jié)段及核周胞漿中富含線粒體；(5)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD117及CD34陽性。

本研究分離鑒定的細(xì)胞均具有以上特征。細(xì)胞培養(yǎng)、TEM均提示TC位于腎臟皮質(zhì)的間質(zhì)區(qū)域。細(xì)胞原代培養(yǎng)中能觀察到形態(tài)典型的TC。免疫熒光檢測結(jié)果顯示其表達(dá)CD34及CD117，與MSC及腎成纖維細(xì)胞有明顯區(qū)別。TEM發(fā)現(xiàn)TC多存在于血管及腎小管周圍并以Tp包繞基底膜。因此，形態(tài)特征及細(xì)胞表面標(biāo)志物可以證明在腎臟皮質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的新型間質(zhì)細(xì)胞是TC。

雖然在多種器官及組織中已證實(shí)TC的存在，但關(guān)于其具體功能的研究仍比較缺乏。有研究發(fā)現(xiàn)，在心臟缺血再灌注損傷的體外實(shí)驗(yàn)中，心臟干細(xì)胞及TC共培養(yǎng)能促進(jìn)心臟干細(xì)胞的增殖，相似結(jié)果在骨骼肌再生的實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)[29-30]。Manole等[31]通過建立大鼠急性心梗死模型發(fā)現(xiàn)，TC會(huì)在新生的血管周圍聚集，免疫組織化學(xué)法證實(shí)其能通過旁分泌的方式分泌血管內(nèi)皮生長因子或一氧化氮合酶，促進(jìn)血管再生，此外還發(fā)現(xiàn)TC表達(dá)多種血管再生相關(guān)微RNA。另有研究證實(shí)，于心臟缺血30 min 內(nèi)行TC回輸能減少心肌梗死面積、改善心臟功能[32]。有學(xué)者將血管周圍的各種腫瘤細(xì)胞分子標(biāo)志物與TC進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)TC與某些腫瘤有潛在的關(guān)系，他們進(jìn)一步利用免疫組織化學(xué)法分析相關(guān)正常組織及腫瘤病理標(biāo)本，提出了TC可能與多個(gè)器官的某些病理改變密切相關(guān)的假設(shè)[33-34]。

我們研究發(fā)現(xiàn)TC主要聚集于腎血管及腎小管周圍，同時(shí)TC高表達(dá)Ⅳ型膠原蛋白及LN，而Ⅳ型膠原蛋白及LN是血管及腎小管基底膜的主要成分，提示TC與腎小管基底膜和腎內(nèi)血管穩(wěn)定性可能存在聯(lián)系。有研究通過基因表達(dá)譜也發(fā)現(xiàn)TC與MSC及成纖維細(xì)胞間基因表達(dá)存在明顯差異，TC高表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metallopeptidase 3，MMP3)、金屬蛋白酶組織抑制劑3(tissue inhibitor of metalloproteinase 3，TIMP3)及Ⅳ型膠原蛋白α等基因[35]。而MMP3與TIMP3能維持基底膜的動(dòng)態(tài)平衡，這些證據(jù)進(jìn)一步提示TC在腎臟再生修復(fù)中可能發(fā)揮重要的作用。

此外，我們研究發(fā)現(xiàn)TC也表達(dá)CD63分子，該分子能夠激活金屬蛋白酶組織抑制劑1-CD63-整合素β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，繼而通過激活PI3K-ERK信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白分子，發(fā)揮抑制內(nèi)源性及外源性細(xì)胞凋亡途徑的作用[36]。TC作為間質(zhì)來源細(xì)胞，有較強(qiáng)的抗損傷能力，CD63可能是其抗損傷的關(guān)鍵分子之一。

綜上所述，我們在大鼠腎臟皮質(zhì)中分離并鑒定了TC，并發(fā)現(xiàn)其主要位于腎血管及腎小管周圍，表達(dá)Ⅳ型膠原蛋白、LN及CD63分子，提示其可能有促進(jìn)基底膜再生及腎臟損傷修復(fù)的功能。

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(本文編輯：徐小明)

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A new type of interstitial cell in rat renal cortex: telocyte

LiLiping1, 2,LinMiao3,LiLong1, 2,ZhengLong1, 2,ZhuTongyu1, 2.

1DepartmentofUrology,2ShanghaiKeyLabofOrganTransplantation,3DepartmentofThoracicSurgery,ZhongshanHospital,AffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200032,China

ZhuTongyu,Email:tyzhu@fudan.edu.cn

Objective To investigate the morphological and molecular biological features of telocyte(TC)in rat renal cortex. Methods Kidneys of four weeks old SD rats were taken from surgery. The method of microdissection was used to isolate and purify TC. Phase contrast microscope was used to observe and identify TC in rat renal cortex. Immunofluorescence was used to detect the molecular biomarkers including CD34, CD117, CD63, collagen Ⅳ and laminin of TC, fibroblast and mesenchymal stem cell. Transmission electron microscope (TEM) was used to observe the morphological features of TC. Results Typical TC could be isolated from rat renal cortex, whose morphological features were similar to TC which was found in other organs. The experimental results of immunofluorescence showed that CD34, CD117, CD63, and collagen Ⅳ and laminin were expressed in TC, which was obviously different from fibroblast and mesenchymal stem cell. Typical TC observed by TEM was ditributed around blood capillaries and renal tubules in rat kidney interstitium. Conclusions TC expressing CD34, CD117, CD63, collagen Ⅳ and laminin could be found in kidney interstitium, which prompted us that they might play a role during processes like basement membranes regeneration and kidney injury recovery.

Telocyte; Fibroblast; Mesenchymal stem cell; Rat; Renal cortex

10.3877/cma.j.issn.1674-3903.2016.02.007

200032 上海，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科1, 上海市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2, 胸外科3

朱同玉, Email: tyzhu@fudan.edu.cn

2016-04-22)