胡彩霞,江紹乾,張國強(qiáng),馮　佳,田　菲,高順強(qiáng)*(.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院皮膚科,河北 石家莊 0500;.中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 石家莊 05008;.河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院皮膚科,河北 邢臺(tái) 054000)

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·論著·

2-甲氧基雌二醇對惡性黑素瘤種植性腫瘤的體內(nèi)抑制作用

胡彩霞1,江紹乾1,張國強(qiáng)1,馮佳2,田菲3,高順強(qiáng)1*(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院皮膚科,河北 石家莊 050011;2.中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 石家莊 050082;3.河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院皮膚科,河北 邢臺(tái) 054000)

[摘要]目的探討2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)對惡性黑素瘤(malignant melanoma，MM)細(xì)胞在小鼠體內(nèi)生長的抑制作用。方法應(yīng)用噻唑藍(lán)[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]方法檢測2-ME對黑素瘤B16細(xì)胞的抑制作用。構(gòu)建BALB/c小鼠的惡性黑素瘤細(xì)胞種植性腫瘤模型，分為3組，每組6只。治療組(2-ME組)每只小鼠尾靜脈注射50 mg/ kg 2-ME，陽性藥物組[環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)組]每只小鼠尾靜脈注射20 mg/kg CTX，陰性對照組(Nacl組)注射相同體積的生理鹽水， 2 d/次，共14 d，每3 d測量腫瘤體積，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱量腫瘤質(zhì)量；免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)方法對腫瘤組織Gadd45b和C-myc蛋白的表達(dá)變化進(jìn)行分析，HE染色對治療組和陰性對照組小鼠的腫瘤組織、肺組織、肝組織和脾組織進(jìn)行形態(tài)分析。結(jié)果2-ME對黑素瘤B16細(xì)胞具有明顯的抑制作用，且對B16細(xì)胞的抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴性。CTX組和2-ME組腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量均小于Nacl組(P<0.01)，但CTX組與2-ME組之間腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。IHC實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，2-ME組小鼠腫瘤組織中C-myc蛋白表達(dá)水平明顯升高，Gadd45b蛋白表達(dá)水平明顯降低。HE染色結(jié)果顯示，2-ME組小鼠和對照組小鼠的肝及脾均無明顯的組織形態(tài)改變，而3/6的對照組小鼠發(fā)生肺組織轉(zhuǎn)移，2-ME組肺臟無明顯改變。結(jié)論2-ME對黑素瘤B16荷瘤小鼠的腫瘤生長具有抑制作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)C-myc和Gadd45b基因表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]痣和黑素瘤；雌二醇；小鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.011

惡性黑素瘤(malignant melanoma，MM)惡性程度高，具備高侵襲性及增殖能力，腫瘤細(xì)胞易發(fā)生淋巴及血行轉(zhuǎn)移且預(yù)后差。MM占全部腫瘤患者的2%左右，占皮膚惡性腫瘤的第3位，其發(fā)病年增長率為3%～5%[1]。李薇薇等[2]研究1983—2010年70例皮膚黑素瘤，近10年病例占87.1%，近5年占70%?？梢娫谥袊谒亓霭l(fā)病率呈增長趨勢。2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)是一種甾體激素類化合物，為17β-雌二醇非極性的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，本實(shí)驗(yàn)前期研究結(jié)果顯示2-ME體外對惡性黑素瘤B16細(xì)胞具有明顯的生長抑制作用，并且2-ME可誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[3]。為進(jìn)一步研究2-ME在體內(nèi)對黑素瘤細(xì)胞的作用，本研究選擇2-ME行小鼠體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)，以期探索將2-ME作為黑素瘤治療藥物的可能。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c型小鼠18只，5～6周齡，20～22 g，均為雌性，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[生產(chǎn)許可證編號：SCXK(京)2012-0001]，在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)(在無特異病原菌級條件下飼養(yǎng))。本研究均經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物管理使用委員會(huì)和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料2-ME產(chǎn)自美國Cayman公司(貨號13021，批號0433445-9，純度≥95%)；胎牛血清產(chǎn)自杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI 1640和胰蛋白酶產(chǎn)自美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)產(chǎn)自天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；Gadd45b、C-myc抗體購自美國bioworld公司；噻唑藍(lán)[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]產(chǎn)自美國Sigma公司； SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)小鼠黑素瘤B16細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1細(xì)胞活力檢測應(yīng)用MTT法測定2-ME對細(xì)胞增殖的抑制作用，設(shè)置陰性對照組(僅有單細(xì)胞懸液)和實(shí)驗(yàn)組，陰性對照組加入等體積的含有0.01%DMSO的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組使2-ME終濃度分別為10、20、40 μmol/L并做標(biāo)記，培養(yǎng) 24、48、72 h后用酶標(biāo)儀于波長 570 nm 處測定吸光度(optical delnsity，OD)值，抑制率 CI(%)=(1-試驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4.2小鼠種植性腫瘤模型的建立、干預(yù)及標(biāo)本處理于BALB/c型小鼠右肩胛皮下注射處于對數(shù)生長期的B16細(xì)胞0.2 mL(含2×105細(xì)胞)，當(dāng)腫瘤體積增長到約0.1 cm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為3組，每組6只。治療組(2-ME組)每只小鼠尾靜脈注射2-ME(50 mg/kg)，陽性藥物組[環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)組]每只小鼠尾靜脈注射CTX(20 mg/kg)，陰性對照組(Nacl組)小鼠注射相同體積的生理鹽水，2 d/次，共14 d。觀察腫瘤的生長情況，按公式計(jì)算腫瘤體積=(1/2×長×寬2)。22 d后處死小鼠并稱量瘤體質(zhì)量。

1.4.3免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)檢測細(xì)胞蛋白將2-ME組及0.9%生理鹽水組小鼠腫瘤制成石蠟切片，按鏈霉菌抗生素蛋白過氧化物酶鏈接法(strptavidin-perosidase,SP)免疫組織化學(xué)試劑盒說明書所述方法檢測C-myc、Gadd45b蛋白的表達(dá)情況。C-myc、Gadd45b抗體按 1∶100 稀釋，生物素化山羊抗兔二抗和辣根過氧物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素(三抗)為試劑盒中的原液。二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)試劑顯色后，終止顯色，用蘇木精染色，分化及中性樹膠封片，光鏡下觀察結(jié)果。

1.4.4HE染色檢測細(xì)胞形態(tài)變化將2-ME組及0.9%生理鹽水組小鼠腫瘤組織、肝、肺和脾組織制成石蠟切片，封片后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較分別采用F檢驗(yàn)、q檢驗(yàn)和重復(fù)測量設(shè)計(jì)資料的方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.12-ME對惡性黑素瘤B16細(xì)胞增殖的抑制作用以10、20、40 μmol/L濃度的2-ME處理 B16 細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，與陰性對照組在24、48、72 h的OD值進(jìn)行比較。結(jié)果表明：不同濃度的2-ME對黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖的抑制作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=920.783，P< 0.05)；在培養(yǎng)24、48、72 h后2-ME對黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖的抑制作用存在差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6 245.727，P< 0.05)；藥物濃度和培養(yǎng)時(shí)間之間存在交互作用(F=1 199.587，P< 0.05)。

2.22-ME體內(nèi)抑制腫瘤的形成與Nacl組相比，2-ME能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長。腫瘤細(xì)胞接種7 d后，Nacl組小鼠的腫瘤體積開始增加，生長速度較快，而2-ME組及CTX組小鼠腫瘤體積增長緩慢。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，CTX組和2-ME組腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量均小于Nacl組(P<0.01)，但CTX組與2-ME組之間腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表13組腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量比較

Table 1Comparisons of average volume and weight of

tumor tissue among three groups

組別腫瘤體積(cm3)腫瘤質(zhì)量(mg)Nacl組 2.931±0.308 0.812±0.110 CTX組 1.209±0.301*0.343±0.048*2-ME組0.971±0.063*0.302±0.042*F73.63960.203P0.0000.000

*P<0.05與Nacl組比較(q檢驗(yàn))

2.32-ME體內(nèi)調(diào)控Gadd45b和C-myc蛋白的表達(dá)對2-ME組和Nacl組荷瘤小鼠腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。C-myc蛋白陽性染色定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒狀分布。Gadd45b蛋白陽性染色定位于細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒分布。Nacl組Gadd45b在腫瘤細(xì)胞中無或微量表達(dá)，2-ME組Gadd45b在腫瘤細(xì)胞中大量表達(dá)，Nacl組C-myc在腫瘤細(xì)胞大量表達(dá)，部分呈彌漫性強(qiáng)染色，2-ME組C-myc在腫瘤細(xì)胞中微量表達(dá)。與Nacl組相比，2-ME有降低 C-myc蛋白表達(dá)水平，升高 Gadd45b蛋白表達(dá)水平的趨勢。見圖1。

2.42-ME對小鼠肝、肺、脾及腫瘤組織形態(tài)的影響對2-ME組和Nacl組荷瘤小鼠的肝、肺、脾組織及腫瘤組織進(jìn)行HE染色。結(jié)果顯示：2-ME組腫瘤組織的瘤細(xì)胞密度較稀，間質(zhì)較多，可見壞死、凋亡的細(xì)胞，含色素顆粒細(xì)胞較Nacl組明顯增多，小鼠肝、肺及脾組織結(jié)構(gòu)清晰，染色均一；與2-ME組相比，Nacl組可見數(shù)量多且排列緊密體積較大的瘤細(xì)胞，細(xì)胞核異型性明顯，部分腫瘤細(xì)胞呈巢狀排列，小鼠的肝及脾組織未見明顯的組織病理學(xué)改變，而Nacl組3/6肺組織中出現(xiàn)少量轉(zhuǎn)移灶。表明2-ME對小鼠可能沒有潛在的毒性，且能抑制黑素瘤的轉(zhuǎn)移。見圖2。

3討論

2-ME是一種甾體激素類化合物，為17β-雌二醇非極性的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物。后者是存在人類體內(nèi)的天然雌激素，在細(xì)胞色素p450酶的作用下，17β-雌二醇被羥基化成為2-脫氫雌二醇，進(jìn)一步被兒茶酚胺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化形成 2-ME。大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2-ME具有多種生物學(xué)功能[4-5]。目前的研究結(jié)果顯示，其抗腫瘤的作用機(jī)制包括：①調(diào)控低氧誘導(dǎo)因子1和抑制血管生成，2-ME的抗血管新生機(jī)制除直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)其凋亡、抑制其增殖外, 還與其對腫瘤細(xì)胞分泌的促血管新生因子的影響有關(guān)；②抑制微管蛋白聚合；③抑制有絲分裂和誘導(dǎo)凋亡；④可以減少超氧化物歧化酶活性，發(fā)揮抗腫瘤作用。并且2-ME在多種荷瘤動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著的抑制腫瘤生長的作用，其中包括 Meth-A 肉瘤、非雌激素依賴的( MDA-MB-435)乳腺癌、宮頸癌多發(fā)性骨髓瘤和HCT-116裸鼠的移植瘤模型[6]。在小鼠的乳腺癌動(dòng)物模型中，2-ME體內(nèi)抗腫瘤活性被加以評估，用2-ME每天100 mg/kg聯(lián)合環(huán)磷酰胺腹膜途徑給藥，持續(xù)21 d，結(jié)果抑瘤率達(dá)82%[7]。但迄今為止，國內(nèi)外2-ME對MM體內(nèi)外抑瘤效果的研究報(bào)道很少。

本研究結(jié)果顯示：在2-ME藥物治療組的小鼠MM瘤體的平均質(zhì)量和體積較Nacl組瘤體明顯減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明2-ME能夠抑制小鼠黑色素移植瘤的生長；2-ME處理組小鼠肝、脾、肺組織結(jié)構(gòu)清晰，染色均一，而Nacl組3/6出現(xiàn)了肺組織的轉(zhuǎn)移，這說明2-M對小鼠可能不存在潛在的毒性作用，且可抑制MM的轉(zhuǎn)移。

人類C-myc為原癌基因，定位于第8染色體q24上，其結(jié)構(gòu)包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，該基因表達(dá)的蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，是細(xì)胞增殖、分化和凋亡的重要調(diào)節(jié)因子[8]。由于C-myc具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制分化的作用，C-myc的異常表達(dá)有促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的潛能。既往的研究中發(fā)現(xiàn)，C-myc蛋白在多種人類癌癥細(xì)胞中都存在過度的表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，與Nacl組相比，2-ME處理組的蛋白表達(dá)水平明顯下降。提示2-ME能夠通過降低C-myc的表達(dá)水平達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的增殖的目的。具體的調(diào)控機(jī)制仍不明確，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。

Gadd45b屬于生長阻滯和DNA損傷誘生蛋白45基因家族，該基因家族是在研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸過程中新發(fā)現(xiàn)的基因家族，屬于抑癌基因p53和BRCA1的下游靶基因。其基因編碼的蛋白是抑制細(xì)胞生長和細(xì)胞凋亡過程中的重要介導(dǎo)者, 具有調(diào)控細(xì)胞的增生、監(jiān)測細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)控制細(xì)胞的負(fù)性生長等DNA損傷修復(fù)途徑相關(guān)的功能[10]。Gadd45b表達(dá)或功能異常導(dǎo)致p53介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)途徑異?；蜃钄?，而既往研究表明p53蛋白分布與黑素瘤病理學(xué)類型、病理分級和分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后相關(guān)[11]，而且Gadd45b參與了NF-κB和C-Jun氨基末端激酶之間的通路, 它通過抑制JNK通路抑制細(xì)胞凋亡[12]。 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gadd45b表達(dá)水平在應(yīng)用2-ME后較Nacl組有明顯升高，進(jìn)而使Gadd45b發(fā)揮其抑制細(xì)胞增殖的作用，促使癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，2-ME對小鼠黑素瘤種植性腫瘤的治療有效，并且Gadd45b及C-myc基因在腫瘤形成的過程中發(fā)揮了重要作用，但其具體作用機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步探討，以便盡早為MM的治療提供新的治療思路和方法。(本文圖見封三)

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(本文編輯：劉斯靜)

Inhibition effects of 2-methoxyestradiol on melanoma xenograft tumor in vivo

HU Cai-xia1, JIANG Shao-qian1, ZHANG Guo-qiang1,FENG Jia2, TIAN Fei3, GAO Shun-qiang1*

(1.Department of Dermatology, the Forth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang050011， China； 2.Department of Gastroenterology, the Bethune International Peace Hospital,Shijiazhuang 050082， China；3.Department of Dermatology, the People，s Hospital of Xingtai City, Hebei Province， Xingtai 054000， China)

[Abstract]ObjectiveTo study the inhibition effects of 2-methoxyestradiol(2-ME) on malignant melanoma(MM) cells in BALB/c mice xenograft tumor.MethodsThe inhibition effects of 2-ME on MM cells were measured by 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT). Building BALB/c mice xenograft tumor model, BALB/c mice were divided into three groups with six mice in each group. Treatment group and negative control group were treated with 2-ME(50 mg/kg) and equally volume normal saline respectively every two days, for a 14-days duration and calculated the average volume every three days. Positive drug group were treated with CTX(20 mg/kg). After experiment ended, the tumor weight were calculated. The expression levels of C-myc and Gadd45b in tumor were detected by immunohistochemical. Morphological changes of tumor tissue, lung, liver and spleen tissues were observed by HE staining. Results2-ME had obvious inhibitory effect on melanoma cells and the inhibitory effect in a dose-time dependent manner. Compared with the Nacl group, the volume and weight of tumor tissues in CTX group and 2-ME group were reduced remarkably(P<0.01), but there was no statistical signifieance between the CTX group and the 2-ME group(P>0.05). Comparing to control group, the expression levels of C-myc were decreased, while Gadd45b were increased. No obvious morphological changes were found in liver and spleen tissues in treatment group and in control group, but there were lung metastasis in 3 of 6 mice. Conclusion2-ME had inhibitory effect on BALB/c mice xenograft tumor, and the mechanism may be related to modulating gadd45b and C-myc genes expression.

[Key words]nevi and melanomas; estradiol; mice

[中圖分類號]R739.5

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)03-0289-05

[作者簡介]河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(20130252) 胡彩霞(1982-),女,河北衡水人,河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院主治醫(yī)師,醫(yī)學(xué)碩士,從事黑素瘤診治及激光美容研究。*通訊作者。E-mail:gshunqiang@medmail.com.cn

[收稿日期]2015-07-02；[修回日期]2015-09-25