王宏利，沙小瑩，郭雅玲，張新昀,羅改云

(西安市第八醫(yī)院 肝病6科,陜西 西安710061)

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乙肝相關(guān)性肝癌組織中HBx和CEACAM1的表達水平及意義

王宏利，沙小瑩，郭雅玲，張新昀,羅改云

(西安市第八醫(yī)院 肝病6科,陜西 西安710061)

摘要：目的研究HBx和CEACAM1在乙肝相關(guān)性肝癌組織中的表達水平，以期為肝癌發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)和防治策略。方法收集本院血清乙肝病毒表面抗原(HBVsAg)陽性的原發(fā)性肝癌患者癌組織標(biāo)本80例，采用免疫組化法檢測HBx和CEACAM1的表達水平；采用Western blot和RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染乙肝病毒(HBV)X基因的人肝細胞株(PcDNA3-X/HL-7702細胞)、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的人肝細胞株(PcDNA3/HL-7702細胞)及未表達乙肝病毒(HBV)X基因的人肝細胞株(HL-7702細胞)中HBx和CEACAM1的表達水平。結(jié)果HBx和CEACAM1表達呈負相關(guān)，兩者的相關(guān)系數(shù)為-0.248；PcDNA3-X/HL-7702細胞中CEACAM1基因mRNA的相對表達量明顯低于HL-7702細胞和 PcDNA3/HL-7702細胞(P=0.000)。結(jié)論HBx能夠通過抑制CEACAM1的表達，促進肝癌細胞的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：HBx；CEACAM1；乙肝相關(guān)性肝癌組織；表達

(ChinJLabDiagn,2016,20:0384)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)在世界范圍內(nèi)傳播，據(jù)估計全球HBV感染者及攜帶者達3.5億之多，其中約有1.3億人在我國。全國每年約有30萬人死于慢性肝病，因肝癌死亡的約有18萬人，肝癌在我國惡性腫瘤發(fā)病率中排第3位。在誘發(fā)肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的眾多因素中，HBV感染占80%以上。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，慢性HBV感染者中HCC發(fā)生的高危性比非HBV感染者高約200倍。隨著對HBV和原發(fā)性肝細胞癌的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)HBV中的x基因表達產(chǎn)物HBx在肝癌形成過程中起著關(guān)鍵的作用。癌胚抗原相關(guān)細胞粘附分子l(CEACAMl)是癌胚抗原(CEA)超家族成員。在一些免疫細胞及上皮細胞中均可以檢測到CEACAM1的表達。有研究發(fā)現(xiàn),CEACAM1在不同的惡性腫瘤類型中發(fā)揮著不同的作用。相比于正常組織，CEACAM1在乳腺癌、前列腺癌中表達下降，而在肺腺癌、黑色素瘤中起促癌作用，CEACAM1在肝癌中發(fā)揮作用的機制已有較多報道，但國內(nèi)外鮮有報道CEACAM1在乙肝相關(guān)性肝癌組織中與HBx的相關(guān)作用機制。本文通過乙肝相關(guān)性肝細胞癌組織的病理標(biāo)本和轉(zhuǎn)染乙肝病毒(HBV)x基因的人肝細胞株兩部分試驗，檢測HBx和CEACAM1的表達水平，分析HBx 和CEACAM1之間表達的相關(guān)性，研究HBx和CEACAM1在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1肝癌組織收集本院2012年1月至2014年4月血清乙肝病毒表面抗原(HBVsAg)陽性的原發(fā)性肝癌患者癌組織標(biāo)本80例，均為手術(shù)病例，術(shù)前未進行化療、放療及其他輔助治療。

1.1.2細胞和質(zhì)粒肝細胞HL-7702由西安交大醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)研究室惠贈?？召|(zhì)粒PcDNA3由武漢晶賽生物工程有限公司合成，重組質(zhì)粒PcDNA3-X/HL-7702細胞及空質(zhì)粒PcDNA3/HL-7702細胞由本研究室構(gòu)建并保存。

1.1.3主要試劑及抗體免疫組化SP試劑盒( 北京中杉生物技術(shù)公司) ，小鼠抗人HBx單克隆抗體( NeoMarkers 公司) ，兔抗人CEACAM1 單克隆抗體( 美國Epitomics 公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔二抗(北京中杉金橋公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(北京中杉金橋公司)；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone 公司)、G418培養(yǎng)基、PBS溶液、RNA 提取試劑盒(華美公司)，Trizol試劑(美國 Invitrogen 公司)，XhoI、HindIII 內(nèi)切酶(TaKaRa 公司)，2*Taq PCR Master(北京天根生物有限責(zé)任公司)，TaqDNA聚合酶(美國Promega公司)，RT-PCR試劑盒(TaKaRa 公司)，引物(上海生工生物工程有限公司合成)；小鼠抗β-actin mAb 及蛋白Marker( Sigma)， PVDF膜(美國Millipore公司)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京碧云天公司)，5xTBE緩沖液(鼎國昌盛生物技術(shù)公司)，5xloading buffer(南京凱基生物有限公百)，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1免疫組化法標(biāo)本經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋并烘干后，利用SP法檢測，按試劑盒說明書步驟進行，以PBS溶液代替一抗作為陰性對照，用已知陽性標(biāo)本作為陽性對照。免疫組化反應(yīng)物陽性僅表現(xiàn)細胞核著藍色者為陰性，胞膜、胞質(zhì)或胞核呈棕黃色者為陽性。標(biāo)本經(jīng)免疫組化法檢測HBx和CEACAM1表達后陽性標(biāo)準(zhǔn)參考劉凱歌等實驗的陽性標(biāo)準(zhǔn)[1]。

1.2.2細胞的培養(yǎng)培養(yǎng)HL-7702細胞采用DMEM培養(yǎng)基,含有10%胎牛血清。培養(yǎng)cDNA3-X/HL-7702 細胞、PcDNA3/HL-7702細胞含有200 μg/ml G418的DMEM細胞培養(yǎng)液(混合有10%的胎牛血清),在37℃孵箱5% CO2條件下培養(yǎng),根據(jù)細胞生長情況,2-3天換細胞培養(yǎng)液1次。

1.2.3RT-PCR(1)RNA的提取[2]：參考孫長宇實驗中的RNA提取方法，即通過裂解細胞、抽提蛋白、沉淀RNA、洗滌和重懸等步驟提取RNA。重懸干燥后的RNA低溫保存用于RT-PCR。(2)逆轉(zhuǎn)錄PCR：按 TaKaRa 試劑盒說明書操作步驟進行。用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以lug的總RNA為模板,oligo(dT)15為引物,總反應(yīng)體積為20 μl。結(jié)束反應(yīng)后,將反轉(zhuǎn)錄得到的3種細胞cDNA樣品各1 μl進行PCR擴增。(3)RT-QPCR：取肝細胞HL-7702、重組質(zhì)粒PcDNA3-X/HL-7702細胞、空質(zhì)粒PcDNA3/HL-7702細胞3種細胞cDNA各1 μl作模板,采用PCR法檢測HBx和CEACAM1基因外顯子mRNA表達水平。

本研究參考朱健康的實驗，采用SYBR Green I的檢測模式進行熒光定量。PCR反應(yīng)條件為95℃變性10分鐘,循環(huán)參數(shù):95℃變性15 s,60℃退火30 s,2℃延伸1 min,擴增30個循環(huán),72℃延伸10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后確定每組的Ct值(cycle threshold),與本組的內(nèi)參照β-actin的Ct值比較后,可獲得各種檢測基因的相對表達量。檢測所用的引物序列見表1。

表1　檢測所用的引物序列

1.2.4Western blotting檢測法[3]：用Western blotting檢測肝細胞HL-7702、重組質(zhì)粒PcDNA3-X/HL-7702細胞、空質(zhì)粒PcDNA3/HL-7702細胞3種細胞X蛋白和CEACAM1蛋白表達水平差異，以小鼠抗人HBx單克隆抗體，兔抗人CEACAM1 單克隆抗體為一抗，取內(nèi)參為GADPH,以辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗兔二抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗為二抗。參考申利紅的實驗，通過總蛋白的提取、SDS-PAGE膠制備、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗反應(yīng)、二抗反應(yīng)和ECL曝光等步驟進行Western blotting檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用χ2檢驗評價HBx和CEACAM1表達的相關(guān)性及HBx和CEACAM1表達與患者病理學(xué)特征的相關(guān)性。計量資料采用t檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1在乙肝相關(guān)性肝癌組織中HBx和CEACAM1的表達

采用免疫組化法檢測80例乙肝相關(guān)性肝癌患者癌組織中HBx和CEACAM1蛋白的表達水平(圖1和圖2)，HBx表達陽性率為72.50%(58/80)，CEACAM1表達陽性率為67.50%(54/80)；HBx表達陽性者中CEACAM1表達陽性35例，HBx表達陰性者中CEACAM1表達陽性19例，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，HBx和CEACAM1表達呈負相關(guān)，兩者的相關(guān)系數(shù)r為-0.248(P<0.05)，見表2。

圖1乙肝相關(guān)性肝癌中CEACAM1陽性表達(SP法×400)圖2乙肝相關(guān)性肝癌中HBx陽性表達(SP法×400)

表2　CEACAM1和HBx表達的相關(guān)性

2.2HBx和CEACAM1的表達與乙肝相關(guān)性肝癌臨床病理特征關(guān)系

HBx和CEACAM1的表達均與最大腫瘤直徑、血管侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P<0.05),與性別、年齡不甚相關(guān)，此外，HBx還與腫瘤數(shù)目(單發(fā)、多發(fā))有關(guān)(P<0.05)，見表3。

2.3RT-PCR檢測3種細胞HBx和CEACAM1基因外顯子mRNA表達水平

以β-actin為內(nèi)參，獲得各基因的表達水平，結(jié)果顯示，PcDNA3-X/HL-7702細胞中HBx基因mRNA的相對表達量明顯高于HL-7702細胞和 PcDNA3/HL-7702細胞(P=0.000)，CEACAM1基因mRNA的相對表達量明顯低于HL-7702細胞和 PcDNA3/HL-7702細胞(P=0.000)，HL-7702細胞和 PcDNA3/HL-7702細胞中HBx和CEACAM1基因外顯子mRNA相對表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表3　HBx和CEACAM1的表達與乙肝相關(guān)性肝癌臨床病理特征關(guān)系

“*”P<0.05；r為相關(guān)系數(shù)。

表4　三種細胞中HBx和CEACAM1基因外顯子mRNA相對表達量平均值

2.4Western blotting檢測3種細胞x蛋白和CEACAM1蛋白的表達

PcDNA3-X/HL-7702細胞中出現(xiàn)HBx蛋白，HL-7702細胞和 PcDNA3/HL-7702細胞中無HBx蛋白形成。PcDNA3-X/HL-7702細胞中CEACAM1蛋白灰度明顯低于HL-7702細胞和 PcDNA3/HL-7702細胞，見圖3、圖4。其中1為PcDNA3-X/HL-7702細胞組，2為PcDNA3/HL-7702細胞組，3為HL-7702細胞組。

3討論

HBV的x基因是HBV基因組4個開放讀碼框中的最小一段，其表達蛋白HBx含有154個氨基酸，分子量為17 kD，HBx具有廣泛的轉(zhuǎn)錄激活功能和非特異性反式激活作用。在細胞核內(nèi)， HBx可能通過蛋白—蛋白間的相互作用與轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，直接或間接作用于基因啟動子或增強子。研究表明，除此之外，HBx還有反式抑制作用。細胞癌變的基本特征是細胞調(diào)節(jié)紊亂，造成促進細胞生長因素和誘導(dǎo)細胞死亡因素之間的失平衡。近年來，越來越多的證據(jù)表明HBx可以與肝細胞核內(nèi)外的大量蛋白分子發(fā)生相互作用，造成肝細胞調(diào)節(jié)紊亂，包括影響癌基因、抑癌基因的表達及活性，最終導(dǎo)致肝細胞癌變。

圖3　Western blotting檢測細胞中HBx蛋白表達

圖4　Western blotting檢測細胞中CEACAM1蛋白表達

癌胚抗原相關(guān)細胞黏附分子 1(CEACAMl)是一種跨膜糖蛋白,被認為是癌胚抗原(CEA)家族成員之一,屬于免疫球蛋白超家族。近年來研究表明，CEACAM1在不同的腫瘤中發(fā)揮的作用不同，在某些腫瘤中起抑制作用，而在另外一些腫瘤中起促進作用。也有研究發(fā)現(xiàn)，CEACAM1可分為胞漿CEACAM1和胞膜CEACAM1[4]，認為其中胞膜CEACAM1具有抑制癌癥的作用，而胞漿CEACAM1則具有促進腫瘤發(fā)生與發(fā)展的作用，解釋了CEACAM1在不同腫瘤中表達水平的差異在于胞膜CEACAM1和胞漿CEACAM1的相對多少。

本研究結(jié)果表明，在80例乙肝相關(guān)性肝癌組織中，HBx與CEACAM1呈負相關(guān)(r=-0.248，P<0.05)，說明HBx可能是通過抑制胞膜CEACAM1的表達水平，促進肝癌的發(fā)生。HBx和CEACAM1的表達均與最大腫瘤直徑、血管侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等肝癌病理學(xué)特征有關(guān)(P<0.05)，說明二者均與腫瘤的嚴(yán)重程度相關(guān)，其中HBx與最大腫瘤直徑、血管侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期呈正相關(guān)，CEACAM1與最大腫瘤直徑及TNM分期呈負相關(guān)，但與血管侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，表明HBx為腫瘤促進因子，而CEACAM1作用不確定，有可能為腫瘤抑制因子。本研究通過構(gòu)建表達乙肝病毒(HBV)x基因的人肝細胞株：構(gòu)建重組質(zhì)粒PcDNA3-X，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將PcDNA3-X及空質(zhì)粒PcDNA3導(dǎo)入肝細胞HL-7702中G418選擇培養(yǎng)，并用RT-PCR和Western blotting進行HBx基因和CEACAM1基因表達檢測鑒定。RT-PCR檢測結(jié)果表明，(HBV)x基因成功轉(zhuǎn)入肝細胞HL-7702中，并穩(wěn)定表達，而轉(zhuǎn)染后的肝細胞HL-7702中CEACAM1基因表達明顯下降，其mRNA的相對表達量明顯低于HL-7702細胞和 PcDNA3/HL-7702細胞(P=0.000)；Western blotting檢測結(jié)果表明，PcDNA3成功導(dǎo)入HL-7702細胞，且在x基因的存在下，CEACAM1蛋白表達明顯下降，此結(jié)果與免疫組化法得出的結(jié)果相一致，進一步證明了HBx抑制CEACAM1的表達。

通過乙肝相關(guān)性肝細胞癌組織病理標(biāo)本和轉(zhuǎn)染乙肝病毒(HBV)X基因的人肝細胞株兩部分試驗發(fā)現(xiàn)，HBx為腫瘤促進因子，CEACAM1在乙肝相關(guān)性肝癌中可能作為腫瘤抑制因子， HBx能夠抑制CEACAM1的表達，則表明HBx能通過影響抑癌因子的活性來導(dǎo)致癌細胞的發(fā)生，這與Feitelson，Sohn等的研究相一致[5-10]。

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Expression level and significance of CEACAM1 and HBx in HBV related liver cancer tissue

WANGHong-li,SHAXiao-ying,GUOYa-ling,etal.

(SixDepartmentofLiverDisease,Xi'anEighthHospital,Xi'an710061，China)

Abstract:ObjectiveTo study the expression level of HBx and CEACAM1 in HBV related cancer tissue,so as to provide new theoretical basis and prevention strategies for the pathogenesis of liver cancer.Methods80 Cancer tissue samples were collected from 80 patients with primary liver cancer,whose HBV Surface Antigen(HBVsAg)were positive in our hospital.Immunohistochemical methods were used to detect the expression of HBx and CEACAM1 in pathologic specimen of liver Cancer tissue samples.Using Western blot and RT-PCR to detect the expression of HBx and CEACAM1 in the normal human liver cell lines which had no expression of the X gene of hepatitis b virus(HBV)(HL-7702 cells),and the human liver cell lines of transfection the X gene of hepatitis b virus(HBV)(PcDNA3-X/HL-7702 cells)and empty plasmid(PcDNA3/HL-7702 cells).ResultsNegative correlation were found in the expression of HBx and CEACAM1 whose related phi coefficient is-0.248;The relative expression of CEACAM1 mRNA of PcDNA3-X/HL-7702 cells were significantly lower than the amount of the HL-7702 cells and PcDNA3/HL-7702 cells(P=0.000).ConclusionHBx can promote the occurrence of liver cancer by inhibiting the expression of CEACAM1.

Key words:HBx;CEACAM1;HBV related liver cancer tissue;Expression

(收稿日期：2015-03-19)

作者簡介：王宏利(1973-)，男， 本科學(xué)歷，副主任醫(yī)師，從事乙肝相關(guān)肝癌方面的研究。

文獻標(biāo)識碼：A

中圖分類號：R735.7

文章編號：1007-4287(2016)03-0384-05

基金項目：陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2014K11-01-01-15)