黃　凱　陳慧杰　劉方奇　徐　燁　李　軒　南　蓬

(1復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　上海　200433;2上海同達(dá)科信生物技術(shù)發(fā)展有限公司　上海　200080;

3上海生物信息技術(shù)研究中心　上?！?01203; 4復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科　上?！?00032;

5中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所　上海　200032)

?

多重PCR靶向富集結(jié)合高通量測序篩查結(jié)直腸癌中MMR基因的突變

黃凱1,2陳慧杰3劉方奇4徐燁4李軒5南蓬1△

(1復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海200433;2上海同達(dá)科信生物技術(shù)發(fā)展有限公司上海200080;

3上海生物信息技術(shù)研究中心上海201203;4復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院大腸外科上海200032;

5中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所上海200032)

【摘要】目的探討多重PCR靶向富集結(jié)合高通量測序技術(shù)在結(jié)直腸癌 (colorectal cancer,CRC)中檢測錯(cuò)配修復(fù) (mismatch repair,MMR)基因種系突變的應(yīng)用。方法收集17例CRC患者和14例正常人的血液并提取基因組DNA;設(shè)計(jì)和優(yōu)化寡聚核苷酸探針,使其能對5個(gè)基因MLHl、MSH2、PMS1、PMS2和MSH6的73個(gè)外顯子序列進(jìn)行有效的PCR擴(kuò)增和富集;應(yīng)用多重PCR技術(shù)靶向富集樣本MMR基因的外顯子序列;擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行文庫構(gòu)建和高通量測序,檢測MLHl、MSH2、PMS1、PMS2和MSH6基因的突變情況。結(jié)果31個(gè)樣本共得到2.7Gb的數(shù)據(jù),平均reads數(shù)為287 048,測序數(shù)據(jù)中平均82.18%可與參考序列進(jìn)行比對,外顯子序列平均覆蓋度為99.9%,平均測序深度為2 282。在MMR基因的外顯子區(qū)域共發(fā)現(xiàn)13種非同義單核苷酸變異 (single nucleotide variation,SNV)、2種同義 SNV,其中MSH6的c.G3205C:p.G1069R為未見報(bào)道SNV。檢測結(jié)果經(jīng)Sanger法測序驗(yàn)證,結(jié)果一致。結(jié)論多重PCR靶向富集結(jié)合高通量測序技術(shù)是一套通量高、速度快、費(fèi)用低、準(zhǔn)確性高的MMR基因突變篩查方法。

【關(guān)鍵詞】錯(cuò)配修復(fù)基因;Lynch綜合征;靶向富集;高通量測序

*This work was supported by the National Key Basic R&D Program of China (973 Plan,2012CB316501),the National Key Technologies R&D Program of China (863 Plan,2012AA02A602) and the National Natural Science Foundation of China (31271409,31401128).

結(jié)直腸癌 (colorectal cancer,CRC)是全世界第三大常見惡性腫瘤[1]。研究發(fā)現(xiàn)35%的CRC存在家族易感性[2],其中最常見的是Lynch綜合征,即遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌 (hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC),占所有病例的2%～5%[3]。錯(cuò)配修復(fù) (mismatch repair,MMR)基因發(fā)生胚系突變是Lynch綜合征的遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)至少5種MMR基因 (MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2)的胚系突變會(huì)導(dǎo)致Lynch綜合征,其中MLH1的胚系突變占50%,MSH2占40%,MSH6占7%,剩下的基因占3%[6]。在家系中,MMR基因種系突變攜帶者為發(fā)生Lynch綜合征相關(guān)腫瘤的高危人群,檢測MMR基因種系突變能很好地預(yù)測Lynch綜合征相關(guān)腫瘤的發(fā)生危險(xiǎn)[7]。

直接基因測序法是檢測MMR基因胚系突變最靈敏和最特異的方法,但Sanger法測序不僅費(fèi)時(shí)而且價(jià)格昂貴。除了直接測序外的篩檢方法還有:MMR蛋白表達(dá)免疫組化分析 (immunohistoch-meistry,IHC)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性 (microsatellite instability,MSI)檢測。IHC檢測可以確定受累基因,從而指導(dǎo)直接測序,不足之處是某些突變只導(dǎo)致MMR蛋白功能受損,而并沒有嚴(yán)重影響到MMR的表達(dá),此時(shí)IHC檢測可能為陰性[8-10]。另外,有些MSH6胚系突變只導(dǎo)致MMR受損但不會(huì)引起MSI[11]。

與傳統(tǒng)的Sanger法測序相比,第二代高通量測序技術(shù)具有通量高、速度快、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn),結(jié)合特定核酸序列靶向富集技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)對疾病最相關(guān)的基因進(jìn)行深度測序。目前已有多種疾病的相關(guān)基因運(yùn)用該技術(shù)進(jìn)行了深度測序,并取得了一定的研究成果[12-14]。本研究對17例CRC病例和14例正常人樣本進(jìn)行多重PCR靶向富集MMR基因外顯子序列,結(jié)合高通量測序技術(shù),檢測5個(gè)基因 (MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2)的胚系突變,探討多重PCR靶向富集結(jié)合高通量測序在MMR基因胚系突變檢測中的應(yīng)用,以期為Lynch綜合征的臨床診斷和研究提供新的參考。

資 料 和 方 法

研究資料CRC患者17例,年齡63～81歲,其中男8例,女9例;健康志愿者14例,年齡30～50歲,其中男6例,女8例。CRC樣本由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院提供,正常人來自健康志愿者,所有患者及志愿者均知情同意,并簽署了經(jīng)上海市人類遺傳資源委員會(huì)批準(zhǔn)的知情同意書。

靶向富集探針的設(shè)計(jì)使用在線引物設(shè)計(jì)工具探針 3設(shè)計(jì)PCR靶向富集MMR基因所需探針,對5個(gè)基因的73個(gè)外顯子總共11 419個(gè)堿基設(shè)計(jì)了87對探針,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為257～528 bp,該組合探針能覆蓋5個(gè)MMR基因 (表1)的所有外顯子區(qū)域。引物合成由上海生工生物工程有限公司合成。

MMR相關(guān)基因的靶向富集及高通量測序?qū)⒃O(shè)計(jì)和優(yōu)化的87對探針分成11組對樣本基因組DNA 進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增,每組多重PCR的DNA模板量為50 ng,其中第1～8和11組使用多重PCR 5× Master Mix試劑盒(美國NEB公司)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增,第9和10組使用GB緩沖液擴(kuò)增(日本TaKaRa公司LA Tag DNA聚合酶)試劑盒進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性20 s、63 ℃退火60 s、68 ℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán);68 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)AMpure磁珠(美國Beckman公司)純化后等量混合,取200 ng使用TflexTM快速DNA-Seq試劑盒(美國NEX公司)構(gòu)建測序文庫,然后用Miseq測序儀進(jìn)行高通量測序。

表1　靶向富集探針設(shè)計(jì)參考序列信息表

生物信息學(xué)分析及Sanger測序法驗(yàn)證測序數(shù)據(jù)分析使用Bowtie2軟件[15]與人類基因組參考序列 (hg19)進(jìn)行比對,用SAM工具軟件[16]對結(jié)果進(jìn)行突變篩查分析 (篩選條件:比對質(zhì)量>20且測序深度>100),用ANNOVAR軟件[17]對篩選的突變進(jìn)行功能注釋。分析所得結(jié)果用Sanger法測序驗(yàn)證。測序樣本的制備和Sanger測序由上海生工生物工程有限公司完成,測序所用試劑和儀器為BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing kit 和ABI 3730 測序儀。

結(jié)果

靶向富集及測序結(jié)果通過多重PCR靶向富集MMR基因和高通量測序,31個(gè)樣本共得到2.7 gigabases (Gb)數(shù)據(jù),平均每個(gè)樣本86 Mb,平均reads數(shù)為287 048。其中30個(gè)樣本的5個(gè)篩查基因 (MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2)外顯子測序覆蓋度為100%,1個(gè)為96.8%,平均覆蓋度為99.9%,外顯子區(qū)域平均測序深度為2 284。經(jīng)過生物信息分析,31個(gè)測序樣本共發(fā)現(xiàn)13種非同義單核苷酸變異 (single nucleotide variation,SNV)、2種同義SNV,在非同義SNV中,位于MLH1基因的有3個(gè):c.A655G:p.I219V、c.T1151A:p.V384D和c.C2101A:p.Q701K;位于MSH2基因的有3個(gè):c.C1168T:p.L390F、c.A1690G:p.T564A和c.G2425A:p.E809K;位于MSH6基因的有3個(gè):c.G116A:p.G39E、c.G3205C:p.G1069R和c.A3488T:p.E1163V;位于PMS2基因的有4個(gè):c.G59A:p.R20Q、c.A1621G:p.K541E、c.C1408T:p.P470S和c.C1454A:p.T485K。2個(gè)同義SNV是MSH6基因c.T3306A和PMS2基因c.C780G;基因PMS1未檢測到SNV。這些SNV與數(shù)據(jù)庫dbSNP和InSight[18](http://www.insight-group.org/mutatioons)進(jìn)行檢索,發(fā)現(xiàn)14種已經(jīng)報(bào)導(dǎo),其中MSH6的c.G3205C:p.G1069R未見報(bào)導(dǎo) (表2)。

表2　MMR基因突變篩查結(jié)果

Sanger測序驗(yàn)證為了驗(yàn)證多重PCR靶向富集高通量測序的檢測結(jié)果,我們對每種單核苷酸變異類型選取了一個(gè)樣本進(jìn)行了單管的PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行Sanger測序。單管PCR擴(kuò)增及Sanger測序引物與多重PCR靶向富集高通量測序所用的引物相同。結(jié)果顯示:Sanger測序驗(yàn)證結(jié)果與多重PCR靶向富集高通量測序結(jié)果一致 (圖1)。

討論

目前,新一代測序以其低成本、高通量的優(yōu)勢成為生命科學(xué)研究和臨床疾病基因檢測的重要工具,結(jié)合特定核算序列靶向富集技術(shù),可以更加高效經(jīng)濟(jì)的對疾病最相關(guān)的基因進(jìn)行深度測序和研究。Keller等[19]應(yīng)用靶向富集高通量測序研究多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤 (glioblastoma multiforme,GBM)SNP,結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)研究 (the genome-wide association study,GWAS)和已知的疾病相關(guān)聯(lián)SNP,發(fā)現(xiàn)一些SNP與吸煙、體質(zhì)指數(shù)、乳腺癌和高分級膠質(zhì)瘤相關(guān)聯(lián)。Ying等[20]運(yùn)用目標(biāo)區(qū)域捕獲高通量測序技術(shù)對6個(gè)苯丙酮尿癥相關(guān)基因 (PAH、PTS、GCH1、QDPR、PCBD1和GFRP)的所有外顯子進(jìn)行了突變檢測,共發(fā)現(xiàn)了PAH基因中23個(gè)已知變異,以及6個(gè)PAH和PTS的新型突變。

CRC是我國最常見的惡性腫瘤之一,并有逐年上升的趨勢,部分CRC具有家族遺傳易感性。由于我國的計(jì)劃生育政策和城市化人口遷徙,家系正變得越來越小,家系成員也越來越趨于分散,這對遺傳性CRC的研究和診斷帶來一定的挑戰(zhàn)。因此,對普通CRC患者或健康人員進(jìn)行遺傳學(xué)檢查,以確認(rèn)或排除腫瘤遺傳易感性是具有一定應(yīng)用價(jià)值的。MMR基因的胚系突變被認(rèn)為是最常見的遺傳性CRC-Lynch綜合征發(fā)生的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ),檢測MMR基因種系突變能很好地預(yù)測Lynch綜合征相關(guān)腫瘤的發(fā)生危險(xiǎn)。目前檢測MMR基因突變的方法依然是單個(gè)基因逐一檢測且以一代測序?yàn)橹鱗21-23],但此方法費(fèi)時(shí)、通量低且價(jià)格昂貴,不適合臨床大樣本量的檢測,而高通量測序應(yīng)用于MMR基因檢測的報(bào)道極少。因此,我們設(shè)計(jì)了一套探針,通過多重PCR靶向富集MMR基因,結(jié)合高通量測序檢測MMR基因的胚系突變。

為了能夠有效的多重PCR靶向富集5個(gè)MMR基因MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2的外顯子序列,我們設(shè)計(jì)了87對探針,覆蓋了5個(gè)基因73個(gè)外顯子共11 419個(gè)堿基序列,PCR產(chǎn)物的長度為257～528 bp。設(shè)計(jì)的探針不僅包含了外顯子區(qū)域,也包含了外顯子與內(nèi)含子的結(jié)合位置,同時(shí),這些探針具有相近的TM值,這樣多重PCR時(shí)可以使用相同的退火條件。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,我們將87對探針分成11組進(jìn)行多重PCR,每組包含2～11對探針,其中第9、10組擴(kuò)增區(qū)域GC含量較高,使用TaKaRa LA Tag with GC Buffer試劑盒能有效擴(kuò)增,其余的多重PCR使用NEB MixMultiplex PCR 5× Master Mix試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。多重PCR反應(yīng)條件經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后可使每對探針都能夠有效擴(kuò)增,其擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性20 s、63 ℃退火60 s、68 ℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán);68 ℃延伸5 min。多重PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后可進(jìn)行測序文庫制備,在測序文庫構(gòu)建時(shí)加入標(biāo)簽序列,可以實(shí)現(xiàn)多樣本的檢測。本研究使用了31種標(biāo)簽序列,對17例CRC病例和14CRC正常人的樣本進(jìn)行了標(biāo)記。通過引入標(biāo)簽序列,使得多樣本基因檢測更加高效快捷。以高通量測序平臺Miseq和一代Sanger測序平臺ABI 3730為例,我們將自己設(shè)計(jì)的多重PCR靶向富集結(jié)合高通量測序的方法和傳統(tǒng)的單管PCR-Sanger測序法檢測5個(gè)MMR基因外顯子所用時(shí)間和費(fèi)用進(jìn)行了比較。單管PCR-Sanger測序需對每個(gè)基因的外顯子進(jìn)行單管PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行Sanger法測序,每檢測一個(gè)樣本的MMR基因胚系突變需要分別進(jìn)行87個(gè)單管PCR及87個(gè)Sanger測序反應(yīng);多重PCR技術(shù)可同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)MMR基因外顯子序列,擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行文庫構(gòu)建并測序,每檢測1個(gè)樣本只需11管多重PCR和1次文庫構(gòu)建。如表3所示:由于受合成引物費(fèi)用的影響,當(dāng)檢測少量樣本時(shí),例如檢測1個(gè)樣本,所產(chǎn)生的費(fèi)用主要是引物合成費(fèi)用;同時(shí),二代測序儀運(yùn)行通量高,每次運(yùn)行可同時(shí)檢測上百個(gè)樣本,當(dāng)檢測單個(gè)樣本時(shí)需要和其他樣本混合測序,時(shí)間上比一代測序花費(fèi)更多;但當(dāng)樣本數(shù)量達(dá)到100個(gè)或更多時(shí),檢測時(shí)間和費(fèi)用主要受限于PCR擴(kuò)增和測序技術(shù),靶向富集結(jié)合高通量測序檢測MMR基因突變的時(shí)間和費(fèi)用要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于單管PCR-Sanger法測序。因此,多重PCR靶向富集結(jié)合高通量測序技術(shù)是一套通量高、速度快、費(fèi)用低的MMR基因突變篩查方法,適合臨床大樣本量的MMR基因突變篩查。

表3　MMR基因外顯子測序費(fèi)用比較

利用多重PCR靶向富集高通量測序,我們在17例DRC病例和14例正常人的樣本中共發(fā)現(xiàn)外顯子區(qū)域13種非同義單核苷酸變異、2種同義單核苷酸變異。與dbSNP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,發(fā)現(xiàn)MSH6的c.G3205C:p.G1069R為未報(bào)導(dǎo)的單核苷酸變異,其余14種為已報(bào)導(dǎo)單核苷酸變異。將這些已知單核苷酸變異位點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫ClinVar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)檢索發(fā)現(xiàn):位于MLH1基因第18外顯子c.C2101A:p.Q701K為致病或可能致病的突變;位于MSH2基因第14外顯子c.G2425A:p.E809K為致病性不確定的突變;其余10種非同義單核苷酸變異為可容忍的變異,可能與CRC的發(fā)生沒有關(guān)聯(lián)。致病或可能致病的突變c.C2101A:p.Q701K由范怡梅等[22]于2005年首次發(fā)現(xiàn),并在隨后的功能分析表明此變異造成MLp和PMS2互動(dòng)效率降低,可能提高突變攜帶者患胃腸腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)[24]。在另一項(xiàng)研究中,c.C2101A:p.Q701K在2例腫瘤樣本中檢測出,而在100例非腫瘤對照樣本中并沒有發(fā)現(xiàn)該突變,同時(shí)對這兩例攜帶該突變的腫瘤樣本進(jìn)行MSI檢測,5個(gè)常規(guī)位點(diǎn)檢測出4個(gè)陽性結(jié)果[25]。本研究在一例健康人 (年齡<50歲)中檢測出該突變,提示該志愿者有可能存在腫瘤遺傳易感性,應(yīng)詢問是否有患病家族史,并做進(jìn)一步的檢測 (IHC或者M(jìn)SI)和隨訪;致病性不確定的突變c.G2425A:p.E809K在1例CRC患者中檢測出,同時(shí)檢索1 000 Genomes Projects (2012 release)數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)該等位基因的頻率只有0.000 5,經(jīng)Mutation Taster預(yù)測該單核苷酸變異為有害變異[26],可能會(huì)影響MMR的功能,提示該變異可能與CRC的發(fā)生有關(guān)。在本研究中新發(fā)現(xiàn)一種單核苷酸變異,即位于MSH6的第5外顯子c.G3205C:p.G1069R,此變異在1例CRC患者中檢測出,經(jīng)Mutation Taster預(yù)測該單核苷酸變異為有害變異,推測可能與CRC的發(fā)生有關(guān)。然而,進(jìn)一步的功能分析研究是必要的,以確認(rèn)MSH2基因c.G2425A:p.E809K和MSH6基因c.G3205C:p.G1069R的臨床意義。每種類型的非同義SNV我們都挑選了一個(gè)樣本進(jìn)行Sanger測序,結(jié)果與高通量測序一致,表明靶向富集高通量測序技術(shù)對于發(fā)現(xiàn)MMR基因的胚系突變具有高度的準(zhǔn)確性。

多重PCR靶向富集結(jié)合高通量測序技術(shù)用于MMR基因的外顯子突變檢測準(zhǔn)確且經(jīng)濟(jì)、高效,其與臨床表型對照研究,可為Lynch綜合征遺傳風(fēng)險(xiǎn)的評估和治療方案的制定提供新的參考。

參考文獻(xiàn)

[1]PETO J.Cancer epidemiology in the last century and the next decade[J].Nature,2001,411 (6835):390-395.

[2]LICHTENSTEIN P,HOLM NV,VERKASALO PK,etal.Environmental and heritable factors in the causation of cancer-analyses of cohorts of twins from Sweden,Denmark,and Finland[J].NEnglJMed,2000,343 (2):78-85.

[3]SAMOWITZ WS,CURTIN K,LIN HH,etal.The colon cancer burden of genetically defined hereditary nonpolyposis colon cancer[J].Gastroenterology,2001,121 (4):830-838.

[4]JASS JR.Role of the pathologist in the diagnosis of hereditary non-polyposis colorectal cancer[J].DisMarkers,2004,20 (4-5):215-224.

[5]BOLAND CR.Decoding hereditary colorectal cancer[J].NEnglJMed,2006,354 (26):2815-2817.

[7]李曉鷗,盛劍秋,付蕾,等.錯(cuò)配修復(fù)基因突變檢測對遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌患病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測[J].中華消化雜志,2009,29 (11):721-725.

[8]ROBINSON KL,LIU T,VANDROVCOVA J,etal.Lynch syndrome (hereditary nonpolyposis colorectal cancer)diagnostics[J].JNatlCancerI,2007,99 (4):291-299.

[9]LYNCH HT,LYNCH JF,LYNCH PM.Toward a consensus in molecular diagnosis of hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome)[J].JNatlCancerI,2007,99 (4):261-263.

[10]RAECAARA TE,KORHONEN MK,LOHI H,etal.Functional significance and clinical phenotype of nontruncating mismatch repair variants of MLp[J].Gastroenterology,2005,129 (2):537-549.

[11]SALOVAARA R,LOUKOLA A,KRISTO P,etal.Population-based molecular detection of hereditary nonpolyposis colorectal cancer[J].JClinOncol,2000,18 (11):2193-2200.

[12]GERRARD G,VALGANON M,FOONG HE,etal.Target enrichment and high-throughput sequencing of 80 ribosomal protein genes to identify mutations associated with Diamond-Blackfan anaemia[J].BrJHaematol,2013,162 (4):530-536.

[13]SCOTT CA,PLAGNOL V,NITOIU D,etal.Targeted sequence capture and high-throughput sequencing in the molecular diagnosis of ichthyosis and other skin diseases[J].JInvestDermatol,2013,133 (2):573-576.

[14]LIN HH,SINNER MF,BRODY JA,etal.Targeted sequencing in candidate genes for atrial fibrillation:the cohorts for heart and aging research in genomic epidemiology (CHARGE) targeted sequencing study[J].HeartRhythm,2014,11 (3):452-457.

[15]LANGMEAD B,SALZBERG S.Fast gapped-read alignment with Bowtie 2[J].NatMethods,2012,9 (4):357-359.

[16]LI H,HANDSAKER B,WYSOKER A,etal.The Sequence Alignment/Map format and SAM tools[J].Bioinformatics,2009,25 (16):2078-2079.

[17]WANG K,LI MY,HAKONARSON H.ANNOVAR:Functional annotation of genetic variants from next-generation sequencing data[J].NucleicAcidsRes,2010,38 (16):e164.

[18]KOHONEN-CORISH MR,MACRAE F,GENUARDI M,etal.Deciphering the colon cancer genes-report of the InSiGHT-Human Variome Project Workshop,UNESCO,Paris 2010[J].HumanMutat,2011,32 (4):491-494.

[19]KELLER A,HARZ C,MATZAS M,etal.Identification of novel SNPs in glioblastoma using targeted resequencing[J].PLoSOne,2011,6 (6):e18158.

[20]GU Y,LU KM,YANG GH,etal.Mutation spectrum of six genes in Chinese phenylketonuria patients obtained through next-generation sequencing[J].PLoSOne,2014,9 (4):e94100.

[21]WEI WQ,LIU FQ,LIU L,etal.Distinct mutations in MLp and MSh1 genes in hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) families from china[J].BMBRep,2011,44 (5):317-322.

[22]FAN YM,LIU XR,ZHANG H,etal.Variations in exon7 of the MSh1 gene and susceptibility to gastrointestinal cancer in a Chinese population[J].CancerGenetCytogenet,2006,170 (2):121-128.

[23]KIM YM,CHOE CG,CHO SK,etal.Three novel germline mutations in MLp and MSh1 in families with Lynch syndrome living on Jeju island,Korea[J].BMBRep,2010,43 (10):693-697.

[24]FAN YM,WANG W,ZHU M,etal.Analysis of hMLp missense mutations in East Asian patients with suspected hereditary nonpolyposis colorectal cancer.[J].ClinCancerRes,2007,13 (24):7515-7521.

[25]YAP HL,CHIENG WS,LIM RC,etal.Recurring MLp deleterious mutations in unrelated Chinese Lynch syndrome families in Singapore[J].FamCancer,2009,8 (2):85-94.

[26]SCHWARZ JM,RODELSPERGER C,SCHUELKE M,etal.Mutation Taster evaluates disease-causing potential of sequence alterations[J].NatMethods,2010,7 (8):575-576.

Distinct mutations ofMMRgene in colorectal cancer by targeted enrichment and high-throughput next generation sequencing

HUANG Kai1,2,CHEN Hui-jie3,LIU Fang-qi4,XU Ye4,LI Xuan5,NAN Peng1△

(1MinistryofEducationKeyLaboratoryforBiodiversityScienceandEcologicalEngineering,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200433,China;2Tongji-SCBITBiotechnologyCo.,Ltd.,Shanghai200080,China;3ShanghaiCenterforBioinformationTechnology,Shanghai201203,China;4DepartmentofColorectalSurgery,ShanghaiCancerCenter,FudanUniversity,Shanghai200032,China;5InstituteofPlantPhysiologyandEcology,ShanghaiInstitutesforBiologicalSciences,ChineseAcademyofSciences,Shanghai200032,China)

【Abstract】ObjectiveTo detect the germline mutations of mismatch repair (MMR) genes in colorectal cancer (CRC) using targeted enrichment and high-throughput next generation sequencing,and to explore its applications in research and clinical diagnosis of Lynch syndrome.MethodsGenomic DNA was extracted from 17 patients diagnosed with colorectal cancer and 14 healthy adults, Primers,which could amplify all the 73 exons and flanking regions of 5 MMR genes (MLH1,

MSH2,MSH6,PMS1,PMS2) by multiplex PCR were designed and optimized,PCR products were then sequenced by Illumina Miseq sequencer.ResultsWe obtained approximately 2.7 giga-base sequence data,and the average reads number of individual samples was 287048.On average,82.18% of the reads could be mapped to the reference human genome (HG19).Average coverage and sequencing depth of targeted regions were 99.9% and 2282-fold respectively.After bioinformatic analysis,we found 14 previously annotated single-nucleotide variants (SNVs) in 5 mismatch repair (MMR) genes and 1 novel mutations inMSH6 genes (c.G3205C:p.G1069R).These results were confirmed by sanger sequencing.ConclusionsTargeted enrichment combined with high-throughput next generation sequencing can be used to detect mutations in MMR genes with high sensitivity and lower cost than conventional methods.

【Key words】mismatch repair gene;lynch syndrome;targeted enrichment;high-throughput sequencing

(收稿日期:2015-07-24;編輯:段佳)

【中圖分類號】R735.3，Q781

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.02.014

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目 (2012CB316501);國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目 (2012AA02A602)；國家自然科學(xué)基金 (31271409，31401128)

△Corresponding authorE-mail:nanpeng@fudon.edu.cn