孫淑娜　姚澤忠　蔣　璆　桂永浩

(1復旦大學附屬兒科醫(yī)院心內科　上?！?01102; 2上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院兒科　上?！?01199;

3上海市心血管病研究所　上?！?00032)

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葉酸挽救乙醇致斑馬魚胚胎心臟和流出道發(fā)育異常

孫淑娜1,2姚澤忠2蔣璆3桂永浩1△

(1復旦大學附屬兒科醫(yī)院心內科上海201102;2上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院兒科上海201199;

3上海市心血管病研究所上海200032)

【摘要】目的觀察乙醇對斑馬魚胚胎心臟和流出道發(fā)育的干擾作用,并初步探討葉酸挽救乙醇所致心臟和流出道發(fā)育異常的最佳時段和可能機制。方法在斑馬魚胚胎發(fā)育不同時段予以乙醇處理,觀察胚胎的發(fā)育異常情況。將受精后7～12 h被予以乙醇組定義為乙醇處理組。在乙醇處理組胚胎的發(fā)育不同時段給予外源性葉酸進行葉酸挽救實驗,觀察各葉酸干預組胚胎的發(fā)育狀況,探尋葉酸挽救的最佳時段。將受精后7～12 h給予葉酸組定義為葉酸挽救組。觀察并統(tǒng)計乙醇處理組以及葉酸挽救組的胚胎發(fā)育異常百分比、存活百分比、心臟和流出道形態(tài)及其異常百分比、心率、心室收縮指數(shù)等指標來評估胚胎的發(fā)育狀況。利用熒光顯微造影的方法探查心臟流出道形態(tài),采用胚胎整體原位雜交和Real-time PCR 方法檢測胚胎bmp2b、tbx1的表達情況。結果乙醇可干擾胚胎發(fā)育,乙醇處理組胚胎存在明顯心臟和流出道形態(tài)異常以及心功能損害,在胚胎發(fā)育早期乙醇的干擾作用最明顯。給予外源性葉酸能挽救乙醇導致的胚胎發(fā)育異常,在胚胎受精后7～12 h葉酸挽救作用最顯著。乙醇處理組胚胎心臟和流出道的bmp2b、tbx1表達下降;予以葉酸干預后,乙醇處理組胚胎bmp2b和tbx1表達水平上調。結論葉酸能有效挽救乙醇導致的心臟和流出道發(fā)育異常,其機制可能是上調乙醇處理組胚胎bmp2b、tbx1的表達水平。

【關鍵詞】葉酸;乙醇;心臟;流出道;斑馬魚;bmp2b;tbx1

*This work was supported by Youth Research Fund of Shanghai Municipal Health Bureau (20124y086) and Opening Project of Key Laboratory of Birth Defects Prevention in Shanghai.

先天性心臟病是胚胎時期心血管系統(tǒng)發(fā)育異常所導致的先天性疾病,嚴重危害兒童生命和健康,其發(fā)病率在活產嬰兒中約為6‰～8‰。先天性心臟病環(huán)境致病因素中的乙醇攝入不容忽視。婦女妊娠期間攝入乙醇過量對胚胎發(fā)育有嚴重影響,可導致胎兒酒精綜合征,表現(xiàn)為心血管系統(tǒng)發(fā)育障礙、胚胎頭面部畸形和神經系統(tǒng)損傷。心血管系統(tǒng)發(fā)育異常在胎兒酒精綜合征患兒中發(fā)生率較高[1]。目前乙醇導致胚胎發(fā)育異常的確切機制尚未完全闡明,探尋有效的方法挽救妊娠期孕母乙醇攝入所致胚胎發(fā)育異常逐漸成為研究熱點。

葉酸在生物生長和發(fā)育過程中扮演重要的角色,它參與生物體內許多重要反應和重要物質的合成。有研究表明,通過抑制二氫葉酸還原酶功能而使葉酸生物學活性受抑后可導致心臟發(fā)育障礙,且心臟發(fā)育關鍵轉錄因子bmp2b以及tbx1的表達水平下調[2-3]。人群中母親懷孕期間予以補充適量的葉酸可降低子代發(fā)生先天性心臟病的風險[4]。在小鼠中葉酸可降低胚胎酒精綜合征的發(fā)生[5],在斑馬魚中葉酸可挽救乙醇導致的視網膜等發(fā)育異常[6]。但目前圍繞葉酸挽救乙醇所致胚胎心血管系統(tǒng)發(fā)育異常的最佳時段及其相關機制研究較少。本研究旨在觀察乙醇對胚胎發(fā)育的干擾作用,并探尋葉酸挽救乙醇所致胚胎心血管系統(tǒng)發(fā)育異常的最佳時期,并通過檢測心血管發(fā)育密切轉錄因子bmp2b以及tbx1的表達水平進行初步機制探討,為臨床合理預防乙醇所致先天性心臟病提供理論與實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

實驗動物斑馬魚受精卵按照Kimmel等[7]描述對發(fā)育階段分期,受精卵置于孵化液(60μg/mL海鹽)28 ℃孵化,出絨毛膜后在胚胎培養(yǎng)液內養(yǎng)育,每天更換胚胎培養(yǎng)液。用于原位雜交的胚胎在24 hpf(hours post fertilization,受精后小時數(shù))開始用0.003%苯硫脲處理以防止黑色素的形成。

乙醇處理將乙醇溶解于胚胎培養(yǎng)液內,根據(jù)預實驗結果,選用250 mmol/L的乙醇進行實驗。在胚胎如下不同發(fā)育階段予以乙醇：0～6 hpf、7～12 hpf、13～18 hpf、19～24 hpf、25～30 hpf、31～36 hpf、37～42 hpf、43～48 hpf。每組100枚胚胎,實驗重復3次,設正常對照組胚胎100枚。

給予外源性葉酸將葉酸(購自Sigma公司,美國)溶解于胚胎培養(yǎng)液內配成5 mmol/L葉酸溶液。將7～12 hpf乙醇處理組胚胎分別在如下發(fā)育的不同階段給予外源性葉酸： 0～6 hpf、7～12 hpf、13～18 hpf、19～24 hpf、25～30 hpf、31～36 hpf、37～42 hpf、43～48 hpf。每組100枚胚胎,實驗重復3次,設正常對照組胚胎100枚。

胚胎整體發(fā)育情況的觀察在顯微鏡下觀察各組胚胎整體發(fā)育情況,記錄各組胚胎存活個體百分比以及發(fā)育異常百分比。死亡個體也列入發(fā)育異常個體計數(shù)中。

心臟及流出道發(fā)育情況的觀察在胚胎發(fā)育至48 hpf時,在顯微鏡下觀察對照組、乙醇處理組、葉酸挽救組胚胎的心臟發(fā)育形態(tài),并記錄各組心臟發(fā)育異常個體百分比,每組20枚胚胎,實驗重復3次。在48 hpf和60 hpf時統(tǒng)計各組胚胎的心率以及心室收縮指數(shù)(VSF),每組20枚胚胎。

另在上述各組胚胎發(fā)育至60 hpf時向胚胎心臟內注射3 nL熒光素,在熒光顯微鏡下觀察胚胎心臟流出道的發(fā)育情況并記錄各組心臟流出道發(fā)育異常個體百分比。每組20枚胚胎,實驗重復3次。

基因探針制備及胚胎整體原位雜交抽提各組斑馬魚胚胎總mRNA后,經RT-PCR逆轉錄獲得cDNA。采用Primer3軟件設計引物,以逆轉錄獲得的cDNA為模板進行PCR擴增特異性基因序列作為原位雜交的探針片段。將PCR產物切膠回收,克隆入PGEM-T載體中,經測序驗證后,獲得含有目的基因cDNA片段的質粒,利用內切酶將其線性化后,體外轉錄反義RNA探針(地高辛標記)。進行原位雜交實驗時每組各20枚胚胎,每組重復3次實驗。構建基因探針及原位雜交所用試劑主要購自Promega 公司、美國羅氏公司、Takara公司。

Real-time PCR抽提斑馬魚48 hpf的總mRNA,經RT-PCR逆轉錄獲得cDNA。采用Primer3軟件設計引物,由Sangon生物公司合成。bmp2b引物：F:5′-CTTCCTCCTCCGAGGCTT-3′,R:5′-ACTGGCATCTCCGAGAACTT-3′。tbx1引物：F:5′-GAGACTGTGATCCCGAGGAC-3′,R:5′-TCATGATTTGTAGCGAGCCT-3′。以逆轉錄的cDNA為模板進行擴增,以β-actin 作為內參對照,每個樣品重復3個孔。實驗結果采用ABI7000熒光定量PCR儀提供的分析軟件進行分析。Real-time PCR 所用SYBR Green熒光染料購自美國羅氏公司。

結果

乙醇導致斑馬魚胚胎發(fā)育異常對各不同時段乙醇處理組的胚胎整體發(fā)育情況進行觀察和統(tǒng)計的結果顯示,乙醇可導致胚胎發(fā)育異常,隨著處理時段的向后推移,胚胎發(fā)育異常百分比逐漸降低(圖1),存活百分比逐漸升高(圖2)。在18hpf之前予以乙醇處理的胚胎發(fā)育異常比例大于50%,其中0～6hpf處理組和7～12hpf處理組發(fā)育異常百分比(死亡個體也計入發(fā)育異常)分別達92.67%±3.06%和85.33%±3.06%。但0～6hpf處理組的存活百分比(43.33%±3.11%)較7～12hpf處理組(80.67%±0.89%)降低。故在后續(xù)實驗中,我們將7～12hpf作為斑馬魚胚胎的乙醇處理時間窗,定義為乙醇處理組。乙醇處理組胚胎存在軀干長度縮短、頭部偏小、尾部彎曲、心臟畸形等發(fā)育異常(圖3)。

A:Control group；B:Ethanol group,C:Ethanol+ folic acid group.Left lateral views,heads toward left.Bar:200μm.

圖3胚胎整體發(fā)育情況的觀察(48 hpf)

Fig 3The phenotypical overview of zebrafish

embryos at 48 hpf

乙醇處理組胚胎心臟和心臟流出道發(fā)育異常乙醇處理組胚胎與正常發(fā)育的對照組胚胎相比,在48 hpf時心臟發(fā)育異常百分比達81.67%±7.64%,表現(xiàn)為心前區(qū)水腫,心房和心室的位置形態(tài)異常,心房和心室不同程度擴張(圖4),心臟跳動減慢且收縮無力。對心率和VSF的統(tǒng)計結果顯示,與正常對照組相比,乙醇處理組胚胎在48 hpf和60 hpf心率和VSF皆下降(圖5)。60 hpf熒光顯微造影結果顯示正常對照組的心臟流出道已發(fā)育完善,顯影清晰;乙醇處理組胚胎(76.67%±7.64%)存在明顯心臟流出道發(fā)育不全(圖6)。

A and a:Control group;B and b:Ethanol group；C and c:Ethanol +folic acid group.a,b and c are conceptual diagrams of hearts.Arrow V:Ventricle;Arrow A:Atrium.Left lateral views,heads toward left.Bar:100μm.

圖4心臟的形態(tài)觀察(48 hpf)

Fig 4The phenotypical analysis of zebrafish heart at 48 hpf

乙醇處理組胚胎bmp2b、tbx1表達減弱Real-time PCR 結果顯示,與正常對照組相比,乙醇處理組中bmp2b和tbx1的整體表達水平明顯下降(圖7)。

圖5各組胚胎心率(A)和心室收縮指數(shù)(B)的比較

Fig5Thefunctionalanalysisofzebrafishheartby

heartrate(A)andVSF(B)

A:Control group;B:Ethanol group;C:Ethanol+folic acid group.Arrows indicate OFTs.Left lateral views,heads toward left.Bar:100μm.

圖6心臟流出道的形態(tài)觀察(60 hpf)

Fig 6The phenotypical analysis of zebrafish outflow

tract (OFT) at 60 hpf

原位雜交實驗結果顯示,與正常對照組相比,乙醇處理組胚胎bmp2b在心臟中的表達明顯減弱,tbx1在心臟流出道中的表達強度降低(圖8)。

圖7Real-timePCR檢測bmp2b和tbx1在胚胎的整體表達情況

Fig7bmp2bandtbx1expressionsanalysis

byreal-timePCR

A,B and C:The expression ofbmp2bat 48 hpf,arrows indicated the expression ofbmp2bin hearts.D,E and F:The expression oftbx1 at 60 hpf,arrows indicated the expression oftbx1 in OFTs.Compared with control group,expressions ofbmp2bandtbx1 decreased in ethanol group.Compared with ethanol group,expressions ofbmp2bandtbx1 increased in ethanol +folic acid group.A and D:control group,B and E:ethanol group,C and F:ethanol +folic acid group.A,B and C:Dorsal views,heads to the top.D,E and F:Left-lateral views,heads to the left.Bar:200μm.

圖8胚胎整體原位雜交法檢測bmp2b和tbx1在心臟及流出道的表達情況

Fig 8bmp2bandtbx1 expressions analysis byinsituhybridization in heart and OFT

葉酸可挽救乙醇處理組胚胎發(fā)育異常將乙醇處理組胚胎在不同發(fā)育時段給予外源性葉酸后,發(fā)現(xiàn)18 hpf之前給予葉酸,可顯著提高乙醇處理組胚胎的存活百分比(圖9),12 hpf前給予葉酸,可顯著降低乙醇處理組胚胎的發(fā)育異常百分比(圖10)。其中在7～12 hpf給予外源性葉酸后,乙醇處理組的發(fā)育異常百分比降低最顯著,存活百分比升高最明顯,因此將在7～12 hpf給予乙醇處理組外源性葉酸定義為乙醇+葉酸處理組,即葉酸挽救組進行后續(xù)實驗。

圖9乙醇處理組和各乙醇+葉酸處理組的存活百分比比較

Fig9Comparationofsurvivalpercentagesinethanol

groupandethanol+folicacidgroups

圖10乙醇處理組和各乙醇+葉酸處理組的發(fā)育異常

百分比比較

Fig10Comparationofabnormalpercentagesinethanol

groupandethanol+folicacidgroups

與乙醇處理組相比,葉酸挽救組胚胎心臟發(fā)育異常個體百分比降低(41.67%±2.89%);心臟形態(tài)發(fā)育狀況明顯改善,表現(xiàn)為胚胎心房和心室的形態(tài)及位置趨于正常(圖4),而且心率和VSF在各時間點明顯增加(圖5)。熒光顯微造影結果顯示葉酸挽救組與乙醇組相比,心臟流出道發(fā)育異常個體百分比明顯下降(31.67%±5.77%),且心臟流出道發(fā)育情況明顯改善(圖6)。

葉酸挽救組胚胎bmp2b及tbx1表達增強Real-time PCR 結果顯示,與乙醇處理組相比,葉酸挽救組的bmp2b及tbx1整體表達水平明顯下降(圖7)。原位雜交結果顯示與乙醇處理組相比,bmp2b及tbx1在葉酸挽救組心臟以及流出道中的表達明顯增加(圖8)。

討論

先天性心臟病的致病因素錯綜復雜,包括環(huán)境因素以及遺傳因素。孕母乙醇攝入是先天性心臟病較為常見的環(huán)境致病因素,利用模式生物對其發(fā)病機制進行研究并探尋有效的防治方法有十分重要的現(xiàn)實意義。

本研究利用模式生物斑馬魚開展。斑馬魚與人類基因同源性較高;且其繁殖量大、發(fā)育周期短,適用于本實驗中的大規(guī)模表型篩選和觀察;另外斑馬魚在受精后72 hpf內(即從受精卵發(fā)育至幼魚)不需要給予飼料喂養(yǎng),其胚胎生長的主要營養(yǎng)物質(包括葉酸等)來自于受精卵內的卵黃,各受精卵的葉酸供給是均等的,提高了本研究中葉酸挽救實驗的準確性。

目前國內外一些學者利用模式生物斑馬魚,圍繞乙醇導致胚胎發(fā)育異常的機制進行研究。發(fā)現(xiàn)乙醇可影響底索分泌Rada和Ang-1等血管形成因子,干擾斑馬魚背主動脈的形成[8],提示乙醇可干擾斑馬魚胚胎血管發(fā)育。但在整個胚胎心臟發(fā)育時期中,乙醇導致心臟發(fā)育異常的最敏感時段有待于探討,乙醇導致心血管系統(tǒng)發(fā)育異常的機制亦尚未明確。斑馬魚胚胎心臟在48 hpf即已發(fā)育完善,本研究首先通過預實驗用不同濃度的乙醇處理斑馬魚胚胎,經過反復實驗觀察,發(fā)現(xiàn)250 mmol/L乙醇可導致胚胎發(fā)生明顯發(fā)育異常,且存活率相對較高;因此選擇250 mmol/L乙醇進行后續(xù)實驗。我們將0 hpf到48 hpf劃分為不同時段進行乙醇處理,發(fā)現(xiàn)乙醇在胚胎發(fā)育早期12 hpf之前對胚胎發(fā)育的干擾作用最顯著,其中7～12 hpf處理組胚胎的發(fā)育異常百分比和存活百分比皆較高,因此將7～12 hpf處理組定義為乙醇處理組。后續(xù)實驗發(fā)現(xiàn),乙醇處理組胚胎存在明顯心臟和流出道形態(tài)學發(fā)育異常。且通過對心率、心室收縮指數(shù)進行心功能評估，結果發(fā)現(xiàn)乙醇處理組胚胎存在心率下降、心室收縮功能受損。我們推測乙醇有可能通過影響心臟發(fā)育密切相關因子的表達而導致胚胎心臟和流出道發(fā)育異常。

在心臟發(fā)育密切相關轉錄因子中,bmp2b在調控心臟收縮功能方面有重要作用[9],tbx1對于心臟流出道發(fā)育十分關鍵[10-11]。且我們前期研究發(fā)現(xiàn),葉酸生物學活性降低可導致bmp2b和tbx1的表達水平降低[2-3]。因此我們檢測了bmp2b以及tbx1的表達情況。首先利用Real-time PCR檢測bmp2b以及tbx1在胚胎內的整體表達水平,結果發(fā)現(xiàn)bmp2b以及tbx1的表達水平降低。我們進而通過胚胎整體原位雜交的方法檢測此兩個基因在心臟和流出道特定部位的表達情況,發(fā)現(xiàn)bmp2b以及tbx1在乙醇處理組胚胎心臟和流出道的表達水平也降低,提示乙醇可能通過下調bmp2b以及tbx1的表達而導致胚胎心臟發(fā)育異常。

在先天性心臟病的防治策略中,對一些導致先心病發(fā)生的環(huán)境高危因素進行控制并采取改善措施至關重要。發(fā)現(xiàn)孕母攝入乙醇后,及時有效地采取措施防止乙醇影響胎兒的心血管系統(tǒng)發(fā)育有十分重要的意義。葉酸是一種十分重要的維生素,我們前期研究發(fā)現(xiàn)葉酸生物學活性降低可導致斑馬魚胚胎發(fā)生明顯心臟和流出道異常,且心臟發(fā)育關鍵轉錄因子的表達水平降低[2-3,12-13]。在人群中進行的流行病學調查結果也顯示人群中葉酸缺乏可導致先天性心臟病的發(fā)生率明顯上升[14],而母親孕期適當補充葉酸可以有效預防先心病的發(fā)生[4,15]。國內外學者研究發(fā)現(xiàn),葉酸可以有效防治乙醇攝入導致的胚胎視網膜病變[6],但葉酸挽救乙醇導致胚胎心血管發(fā)育異常的最佳干預時段有待于探討,其挽救的機制尚未明確。本研究結果發(fā)現(xiàn),在乙醇處理組胚胎發(fā)育早期7～12 hpf及時予以葉酸干預,可以有效地改善胚胎心臟和流出道發(fā)育異常情況。這一時段與斑馬魚胚胎發(fā)育的原腸胚期(5.25～10 hpf)大致吻合。在原腸胚期,位于外、中、內胚層的細胞開始向特定的組織分化,是心臟發(fā)育早期的重要階段,此時期外源性因素可對心臟發(fā)育產生較大影響。這提示在胚胎心臟形成和分化的關鍵時期給予外源性葉酸可以最佳程度上預防乙醇所致的心臟和流出道發(fā)育異常。另外，乙醇處理組胚胎予以葉酸后,bmp2b以及tbx1的表達水平較乙醇處理組增高,提示葉酸可能通過影響bmp2b以及tbx1的表達而挽救乙醇處理組胚胎心臟和流出道發(fā)育異常。

本研究利用模式生物斑馬魚,圍繞乙醇對胚胎心血管系統(tǒng)發(fā)育的干擾作用以及葉酸挽救效應開展研究,結果發(fā)現(xiàn)乙醇在胚胎發(fā)育早期可導致顯著心臟和流出道發(fā)育異常,在胚胎發(fā)育早期7～12 hpf予以葉酸挽救可達到最佳效果,其挽救機制可能與bmp2b和tbx1的表達水平上調有關。本研究旨在為乙醇導致先天性心臟病的機制研究提供線索,也期望為由于母親孕期乙醇攝入過量而導致胎兒先天性心臟病的有效早期預防和治療提供依據(jù)。

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The folic acid rescue of ethanol-induced heart and outflow tract malformations in zebrafish

SUN Shu-na1,2,YAO Ze-zhong2,JIANG Qiu3,GUI Yong-hao1△

(1DepartmentofCardiology,Children′sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102,China;2DepartmentofPediatrics,CentralHospitalofMinhangDistrict,Shanghai201199,China;3ShanghaiInstituteofCardiovascularDiseases,Shanghai200032,China)

【Abstract】ObjectiveTo observe ethanol-induced cardiac phenotypes and identify ethanol-sensitive stages during embryonic development,and to explore the optimal period during which the administration of folic acid can effectively rescue the ethanol-induced heart and outflow tract (OFT) defects and its underlying mechanisms.MethodsEthanol was administrated to zebrafish embryos in a series of developmental stages (7-12 h) and the abnormal heart and OFT phenotypes were observed after ethanol exposure.The embryos which were given ethanol at 7-12 hpf was defined as ethanol treated group.Administrating folic acid to ethanol-treated zebrafish embryos in different stages (7-12 h) was conducted to rescue the abnormal cardiac defects.The ethanol-treated embryos which were given folic acid at 7-12 hpf was defined as folic acid rescue group.The survival percentage,the malformation percentage,the heart rate and the ventricular shortening fraction (VSF) were recorded.The OFT phenotypes were evaluated using fluorescein micro-angiography.Whole-mount in situ hybridization and Real-time PCR were conducted to analyze the expression of bmp2b and tbx1.ResultsEthanol exposure produced heart and OFT defects,including the abnormal cardiac shapes,the hypogenesis of OFT and the reduced heart rate and VSF.The teratogenic effect of ethanol was observed most obviously at the early embryonic development.Supplementation of folic acid at 7-12 hours post-fertilization partially rescued the developmental defects in ethanol-induced zebrafish embryos.The expressions of bmp2b and tbx1 were reduced in ethanol-treated group,and they were partially recovered after administration of folic acid.ConclusionsFolic acid supplementation can effectively rescue ethanol-induced heart OFT defects,possibly by enhancing the expressions of bmp2b and tbx1.

【Key words】folic acid;ethanol;heart;outflow tract;zebrafish;bmp2b;tbx1

(收稿日期:2015-11-08;編輯:張秀峰)

【中圖分類號】R725.4,R394.1

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.02.002

上海市衛(wèi)生局青年科研基金(20124y086);上海市出生缺陷防治重點實驗室開放課題

△Corresponding authorE-mail:yhgui@shmu.edu.cn