唐良虎 李德 楊大春 王強(qiáng) 馬雙陶 張彥

上調(diào)Cx43對(duì)心肌細(xì)胞間通訊及離子通道的影響*

唐良虎1李德2楊大春2王強(qiáng)2馬雙陶2張彥2

(1.四川醫(yī)科大學(xué)， 四川 瀘州 646000；2.成都軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科， 四川 成都 610083)

目的 通過重組腺病毒介導(dǎo)縫隙連接蛋白Cx43在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中過度表達(dá)，觀察心肌細(xì)胞間通訊及細(xì)胞離子通道變化。 方法 通過RT-PCR法克隆SD大鼠縫隙連接蛋白Cx43基因的全長(zhǎng)cDNA，用基因重組的方法構(gòu)建腺病毒pAdEasy-1-Cx43。行心肌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染后，分別用RT-PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)Cx43在心肌細(xì)胞中的mRNA和蛋白表達(dá)，用免疫熒光技術(shù)分析Cx43在心肌細(xì)胞膜上的分布。采用劃痕標(biāo)記熒光染料示蹤(SLDT)技術(shù)觀察培養(yǎng)心肌細(xì)胞群之間的羅氏黃(lucifer yellow, LY)染色傳輸，檢測(cè)上調(diào)Cx43對(duì)心肌細(xì)胞間通訊的影響；采用單細(xì)胞膜片鉗技術(shù)分析各離子通道電流的變化，觀察上調(diào)Cx43對(duì)心肌細(xì)胞膜離子通道表達(dá)的影響。 結(jié)果 腺病毒重組質(zhì)粒pAdEasy-1-Cx43構(gòu)建成功；轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后，pAdEasy-1-CX43轉(zhuǎn)染組Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，且心肌細(xì)胞膜上分布較多；細(xì)胞劃痕熒光染料示蹤提示轉(zhuǎn)染后，心肌細(xì)胞間通訊增強(qiáng)；膜片鉗全細(xì)胞膜電流提示轉(zhuǎn)染后鈣內(nèi)流降低，鉀離子電流未發(fā)現(xiàn)有明顯改變。 結(jié)論 成功構(gòu)建腺病毒重組質(zhì)粒pAdEasy-1-Cx43載體，隙連接蛋白Cx43表達(dá)上調(diào)增強(qiáng)了心肌細(xì)胞間通訊以及鈣內(nèi)流，為Cx43改善心室肌電重構(gòu)，減少或預(yù)防室性心律失常發(fā)生的進(jìn)一步研究打下了基礎(chǔ)。

重組腺病毒轉(zhuǎn)染； 縫隙連接蛋白Cx43； 細(xì)胞劃痕熒光染料示蹤； 細(xì)胞間通訊； 膜片鉗

縫隙連接是心肌細(xì)胞間唯一具有電連接作用的細(xì)胞間連接形式，其位于心肌細(xì)胞的閏盤處, 由兩側(cè)細(xì)胞膜上的連接蛋白(connexin, Cx)構(gòu)成的連接子以非共價(jià)鍵對(duì)接而成。在人類心臟組織中,連接蛋白的亞型主要有：Cx43、 Cx40、 Cx45、Cx46和Cx37等，其中前3種是主要亞型。Cx43是心室工作肌細(xì)胞的主要連接蛋白[1，2]。相鄰細(xì)胞間通過縫隙連接進(jìn)行著信息和能量物質(zhì)的交換，參與細(xì)胞間物質(zhì)交換的代謝偶聯(lián)和電信號(hào)傳遞的電偶聯(lián)，對(duì)細(xì)胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增殖和分化等生理過程起著重要的調(diào)控作用[3]。

隨著急性心肌梗死近期救治水平的提高和人群年齡結(jié)構(gòu)老齡化，慢性心力衰竭的患病率正在逐年升高，嚴(yán)重威脅國(guó)人生命健康。目前室性心律失常的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。學(xué)者們逐漸認(rèn)識(shí)到心力衰竭患者的高死亡率與惡性室性心律失常的發(fā)生密切相關(guān)[2]。近十余年來的研究提示，心室肌細(xì)胞間電耦聯(lián)的改變可能與心律失常的發(fā)生關(guān)系緊密[1，4～6]。在各種心力衰竭動(dòng)物模型及心力衰竭患者的衰竭心肌中均發(fā)現(xiàn)心室肌細(xì)胞縫隙連接蛋白-43(connexin-43, Cx43)的表達(dá)顯著下調(diào)?？p隙連接數(shù)量減少可導(dǎo)致心室肌細(xì)胞間通訊及電傳導(dǎo)異常，從而引發(fā)室性心律失常[4]。Cx43的減少及異質(zhì)性分布增加了心室肌傳導(dǎo)的不均一性和改變了細(xì)胞膜離子通道特性，使心律失常更容易發(fā)生。心力衰竭時(shí)縫隙連接重構(gòu)導(dǎo)致心室肌細(xì)胞間電耦聯(lián)的改變可能與室性心律失常的發(fā)生有密切關(guān)系[7，8]。然而Cx43表達(dá)異常導(dǎo)致心律失常的具體機(jī)制尚不清楚。Cx43表達(dá)異常除了改變心室肌細(xì)胞間電耦聯(lián)外，是否對(duì)心室肌細(xì)胞離子通道、細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)產(chǎn)生影響？逆轉(zhuǎn)Cx43下調(diào)是否能改善其異質(zhì)性分布從而改善心肌細(xì)胞的電傳導(dǎo)及細(xì)胞離子通道重構(gòu)？這些問題目前均不清楚，國(guó)內(nèi)外也未見相關(guān)研究報(bào)道。據(jù)此，我們采用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，上調(diào)縫隙連接蛋白Cx43的表達(dá)，檢測(cè)重建心肌細(xì)胞間縫隙連接通訊，同時(shí)觀察心室肌細(xì)胞離子通道、細(xì)胞內(nèi)鈣離子電流的變化調(diào)節(jié)同時(shí)，以期改善心力衰竭時(shí)心室肌的電重構(gòu)，從而減少或預(yù)防室性心律失常的發(fā)生。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 cDNA Synthesis Kit、Ex Taq、5kb DNA Marker、λ-hind III Marker、SYBR?Premix Ex Taq購(gòu)自TAKARA 公司；pShuttle-CMV、pAdEasy-1購(gòu)自Strategene公司；DH10b 為實(shí)驗(yàn)室保存；BJ5183購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司；293 cell 購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)；Pme I、Pac I、BglII、XhoI 購(gòu)自 fermentas公司；Lipo2000、Trizol 購(gòu)自invitrogen公司；Qiagen Plasmid Mini Kit 購(gòu)自Qiagen公司；Kan、Amp sigma購(gòu)自公司；瓊脂糖膠和PCR產(chǎn)物純化系統(tǒng)購(gòu)自 promega公司；Lucifer Yellow 購(gòu)自sigma公司；DMEM 培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶購(gòu)自hyclone公司；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板 購(gòu)自corning 公司； Anti-Connexin 43 / GJA1 antibody 購(gòu)自abcam (ab11369)；SD大鼠購(gòu)自成都達(dá)碩公司；iPatch 購(gòu)自Flyion公司。

1.2 攜帶Cx43基因重組腺病毒的構(gòu)建、擴(kuò)增及純化 大鼠眼總RNA提取后根據(jù)已報(bào)道的Cx43序列設(shè)計(jì)合成引物,設(shè)計(jì)引物時(shí)引入需要的Bgl-II和Xhol酶切位點(diǎn),采用RT-PCR法制備Cx43基因全長(zhǎng)cDNA。采用Bgl-II和Xhol雙酶切Cx43 cDNA和pAdTrackCMV，然后用T4DNA連接酶將Cx43 cDNA連接到pAdTrackCMV上，構(gòu)建pAdTrackCMV/Cx43重組子，并進(jìn)行酶切鑒定及外源基因測(cè)序。將重組穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV/Cx43轉(zhuǎn)化Adeasier-1細(xì)菌即可獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-1/Cx43。采用限制性內(nèi)切酶Pac-I酶切pAdEasy-1/Cx43，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，即可包裝產(chǎn)生以CMV為啟動(dòng)子帶有目的基因Cx43及綠色熒光蛋白(GFP)基因的重組腺病毒Ad-Cx43-GFP。以抽提的重組腺病毒DNA作模板，用Cx43引物進(jìn)行PCR鑒定。用經(jīng)鑒定正確的重組腺病毒Ad-Cx43-GFP感染293細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增，采用氯化銫梯度離心獲得高滴度的純化重組腺病毒。

1.3 乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及重組腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞 取新生3天以內(nèi)的SD乳鼠(成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司),心肌細(xì)胞的培養(yǎng)按Simpson等[6]的方法進(jìn)行,分別培養(yǎng)于35mm2培養(yǎng)皿和24孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)3天待生長(zhǎng)融合至80%后用于實(shí)驗(yàn)。取純化好的重組腺病毒50μl,加入培養(yǎng)有乳鼠心肌細(xì)胞的6孔板中,在37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)36～48小時(shí)。

1.4 RT-PCR檢測(cè)Cx43的mRNA表達(dá) 取兩瓶細(xì)胞鋪滿瓶底90%的培養(yǎng)瓶，一瓶轉(zhuǎn)染腺病毒，一瓶為空白對(duì)照組,按照 Trizol試劑盒說明提取總RNA。熒光定量PCR檢測(cè)Cx43 ：引物設(shè)計(jì)序列如下(5′ to 3′)：GAPDH 上游引物：GGACCTCATGGCCTACATGG ,GAPDH 下游引物：GGACCTCATGGCCTACATGG; CX43 上游引物：TTTCATTGGGGGAAAGGCGT CX43，下游引物：GCAGACTGTTCATCACCCCA ; mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA：在 Microtube 中配制下列混合液：Oligo dT Primer (50μM) 1μl，dNTP Mixture 1μl，模板 RNA 5mg以下，Rnase Free dH2O 加至10μl，65℃保溫 5 min 后，冰上迅速冷卻；在上述 Microtube 管中配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，5×PrimeScriptTMbuffer (for real time) 4μl，Rnase Inhibitor (40U/μl) 0.5μl，PrimeScript Ⅱ RTase (200U/μl) 1μl，Rnase Free dH2O 加至20μl，緩慢混勻，30℃(10 min)，-20℃保存cDNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；RT-PCR反應(yīng)體系：10× PCR Buffer 2.5μl，25mM Mg2+1.5μl，dNTP Mixture 0.5μl，Sense primer1μl，Anti-sense primer1μl，Taq 0.2μl，cDNA1.5μl， dH2O 16.8μl; PCR反應(yīng)參數(shù)： Cycle 1：(1×) 94℃，3～4min ，Cycle 2：(30×)94℃ 30s ，60℃ 30s，72℃ 30s；Cycle 3：(1×) 72℃ 10min，16℃ ∞。

1.5 Western-blot法檢測(cè)心肌細(xì)胞中Cx43的蛋白表達(dá) 取兩瓶細(xì)胞鋪滿瓶底90%的培養(yǎng)瓶，一瓶轉(zhuǎn)染腺病毒，一瓶為空白對(duì)照組,提取蛋白后根據(jù)樣品濃度上樣,進(jìn)行SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜,將PVDF膜放入5% TBST脫脂牛奶中在室溫下封閉2小時(shí),滴加Cx43單克隆抗體(一抗?jié)舛葹?∶2000)后置于4°C冰箱內(nèi)過夜,然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(二抗?jié)舛葹?∶1500)并繼續(xù)在室溫下孵育2小時(shí),采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的方法將PVDF膜顯色后顯影于X線膠片上。用凝膠圖像分析系統(tǒng)獲取蛋白質(zhì)信號(hào)條帶圖像后,測(cè)定目的蛋白Cx43和內(nèi)參蛋白GAPDH的光密度值,計(jì)算兩者的比值作為Cx43蛋白的表達(dá)水平。

1.6 免疫熒光檢測(cè)Cx43蛋白在心肌細(xì)胞中的表達(dá)分布情況。

1.7 劃痕熒光染料示蹤(SLDT)技術(shù)觀察培養(yǎng)的心肌細(xì)胞群之間的LY染色傳輸 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后接種細(xì)胞在6 孔板內(nèi)，保證細(xì)胞在次日為單層細(xì)胞密度飽和,設(shè)3 個(gè)重復(fù)孔。24小時(shí)后棄培養(yǎng)液，以PBS 洗4 次，棄凈液體。將細(xì)胞浸泡在含0.05% Lucifer Yellow的PBS 液內(nèi)，每孔2ml。用銳利刀刃輕輕劃痕，放置3min。棄凈液體，并以PBS 洗4 次，立即用倒置熒光顯微鏡觀察攝像，KP490 濾光片觀察黃色熒光，同一視野取黃色熒光和普通光2種圖像進(jìn)行對(duì)照。計(jì)數(shù)熒光染料從劃痕邊沿細(xì)胞向鄰近細(xì)胞傳遞的列數(shù)，數(shù)目大小表征通訊功能強(qiáng)弱。

1.8 膜片鉗實(shí)驗(yàn) 采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)分析各離子通道電流的變化。

2 結(jié)果

圖1 pShuttle-CMV-Cx43的構(gòu)建

Fig 1 Construction of pShuttle-CMV-Cx43

注：A.Cx43 RT-PCR產(chǎn)物的鑒定；B.Cx43及pShuttle-CMV雙切酶；C.重組腺病毒pAdEasy-1-Cx43 pac I酶切鑒定

2.1 腺病毒重組質(zhì)粒pAdEasy-1-Cx43的構(gòu)建 圖1A示Cx43基因的全長(zhǎng)cDNA(1149bp)克隆成功；圖1B示重組質(zhì)粒pShuttle-CMV經(jīng)限制性內(nèi)切酶BglII和XhoI雙酶切,得到Cx43 1149bp、pShuttle-CMV (7.5kbp) 線狀質(zhì)粒，提示目的基因及pShuttle-CMV 質(zhì)粒酶切成功；圖1C示腺病毒重組質(zhì)粒pAdEasy-1-Cx43 用pac I酶切成功。

2.2 腺病毒重組質(zhì)粒pAdEasy-1-Cx43轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后Cx43的表達(dá) 與對(duì)照組相比，圖2A示pAdEasy-1-Cx43轉(zhuǎn)染組Cx43的mRNA表達(dá)明顯增加；圖2B、2C示pAdEasy-1-Cx43轉(zhuǎn)染組的Cx43蛋白表達(dá)明顯增加；圖2D示pAdEasy-1-Cx43轉(zhuǎn)染組Cx43蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，且多表達(dá)于胞質(zhì)中，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.3 Cx43對(duì)心肌細(xì)胞細(xì)胞間通訊的影響 圖3示空白對(duì)照組熒光傳至劃痕鄰近第4列細(xì)胞以外，而pAdEasy-1-Cx43轉(zhuǎn)染組熒光傳至劃痕鄰近第11或第12列細(xì)胞，提示Cx43過表達(dá)后心肌細(xì)胞細(xì)胞間通訊增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 腺病毒的鑒定

Fig.2 Identification of adenovirus

注：A.心肌細(xì)胞腺病毒轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組Cx43mRNA表達(dá)；B和C.腺病毒轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組Cx43蛋白表達(dá)；D.免疫熒光檢測(cè)Cx43蛋白(n=4，與對(duì)照組比較，①P<0.01)

2.4 膜片鉗記錄全細(xì)胞膜電流 與對(duì)照組相比，圖4示pAdEasy-1-Cx43轉(zhuǎn)染組的鈣內(nèi)流有所降低，鉀離子電流未發(fā)現(xiàn)有明顯改變。

圖3 A和B.細(xì)胞劃痕熒光染料示蹤(SLDT)檢測(cè)細(xì)胞間通訊情況(n=4,與對(duì)照組比較，①P<0.05)

Fig 3 A and B.Inter-cellular communication was observed by Scrape-Loading and Dye Transfer Technique

圖4 轉(zhuǎn)染Cx43對(duì)細(xì)胞鈣離子及鉀離子電流的影響注

Fig 4 The changes of Ca+and K+after Cx43 transfection

注：A.膜片鉗全細(xì)胞膜電流的檢測(cè)；B.鈣離子及鉀離子Ⅰ～Ⅴ曲線圖

3 討論

既往對(duì)Cx43的研究均采用基因敲除和基因沉默的方法，而本實(shí)驗(yàn)采用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和過表達(dá)技術(shù)逆轉(zhuǎn)縫隙連接蛋白Cx43的表達(dá)，重建心肌細(xì)胞間縫隙連接通訊，在研究策略的選擇和應(yīng)用上有一定創(chuàng)新性。腺病毒載體具有體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率高,感染細(xì)胞范圍廣,可感染靜止期和分裂期細(xì)胞,同時(shí)又不整合到宿主細(xì)胞基因組中,病毒滴度高,易于濃縮和貯存等優(yōu)點(diǎn),而成為基因治療和臨床實(shí)驗(yàn)的重要載體[9，10]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的pAdEasyXL腺病毒載體包裝系統(tǒng)大大提高了質(zhì)粒pAdEasy-1與重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-Cx43的同源重組成功率。HEK293細(xì)胞中缺乏核酸內(nèi)切酶和重組酶,重組腺病毒質(zhì)粒在其中擴(kuò)增就大大提高了提取質(zhì)粒的量和確保外源基因插入的穩(wěn)定性,所以此包裝系統(tǒng)方法簡(jiǎn)便,同源重組效率高,并且快速，實(shí)驗(yàn)周期短,能夠得到高滴度的重組腺病毒,為Cx43的腺病毒重組質(zhì)粒構(gòu)建打下了基礎(chǔ)。

目前室性心律失常的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。既往認(rèn)為心力衰竭時(shí)心室肌細(xì)胞膜離子通道的紊亂及Ca2+循環(huán)異常是引發(fā)室性心律失常的直接原因[11～13]。但近十余年來的研究提示，心室肌細(xì)胞間電耦聯(lián)的改變可能與心律失常的發(fā)生關(guān)系更為緊密。現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，心力衰竭時(shí)心室肌細(xì)胞間縫隙連接(gap junction, GJ)會(huì)發(fā)生重構(gòu)，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞電生理特性發(fā)生改變，進(jìn)一步促進(jìn)室性心律失常的發(fā)生[14，15]。在各種心力衰竭動(dòng)物模型及心力衰竭患者的衰竭心肌中均發(fā)現(xiàn)心室肌細(xì)胞縫隙連接蛋白-43(connexin-43, Cx43)的表達(dá)顯著下調(diào)?？p隙連接數(shù)量減少可導(dǎo)致心室肌細(xì)胞間通訊及電傳導(dǎo)異常，從而引發(fā)室性心律失常[16]。本研究通過上調(diào)縫隙連接蛋白Cx43的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞間縫隙連接通訊增強(qiáng)，其是否能減少或預(yù)防室性心律失常的發(fā)生，為心力衰竭患者發(fā)生室性心律失常及猝死的預(yù)防另辟蹊徑。

然而Cx43表達(dá)異常導(dǎo)致心律失常的機(jī)制尚不清楚。縫隙連接對(duì)于以合胞體方式工作的心肌細(xì)胞而言，不僅是細(xì)胞間連接的一種形式, 還是電信號(hào)快速傳導(dǎo)的低電阻通道, 它確保了心肌電機(jī)械活動(dòng)的同步有序進(jìn)行[17，18]。因而推測(cè)心肌細(xì)胞縫隙連接分布和數(shù)量的改變都對(duì)心律失常的發(fā)生有著重要影響。有學(xué)者認(rèn)為，心肌細(xì)胞縫隙連接通道在決定傳導(dǎo)速度方面可能比離子流的作用更大[19～23]。因此，我們通過全細(xì)胞膜電流技術(shù)觀察心肌細(xì)胞膜離子流，發(fā)現(xiàn)通過上調(diào)縫隙連接蛋白Cx43的表達(dá)，心肌細(xì)胞鈣離子電流減低，鉀離子電流沒有明顯變化，所以我們認(rèn)為Cx43表達(dá)異常除了改變心室肌細(xì)胞間電耦聯(lián)外，可能對(duì)心室肌細(xì)胞離子通道、細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)產(chǎn)生了影響，從而進(jìn)一步導(dǎo)致室性心律失常的發(fā)生。

4 結(jié)論

通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，利用重組腺病毒構(gòu)建pAdEasy-1-Cx43載體轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后，縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)上調(diào)增強(qiáng)了心肌細(xì)胞的細(xì)胞間通訊以及鈣內(nèi)流，鈣離子電流降低,而對(duì)鉀離子電流的影響不明顯。為Cx43改善心室肌電重構(gòu)，減少或預(yù)防室性心律失常發(fā)生的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。而Cx43的上下游分子及信號(hào)通路仍不是太清楚，需要進(jìn)一步深入研究探討。

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Changes of inter-cellular communications and cell ion channels after over-expression Cx43

TANG Lianghu1,LI De2,YANG Dachun2,etal

(1.SichuanMedicalUniversity,Luzhou646000,Sichuan,China;2.DepartmentofCardiology,ChengduMilitaryGeneralHospital,Chengdu610083,China)

Objective In order to observe the changes of inter-cellular communications and cell ion channels,over-expression gap junction protein connexin 43(Cx43) was transfected in cardiomyocytes by recombinant adenovirus-mediated in vitro. Methods The full-length cDNA of Cx43 gene was cloned by RT-PCR in SD rats, and adenovirus pAdEasy-1-Cx43 was constructed through gene recombination. The expression of Cx43 mRNA was determined by RT-PCR. The protein was determined by Western blot after transfection in cardiomyocytes. The Cx43’s distribution on myocardial cell membrane was observed by immunofluorescence. The changes of inter-cellular communication was observed by Scrape-Loading and Dye Transfer Technique (SLDT),which was contributed to analysis lucifer yellow(LY) in cultured cardiomyocytes after over-expression Cx43;the changes of ion channel currents was observed by single-cell patch-clamp technique to analysis the expression of myocardial cell membrane ion channels after upregulation the expression of Cx43. Results The recombinant adenovirus pAdEasy-1-Cx43 was successfully constructed. Cx43 mRNA and protein expression upregulated in pAdEasy-1-CX43 group and the distribution of Cx43 was increased on myocardial cell membrane after transfection. The inter-cellular communication enhanced after transfection by Scrape-Loading and Dye Transfer Technique;whole-cell patch-clamp current calcium influx prompted after transfection. The potassium ion currents had not a similar change. Conclusion The recombinant adenovirus pAdEasy-1-Cx43 vectors were successfully constructed. The inter-cellular communication and calcium influx were enhanced after upregulation Cx43 in cardiomyocytes. These will contribute to the further study of Cx43 in improving of ventricular electrical remodeling and reducing or preventing ventricular arrhythmias.

Adenovirus transfection; Gap junction protein connexin 43; Scrape-Loading and Dye Transfer Technique; Inter-cellular communications; Cell patch-clamp

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)計(jì)劃(2011JY0029)，四川省科技創(chuàng)新苗子工程培育項(xiàng)目(2015016)

李德，教授，主任醫(yī)師，E-mail:lide660809@qq.com；楊大春，教授，主任醫(yī)師，E-mail:yangdc71@126.com

R-33

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.03.005

2015-12-01； 編輯： 母存培)