李瓊鋒　韋袞政　李黔云

摘要：目的 通過觀察健脾益氣通絡(luò)復方對早期糖尿病腎病（DN）大鼠血清脂聯(lián)素（ADPN）與血清超敏C-反應(yīng)蛋白（hs-CRP）表達的影響，以探討健脾益氣通絡(luò)復方防治早期糖尿病腎病的效果及其作用機制。方法 將實驗用大鼠分為正常對照組、模型空白組（高糖高脂飼料 + STZ）、中藥預(yù)防組、中藥低劑量組、中藥高劑量組及陽性西藥對照組，采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)結(jié)合一次尾靜脈注射鏈脲佐菌素（STZ）的造模方法，復制出糖尿病腎病模型，各藥物組干預(yù)4周后，將大鼠處死取血，用ELISA方法測試各組血清hs-CRP 與血清 ADPN 的表達情況，最后進行組間比較。結(jié)果 模型空白組大鼠的血清 hs-CRP含量比正常組明顯上升（P<001），其它各組經(jīng)藥物干預(yù)后，均可以顯著降低其表達水平（P<001），但以中藥預(yù)防組效果最佳；模型空白組大鼠的血清ADPN比正常組明顯下降（P<001），其它各組經(jīng)藥物干預(yù)后，均可以顯著升高其表達水平（P<001），以中藥低劑量組效果最佳。結(jié)論 DN的發(fā)病機制可能與血清hs-CRP 和血清ADPN 的表達異常密切相關(guān)；健脾益氣通絡(luò)復方防治 DN發(fā)生發(fā)展的藥理機制可能是通過調(diào)節(jié)血清 hs-CRP 和血清 ADPN的異常表達來實現(xiàn)。

關(guān)鍵詞：糖尿病腎??；健脾益氣通絡(luò)復方；血清脂聯(lián)素；血清超敏C-反應(yīng)蛋白

中圖分類號：R2855 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2016）08-0078-03

糖尿病腎?。―N）又稱糖尿病腎小球硬化癥，是糖尿?。―M）最常見、最嚴重的慢性微血管并發(fā)癥之一，是慢性腎衰最常見的病因及DM患者死亡的主要原因。hs-CRP 是一種敏感的非特異性的臨床上最有效的炎癥標志物，其本身也參與炎癥過程。脂聯(lián)素是一種內(nèi)源性生物活性蛋白質(zhì)，是一種胰島素增敏激素，近年來發(fā)現(xiàn)其血漿水平的降低是發(fā)生胰島素抵抗和糖尿病的獨立危險因素。本文旨在探討健脾益氣通絡(luò)復方對早期DN大鼠血清hs-CRP和血清ADPN表達的影響，深入分析中醫(yī)藥防治DN的藥理作用機制，從深層次探討早期DN的發(fā)病機制。

1 材料

11 藥物與試劑 鏈脲佐菌素（STZ，美國 Sigma 公司）；健脾益氣通絡(luò)復方由黃芪30 g，黨參20 g，白術(shù)20 g，茯苓20 g，丹參20、澤蘭20g，水蛭6 g組成，用免煎中藥配方顆粒（江陰天江有限公司）；西藥選用洛汀新（即鹽酸苯那普利片，10mg/片，由北京諾華制藥有限公司制造）。血清超敏 C—反應(yīng)蛋白 ELISA 試劑盒、血清脂聯(lián)素ELISA試劑盒（美國 R&D 公司）。

12 實驗動物及分組 選擇雄性健康SD大鼠60只，體重180-220 g，購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司。隨機分為6組：A組-正常對照組、 B組-模型空白組（高脂高糖飼料 + STZ）、 C組-中藥預(yù)防組、D1 組-中藥低劑量組、D2 組-中藥高劑量組及E組-陽性西藥對照組。

13 主要儀器及設(shè)備 血糖儀及試紙（德國羅氏診斷公司）；加樣器（Eppendorf 公司）；酶標儀洗板機、微孔板酶標儀（美國伯樂公司）；電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；超低溫冰箱（日本三洋機電株式會社）。

2 方 法

21 DN模型的制備及成功標準 采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)加STZ一次尾靜脈注射法誘導大鼠早期 DN模型。除正常對照組外，其他各組均給予高糖高脂飼料（615%普通飼料、20%蔗糖、 10%豬油、25%膽固醇、5%蛋黃粉、 10% 膽酸鹽）。喂養(yǎng)1個月。禁食12h后，高糖高脂喂養(yǎng)的大鼠均以40mg/kg 的鏈脲佐菌素（STZ）一次尾靜脈注射[注射前用01mol/L無菌枸櫞酸緩沖液（pH42）配制]。72h后，尾靜脈取血測量血糖值，以空腹血糖≥167mmol/L，列入觀察對象。1周后，收集高血糖大鼠24h尿液，測量尿微量白蛋白值（云南中醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科檢測），將檢測結(jié)果高于正常值范圍的大鼠納入正式實驗中。

22 藥物的干預(yù)方法 A、B組給生理鹽水2mL；中藥顆粒劑溶于蒸餾水中，C、E 組大鼠每日用藥量按人體（g/kg）的63倍計算；D1組為C組的 1/3 用藥量；D2組為 C 組的3倍用藥量。預(yù)防組在血糖達標后即給予中藥復方。DN模型復制成功后，D1、D2 及E組開始給藥。灌胃，每日1次，給藥療程共4周。

23 標本采集及測定 給藥療程結(jié)束后，大鼠禁食、自由飲水24h后，予10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3mL/kg體重）。開腹，腹主動脈采血，不抗凝，低溫靜置2h后3000 r/min離心10min，收集血清，以備用ELISA法檢測。ELISA法測定血清hs-CRP 和血清脂聯(lián)素的過程嚴格按照試劑盒的要求進行。

24 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)分析用SPSS 115統(tǒng)計軟件，計量資料組間比較用單因素方差分析（One-Way ANOVE），P

3 結(jié)果

31 對血清超敏C-反應(yīng)蛋白表達的影響 見表1，圖 1。

從上表的統(tǒng)計結(jié)果分析可見，A組的血清脂聯(lián)素含量與各組均有顯著性差異（P<001）；B組的含量明顯下降，且與各組間存在著明顯的差異（P<001）；經(jīng)藥物干預(yù)治療后，各組血清脂聯(lián)素水平均呈現(xiàn)上升趨勢，且與B組均有顯著性差異（P<001），并與A組也存在著顯著性差異（P<001）；在各藥物干預(yù)組中，D1組的上升趨勢明顯，與各藥物干預(yù)組存在著顯著性的差異（P<001）。由此可見，血清脂聯(lián)素的含量在DN的發(fā)生發(fā)展過程中明顯下降，各組經(jīng)藥物干預(yù)后，其含量均呈現(xiàn)明顯的上升趨勢，但以D1組的干預(yù)效果最佳，提示低劑量的中藥復方對升高血清脂聯(lián)素的含量效果最好。

4 討論

糖尿病腎?。―N）是糖尿病全身性微血管病變主要表現(xiàn)之一，是一種以血管損傷為主的腎小球病變。DN早期只是出現(xiàn)間歇性蛋白尿或微量蛋白尿，隨著病情的逐漸加重而出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿、 高血壓、水腫等，晚期出現(xiàn)腎功能衰竭，是糖尿病患者死亡的主要原因之一。糖尿病早期的腎臟功能損傷主要是微量蛋白尿的出現(xiàn)，是反應(yīng)腎小球受損的最敏感的指標，在腎功能損傷后尚可逆轉(zhuǎn)時發(fā)出的警告，因而尿微量白蛋白的測定能夠指導臨床及時治療[1]。本實驗在使用一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素（STZ）一周后，收集大鼠24h尿液，測量尿微量白蛋白的變化，予出現(xiàn)高于正常值范圍的大鼠納入到實驗中，認為大鼠已經(jīng)開始出現(xiàn)腎臟損傷。

糖尿病腎病（DN），屬中醫(yī)“消渴”、“虛勞”、“水腫”等病范疇。目前中醫(yī)治療DN，“多從腎論治”。筆者認為脾為后天之本，氣血生化之源，有升清、散精和固攝精氣的作用。正如《素問經(jīng)脈別論》曰：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通條水道，下輸膀胱，水精四布，五經(jīng)并行”。糖尿病的主要診斷依據(jù)是血糖升高超過標準，而血糖主要來源于脾胃受納的水谷精微。精微積聚當責之脾失運化。胰島素絕對或相對不足，相對于中醫(yī)為脾運化水谷精微功能不足，脾“為胃行其津液”的物質(zhì)基礎(chǔ)匱乏和功能失調(diào)，其病機關(guān)鍵為脾虛。脾虛固攝無力導致精微物質(zhì)流失出現(xiàn)蛋白尿?！捌⑻摗保瑲庋υ?，氣虛則動血無力，血運不暢；血弱則脈絡(luò)充盈欠佳，血流緩慢，血液中致病物質(zhì)沉積于脈絡(luò)，則脈絡(luò)狹窄，二者均導致瘀血而成瘀證?！跋省辈∪艨刂撇患?，隨病情發(fā)展波及腎，隨著腎受損逐漸加重，固攝無權(quán)，加重精微物質(zhì)持續(xù)下注，蛋白尿流失加重。因此，糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，總以“脾傷”、“脾虛”為始動環(huán)節(jié)，即早期糖尿病腎病以脾氣虛弱，瘀血阻絡(luò)為基本病機，日久脾病傳腎。故本實驗采用健脾益氣通絡(luò)中藥復方來進行干預(yù)，并取得了明顯的效果。

hs-CRP是一種血清球蛋白，由肝細胞合成，是全身性炎癥反應(yīng)急性期的非特異性標志物，其本身也參與炎癥過程，是區(qū)分低水平炎癥狀態(tài)的靈敏指標。血清 hs-CRP 能通過影響內(nèi)皮細胞，致內(nèi)皮功能受損，使微血管病變加速動脈硬化進展。在糖尿病微血管并發(fā)癥超敏CRP致DN的可能發(fā)病機制為慢性炎癥，慢性炎癥可能通過造成腎血管內(nèi)皮細胞和系膜細胞的損害等多種途徑使腎臟損傷[2-4]：炎癥反應(yīng)可引起機體的氧化應(yīng)急，使低密度脂蛋白氧化為 OX-LDL，后者可直接損害腎小球內(nèi)皮細胞，增強單核細胞對血管內(nèi)皮的黏附和浸潤，炎癥反應(yīng)還可促進糖化和脂化終末產(chǎn)物修飾血管蛋白，引起管壁增厚、彈性下降，促進動脈硬化的發(fā)生、發(fā)展。Navarra 等[5]發(fā)現(xiàn)尿蛋白與血液中高敏hs-CRP呈正相關(guān)。本實驗研究結(jié)果表明，DN大鼠的血清hs-CRP顯著升高，經(jīng)藥物干預(yù)后，其含量呈現(xiàn)下降趨勢，且與模型組均有顯著性差異（P

脂聯(lián)素是脂肪細胞分泌的一種特異性蛋白，具有降低餐后血清游離脂肪酸和增強肝細胞對胰島素的敏感性而抑制肝葡萄糖輸出[6]，還可抑制TNF-α通路增強胰島素PI-3K通路，增強胰島素的敏感性[7]。脂聯(lián)素可抑制單核細胞系的增殖和成熟巨噬細胞的功能，是一種重要的負性調(diào)節(jié)物質(zhì)，可通過其抑制作用來終止炎癥的發(fā)生發(fā)展過程[8]。本實驗的研究結(jié)果顯示，DN大鼠的血清脂聯(lián)素表達水平明顯下降，與其他各組有顯著性差異（P<001）；經(jīng)各藥物組干預(yù)后，血清脂聯(lián)素含量均有上升，但以低劑量組的效果最佳，提示低劑量的中藥復方對血清脂聯(lián)素的含量表達影響最好。

綜合本實驗的研究結(jié)果分析，DN的發(fā)病機制與血清 hs-CRP和血清脂聯(lián)素的異常表達密切相關(guān)，血清 hs -CRP在DN大鼠明顯升高，血清脂聯(lián)素在 DN大鼠明顯下降，脂聯(lián)素可以有效降低血清hs-CRP的異常表達，提示其參與了終止炎癥發(fā)生發(fā)展的過程。健脾益氣通絡(luò)復方對DN的發(fā)生發(fā)展有明顯的防治作用，其藥理機制可能是通過調(diào)節(jié)血清hs-CRP和血清ADPN的異常表達來實現(xiàn)。在本實驗中，提示不同劑量的中藥復方對于不同指標的影響效果存在著一定的差異，為今后的中藥劑量研究提供了一定的依據(jù)。

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（收稿日期：2016-06-10）