麻仕利，王偉，梁蓉

（1.天津醫(yī)科大學研究生院，天津300070；2.天津市泰達國際心血管病醫(yī)院心內(nèi)五科，天津300457；3.天津市胸科醫(yī)院綜合病房，天津300222）

論著

同型半胱氨酸代謝關(guān)鍵酶基因多態(tài)性與單純收縮期高血壓關(guān)系的初步研究

麻仕利1，王偉2，梁蓉3

（1.天津醫(yī)科大學研究生院，天津300070；2.天津市泰達國際心血管病醫(yī)院心內(nèi)五科，天津300457；3.天津市胸科醫(yī)院綜合病房，天津300222）

目的：探討亞甲基-四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因C677T、蛋氨酸合成酶還原酶（MTRR）基因A66G、蛋氨酸合成酶（MS）基因A2756G 3種同型半胱氨酸代謝相關(guān)酶基因多態(tài)性與單純收縮期高血壓（ISH）患者發(fā)病的關(guān)系。方法：以220例單純收縮期高血壓患者作為試驗組對象，選擇同期就診的無高血壓患者130例作為對照組，檢測其血中同型半胱氨酸水平，并應用分子生物學方法對MTHFR C677T、MTRR A66G、MS A2756G 3個基因位點進行多態(tài)性檢測。結(jié)果：（1）ISH組患者血中同型半胱氨酸水平[（14.81±5.88）μmol/L]高于對照組[（12.71±4.32）μmol/L]，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；（2）ISH組患者MTHFR T/T及C/T基因型分布頻率和T等位基因頻率（分別為19.5%、60%、49.5%）均高于對照組（分別為15.4%、45.4%、38.1%）（P＜0.05）。（3）MS基因A2756G的各型基因型分布頻率及等位基因頻率與對照組比較差異無明顯統(tǒng)計學意義。（4）ISH組患者MTRR基因A/G及G/G基因型分布頻率和G等位基因分布頻率低于對照組,但無統(tǒng)計學意義。結(jié)論：同型半胱氨酸對ISH的影響可能一部分是通過其關(guān)鍵酶基因的突變造成的；MTHFR基因C677T位點的突變可能是ISH的遺傳危險因子；而MTRR基因A66G、MS基因A2756的多態(tài)性改變與ISH的發(fā)生可能無明顯關(guān)系。

同型半胱氨酸；單純收縮期高血壓；蛋氨酸合成酶還原酶;蛋氨酸合成酶;亞甲基-四氫葉酸還原酶

大量研究表明，血漿中同型半胱氨酸（Hcy）水平高低與心腦血管疾病的發(fā)生關(guān)系密切，高水平的同型半胱氨酸血癥是導致心腦血管疾病發(fā)生的重要獨立的危險因素之一[1]。而導致血漿Hcy水平升高的因素很多，包括遺傳因素、環(huán)境因素以及二者之間的相互作用。一方面，葉酸、維生素B12等B族維生素的缺乏可引起Hcy血濃度的變化，另一方面，Hcy代謝通路中的一些關(guān)鍵酶基因的遺傳性改變，能導致其編碼的相應酶蛋白活性的變化，進而影響到血漿的Hcy水平。亞甲基-四氫葉酸還原酶（MTHFR）、蛋氨酸合成酶（MS）、蛋氨酸合成酶還原酶（MTRR）均為Hcy代謝過程中的關(guān)鍵酶，本研究旨在探討單純收縮期高血壓（ISH）患者以上3種關(guān)鍵酶基因的多態(tài)性與其發(fā)病的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取近年在我院門診就診的220例ISH患者為ISH組，選取同期就診的130例無高血壓患者為對照組，入選者均為北方漢族人，經(jīng)流行病學問卷調(diào)查和體格檢查后，按照2013年中國高血壓防治指南制定的高血壓診斷標準，并除外肝、腎、自身免疫性疾病及繼發(fā)性高血壓。

1.2 方法

1.2.1 測量血壓 采用符合計量標準的臺式水銀柱血壓計，所有入選對象至少休息15 min后，坐位由專業(yè)人員測量右側(cè)肱動脈血壓，取Korotkoff第1和第5音為收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP），連續(xù)測量3次，每隔2 min測量1次，取3次平均值為個體血壓值。

1.2.2 DNA樣品的制備 采用百泰克離心柱法DP5802提取全血DNA。

1.2.3 血漿Hcy水平及其他生化指標測定 分別抽取研究對象空腹外周血4 mL，0.5 h內(nèi)離心，分離出血漿，用熒光偏振免疫分析法檢測血漿Hcy，應用全自動生化儀檢測血脂、尿酸等指標。

1.2.4 MTHFR基因 C677T、MS基因 A2756G、MTRR基因A66G基因多態(tài)性檢測(PCR-RFLP法) 1.2.4.1 MTHFR基因片段PCR擴增:MTHFR基因C677T引物序列P1，5′-CCTTGAACAGGTGGAGGC C-3′；P2，5′-CAAAGAAAAGCTGCGTGAT-3′。PCR反應條件:94℃預變性8 min，94℃60 s，62℃60 s，72℃60 s，共35個循環(huán)，最后于72℃再延伸7 min (PCR擴增儀為 Biometra Tgradient)。反應結(jié)束，MTHFR基因擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hinf酶切，行PAGE凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外透射燈上顯像并拍照以確定基因型。

1.2.4.2 MTRR基因片段PCR擴增:MTRR基因A66G引物序列P1，5′-CAGGCAAAGGCCATCGCAG AAGACAT-3′；P2，5′-CACTTCCCAACCAAAATTCT TCAAAG-3′。PCR反應條件:94℃預變性4min，94℃60s，60℃60 s，72℃60 s，共35個循環(huán)，最后于72℃再延伸5 min。反應結(jié)束，MTRR基因擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI酶切，行凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外透射燈上顯像并拍照以確定基因型。

1.2.4.3 MS基因片段PCR擴增:MS基因A2756G引物序列P1，5′-CATGGAAGAATATGAAGATATTAGA C-3′；P2，5′-GAACTAGAAGACAGAAATTCTCTA-3′。PCR反應條件:94℃預變性8 min，94℃50 s，58℃60 s，72℃90 s，共35個循環(huán)，最后于72℃再延伸7 min。反應結(jié)束，MS基因擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶HaeIII酶切，行凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外透射燈上顯像并拍照以確定基因型。

1.3 統(tǒng)計學處理 按Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢測樣本的群體代表性?；蛐图盎蝾l率比較采用χ2檢驗。計量資料間比較采用成組資料的t檢驗；計數(shù)資料以s表示；多組間樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析；多因素分析采用Logistic回歸分析；連鎖不平衡模式（LD）及單體型分析分別采用DataAnalyser0.34和Phase2.1軟件。連鎖不平衡系數(shù)（D’）＜0.2被認為不具有LD，D’＞0.5具有LD，D’＞0.8具有強LD，D’=1處于完全LD。使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ISH組及對照組基本資料及相關(guān)生化指標的比較 見表1。ISH組與對照組一般資料比較，性別、年齡、吸煙比例均未見明顯差異（P＞0.05），但ISH組患者糖尿病的患病率（28.2%）較對照組（14.6%）明顯升高，兩組差異比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；從表中還可以看出ISH組患者的同型半胱氨酸水平及超敏C反應蛋白（hs-CPR）水平高于對照組，兩組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而兩組患者總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、尿酸均值水平比較雖ISH組＞對照組，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。以是否患ISH為應變量，性別、年齡、同型半胱氨酸水平、糖尿病患病與否為自變量進行Logistic回歸分析，得出同型半胱氨酸及糖尿病為其發(fā)病的危險因素。

表1 ISH組與對照組患者的一般資料及相關(guān)生化指標比較Tab 1 Comparison of general data and some biochemical indicators between hypertension group and control group

2.2 Hcy 3個關(guān)鍵酶基因型的確定

2.2.1 MTHFR基因酶切后可產(chǎn)生3種基因型:無突變野生C/C型產(chǎn)生195 bp片段，突變雜合子C/T型產(chǎn)生175 bp、130 bp、20 bp片段，突變純合子T/T型產(chǎn)生130 bp片段。MTRR基因酶切后產(chǎn)生:無突變野生AA型 (126 bp、31 bp），突變雜合子AG型（126bp、157bp、31bp）片段，突變純合子GG（157bp）。MS基因酶切后產(chǎn)生:無突變野生A/A型（239 bp)，突變雜合子A/G型(239 bp、159 bp、80 bp)，突變純合子G/G型(130bp)。由于28bp、31bp的條帶分子量小，泳動速率快，瓊脂糖凝膠電泳未顯示（圖1～3）。

圖1 MTHFR C677T PCR產(chǎn)物酶切圖Fig 1 The enzyme digested map for MTHFR C677T PCR products

圖2 MTRR基因A66G PCR產(chǎn)物酶切圖Fig 2 The enzyme digested map for MTRR A66G PCR products

圖3 MS基因A2756G PCR產(chǎn)物酶切圖Fig 3 The enzyme digested map about MS A2756G products

2.2.2 本試驗中，ISH組及對照組 MTHFR基因C677T、MTR基因A66G、MS基因A2756G的各種基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗（P＜0.05）,表明ISH組及對照組屬于遺傳平衡體，有群體代表性。從表2中可看出MTHFR基因C677T ISH組的C/T、T/T基因型頻率均大于對照組，統(tǒng)計結(jié)果亦顯示ISH的基因型頻率分布與對照組存在差異（χ2=14.487，P=0.001＜0.05），且T等位基因頻率ISH組＞對照組（χ2=8.675，P=0.003＜0.05）。表3中MTRR基因A66G ISH組的A/G、G/G及G等位基因頻率均低于對照組，但由于樣本量小，統(tǒng)計學差異無明顯意義（P＞0.05），表4中MS基因型中幾乎未見G/G突變純合子，對照組與ISH組中的基因型頻率及等位基因頻率無明顯差異性（χ2=0.002，P=0.960＞0.05）。

表2 兩組MTHFR C677T基因型頻率及等位基因頻率分布Tab 2 The distribution of MTHFR C677T genetype frequency and allele frequency in the two groups

表3 兩組MTRR基因A66G基因型頻率及等位基因頻率分布Tab 3 The distribution of MTRR A66G genetype frequency and allele frequency in the two groups

表4 兩組MS基因A2756G基因型頻率及等位基因頻率分布Tab 4 The distribution of MS A2756G genetype frequency and allele frequency in the two groups

3 討論

高同型半胱氨酸血癥（HHcy）目前已被大量研究證實是心腦血管病發(fā)病的危險因素之一[2]，2006年美國高血壓協(xié)會發(fā)布合并高同型半胱氨酸水平的原發(fā)性高血壓稱之為H型高血壓，《中國高血壓防治指南2010》中將血漿同型半胱氨酸≥10 μmol/L列入影響高血壓患者心腦血管預后的重要危險因素[3]。ISH作為高血壓的一個重要亞型，主要是由于血管壁順應性的下降、僵硬度的升高以及血管內(nèi)皮功能的紊亂造成的[4-5]，而HHcy也是通過影響體內(nèi)氧化應激反應、促進血管中層平滑肌細胞增殖和分化、減少NO的生成等機制使血管的順應性和擴張功能下降及血管外周阻力的上升，從而造成血壓升高[6-7]，本試驗結(jié)果亦表明ISH組的同型半胱氨酸水平高于對照組，且HHcy、糖尿病是ISH發(fā)病的危險因素。進一步論證了高同型半胱氨酸血癥在ISH發(fā)病中的重要作用。

血中Hcy水平主要受環(huán)境和遺傳等因素的影響[8]，MTHFR編碼Hcy代謝通路中的關(guān)鍵酶N5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶，它是Hcy再甲基化轉(zhuǎn)化為蛋氨酸的關(guān)鍵酶，該基因的C677T單核苷酸多態(tài)性位點的C→T等位基因的突變引起其編碼的纈氨酸代替了丙氨酸產(chǎn)生MTHFR酶的不耐熱性變化，從而降低了該酶的活性，使催化5，10-亞甲基四氫葉酸反應并提供甲基給Hcy進行轉(zhuǎn)甲基代謝的能力下降，導致Hcy代謝障礙、血漿Hcy水平增高[9]。國內(nèi)相關(guān)研究表明，MTHFR基因多態(tài)性與ISH發(fā)病關(guān)系密切，可能是ISH的易感基因[10]。國外研究亦表明Hcy在MTHFR C677T的不同基因型之間有顯著差異[11]，MTHFR C677T不僅是中國男性原發(fā)高血壓病的危險因素，也與其腎小球濾過率的降低關(guān)系密切[12]。本研究結(jié)果顯示:ISH組患者MTHFR T/T及C/T基因型頻率和T等位基因頻率均高于對照組（P＜0.05），表明MTHFR基因可能介導了ISH與Hcy水平之間的關(guān)系，MTHFR基因C677T位點C到T的突變導致了Hcy水平的升高，從而使ISH的發(fā)病率增加。

MTRR基因A66G及MS基因A2756G亦是Hcy的關(guān)鍵酶基因，近年來研究表明MTRR基因A66G多態(tài)性與心腦血管疾病及一些出生缺陷發(fā)病相關(guān)[13-14]，MS是一種維生素B12依賴酶，催化Hcy復甲基化變成甲硫氨酸，目前已發(fā)現(xiàn)的8種突變中以D919突變多見，即2756A→G導致天冬氨酸取代了甘氨酸殘基，它將引起相應的酶缺乏或活性發(fā)生改變，從而導致Hcy代謝異常。MTRR基因定位于5p15.2-15.3，包含15個外顯子和14個內(nèi)含子。其編碼的MTRR主要功能是維持鈷胺素的活性，而鈷胺素是MS的輔酶，參與MS活性的恢復[15]，本研究未發(fā)現(xiàn)以上兩種基因的多態(tài)性與ISH的發(fā)病有明顯關(guān)系，雖ISH組患者MTRR基因A/G及G/G基因型頻率和G等位基因頻率低于對照組,但無統(tǒng)計學意義，不能推斷出G等位基因?qū)SH的發(fā)病有保護作用。而MS基因中突變的G等位基因在所有患者中只有6%左右，兩組數(shù)據(jù)在本研究中無統(tǒng)計學差異，未發(fā)現(xiàn)MS基因與ISH的發(fā)病有聯(lián)系。

本研究初步結(jié)果提示MTHFR C677T基因C-T的突變似乎與ISH的發(fā)病有一定的關(guān)系，可能通過影響Hcy的水平，進而促使ISH發(fā)病，而MTRR及MS基因與ISH的關(guān)系尚需大樣本進一步研究。

[1]王玉蓉．同型半胱氨酸與心腦血管疾病的相關(guān)性分析[J]．檢驗醫(yī)學與臨床，2012，9（6）:738

[2] Ganguly P,Alam S F.Role of homocysteine in the development of cardiovascular disease[J].Nutr J,2015，14:6

[3]陶國樞．關(guān)注H型高血壓的防治[J]．保健醫(yī)苑，2013，5（5）:9

[4]何莉，曾朝榮．單純收縮期高血壓[J]．中華高血壓雜志，2007，15（11）:961

[5]朱光照，雷夢覺．單純收縮期高血壓大動脈中層鈣化形成機制[J]．中華高血壓雜志，2008，16（4）:300

[6]吳紹燕，左中．同型半胱氨酸與高血壓相關(guān)性的Meta分析[J]．國際檢驗醫(yī)學雜志，2012，33（23）:2920

[7] Fu H J,Zhao L B,Xue J J,et al.Elevated serum homocysteine(Hcy) levels May contribute to the pathogenesis of cerebral infarction[J].J Mol Neurosci,2015,56(3):553

[8] Zhu Y,Zhu R X,He Z Y,et al.Association of MTHFR C677T with total homocysteine plasma levels and susceptibility to Parkinson’s disease:a meta-analysis[J].Neurol Sci,2015,36(6):945

[9]宗永華，李小鷹，陳光亮，等．同型半胱氨酸水平與N5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性的關(guān)系[J]．臨床心血管病雜志，2011，27（3）:203

[10]孫曉楠，李玉明，郭虹．單純收縮期高血壓患者同型半胱氨酸代謝關(guān)鍵酶基因多態(tài)性相關(guān)因子研究[J]．中華心血管病雜志，2003，31（4）:269

[11]Zappacosta B,Graziano M,Persichilli S,et al.5,10-Methylenete trahydrofolate reductase(MTHFR)C677T and A1298C polymor phisms:genotype frequency and association with homocysteine and folatelevelsinmiddle-southernItalianadults[J].CellBiochemFunct, 2014,32(1):1

[12]Dong Q1,Tang G,He M,et al.Methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism is associated with estimated glomerular filtrationrateinhypertensiveChinesemales[J].BMCMedGenet,2012, 13:74

[13]Nakaoka H,Takahashi T,Akiyama K,et al.Differential effects of chromosome 9p21 variation on subphenotypes of intracranial aneurysm:site distribution[J].Stroke,2010,41(8):1593

[14]王淑媛，魯衍強，馬少杰，等．湘潭市漢族女性MTHFR和MTRR基因多態(tài)性分布及其與血漿Hcy水平的關(guān)系[J]．天津醫(yī)藥，2014，42（12）:1205

[15]王素敏，沈嶸，石小燕，等．同型半胱氨酸代謝酶基因突變多態(tài)性與妊娠高血壓綜合征遺傳易感性研究[J]．中國優(yōu)生與遺傳雜志，2006，14（4）:15

（2015-10-19收稿）

Preliminary study on the relationship between the gene polymorphisms of homocysteine metabolismrelated enzymes and isolated systolic hypertension

MA Shi-li1,WANG Wei2,LIANG Rong3
（1.Graduate School,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2.The Fifth Department of Cardiology,TEDA International Cardiovascular Hospital,Tianjin 300457,China;3.General Ward,Chest Hospital of Tianjin,Tianjin 300222,China）

Objective：To study the relationship between the isolated systolic hypertension（ISH）and the gene polymorphisms of homocysteine（Hcy）metabolism-related enzymes.Methods：Two hundred and twenty patients with isolated systolic hypertension were collected as the experimental group and 130 patients without high blood pressure were recruited as the control group.The levels of homocysteine in their blood were detected and the gene polymorphisms of MTHFR C677T（methylenetetrahydrofolate reductase gene C677T），MTRR A66G（methionine synthase reductase gene A66G）,MS A2756G（methionine synthase gene A2756G）were tested by using the methods of molecular biology.Results:（1）The levels of Hcy in experimental group were higher than those in controls（P＜0.05）.（2）The T/T,T/C genotype frequency and allele T frequency of MTHFR in experimental group were significantly higher than that in controls（P＜0.05）.（3）There were no significant differences in the genotype frequency of MS among the experimental group and control group．（4）The A/G,G/G genotype frequency and allele G frequency of MTRR in experimental group were lower than that in the control group,but with no statistical significance(P＞0.05).Conclusion：The mutation of C677T in MTHFR gene may be associated with the incidence of ISH while the MTRR A66G gene and the MS A2756G gene polymorphism may be not the correlated genes for ISH.

homocysteine；isolated systolic hypertension；methionine synthase reductase；methionine synthase；methylenetetrahydrofolate reductase

R544.1

A

1006－8147（2016）02-0093-04

天津市衛(wèi)生局科技基金資助項目（2013KZ081）

麻仕利（1989-），女，碩士在讀，研究方向：心血管疾病；通信作者：王偉，E-mail：greatwhlm@yahoo.com。