蔡文璽，王潤玲，董衛(wèi)莉，劉艾林

（1.天津醫(yī)科大學藥學院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點實驗室，天津300070；2.中國醫(yī)學科學院藥物研究所，國家藥物篩選中心，北京 100050）

論著

新型含吡啶基吡唑酰胺類化合物的合成與抗腫瘤活性

蔡文璽1，王潤玲1，董衛(wèi)莉1，劉艾林2

（1.天津醫(yī)科大學藥學院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點實驗室，天津300070；2.中國醫(yī)學科學院藥物研究所，國家藥物篩選中心，北京 100050）

目的：設計合成一系列新型的含吡啶基吡唑酰胺類化合物，并測試其生物活性。方法：以取代氨基苯甲酸和吡唑羧酸為起始原料，設計并合成了含吡啶基吡唑酰胺類化合物，測試化合物4a～4d對人肺癌A-549，人肝癌Bel7402和人腸癌HCT-8細胞的體外抗腫瘤活性。結(jié)果：合成了4個結(jié)構(gòu)全新的含吡啶基吡唑酰胺類化合物，其結(jié)構(gòu)通過1H NMR、紅外光譜和元素分析進行了表征。體外抗腫瘤活性實驗研究表明，化合物4d對Bel7402細胞株在濃度為5 μg/mL時有較好的抑制活性，其他化合物也表現(xiàn)出一定的抑制活性。結(jié)論：化合物4d顯示了較好的抑癌作用，值得進一步研究。

吡唑酰胺類；合成；抗腫瘤活性

吡唑類化合物是一類應用廣泛的五元含氮雜環(huán)化合物,吡唑環(huán)上的取代位點可以連接不同的取代基從而開發(fā)出更多具有抗癌、抗炎、抗菌及殺蟲等生物活性的吡唑類衍生物[1-4]?；钚愿?、毒性小和配位能力較高等優(yōu)點使該類化合物的使用越來越廣泛，被更多的應用到藥物的研發(fā)和生產(chǎn)中。含吡唑雜環(huán)酰胺類化合物因其作用機制新穎、環(huán)境友好，在醫(yī)藥、農(nóng)藥等領(lǐng)域備受關(guān)注[5-8]。Cankara Pirol[9]等合成了一系列含喹啉基的吡唑酰胺類化合物，并發(fā)現(xiàn)它們對人肝癌、乳腺癌和結(jié)腸癌細胞有很好的抑制活性。研究發(fā)現(xiàn)，在分子中引入兩個雜環(huán)活性中心，通過不同藥效基團的協(xié)同作用，能產(chǎn)生更好的生物、生理活性，從而有利于獲得應用價值更高的化合物。本文以取代氨基苯甲酸和吡唑羧酸為起始原料，通過脲橋?qū)⒈郊柞０方Y(jié)構(gòu)和含有吡啶、吡唑雙雜環(huán)結(jié)構(gòu)連接起來，設計并合成了4個1-（3-氯吡啶-2-基）-N-苯氨基甲?；?1H吡唑-5-酰胺類化合物（4a～4d），其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，紅外光譜和元素分析表征，期望從中篩選出具有抗癌等生物活性的新型化合物。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 X-4型數(shù)字顯示顯微熔點測定儀（北京泰克儀器有限公司）；Bruker AVANCE-300MHz和Varian Mercury Vx 400 MHz核磁共振儀（DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標）；Yanaco CHN CORDER MT-3型元素分析儀，ZF-I型三用紫外分析儀。實驗所用試劑均為分析純或化學純。

1.2 化合物的合成 目標化合物的合成路線見圖1。

圖1 目標化合物的合成路線Fig 1 Synthetic route of the title compounds

1.2.1 中間體1的合成 將取代氨基苯甲酸（10mmol）溶于DMF（20 mL）中，加熱至60℃，分批加入NCS（11 mmol），加熱回流30 min。減壓蒸餾脫去大部分溶劑，加入20 mL水，冰水浴下充分攪拌1 h，抽濾，蒸餾水洗滌得中間體1。

1.2.2 中間體2的合成 將化合物1（1 mmol）加入到15 mL SOCl2中，70℃下回流1 h，冷卻至室溫后減壓蒸餾，除去多余的SOCl2。將得到的殘液溶于10 mL甲苯，0℃下，將其緩慢加入到烷基胺（1 mmol）的甲苯溶液（15 mL）中，0℃下攪拌4 h。反應完成后，將反應液倒入冰水（40 mL）中，用甲苯（20 mL×3）萃取。將有機相用水（40 mL）洗滌兩次，NaSO4干燥，抽濾后，用硅膠柱層析純化得到中間體2。

1.2.3 中間體3的合成 把草酰氯（10 mmol）滴入吡啶基吡唑羧酸（5 mmol）和二氯甲烷（50 mL）的混懸液中，然后加入兩滴DMF，室溫反應12 h，減壓蒸餾得到酰氯粗品。把酰氯粗品溶于10 mL THF中，在冰鹽冷卻下，慢慢滴加到5倍量的氨水和100 mL水的混合物中，有大量白色固體生成，在冰水冷卻下攪拌30 min，抽濾得到中間體3。

1.2.4 目標化合物4的合成[11]向50 mL圓底燒瓶中加入中間體3（1.5 g，5 mmol），30 mL 1，2-二氯乙烷，攪拌均勻后，加入草酰氯（1.3 g，10 mmol），回流12 h，減壓脫去過量的草酰氯及溶劑得中間體異氰酸酯的粗品。把上述粗品溶于10 mL乙腈中，在室溫下滴加到取代鄰氨基苯甲酰胺2（5 mmol）的乙腈（30 mL）溶液中，室溫攪拌反應12 h，有大量白色固體析出，抽濾得固體，用乙醇洗滌固體或重結(jié)晶得到目標產(chǎn)物4的純品。

1.3 目標化合物的抗腫瘤活性初步測試[11]選用對數(shù)生長期的貼壁A549、Bel7402和HCT-8 3種腫瘤細胞，分別用胰酶消化后，用10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成15 000個/mL的細胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種190 μL，37℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。實驗組加樣品10 μL，每孔終體積為200μL，用1640培養(yǎng)液補足。37℃，5%CO2培養(yǎng)3d。棄上清液，每孔加入100 μL新鮮配制的0.5 mg/mL MTT的無血清培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心棄上清，并加入150 μL DMSO溶解MTT formazon沉淀，用微型振蕩器混勻，在酶標儀上測定波長544 nm處的光密度值。用下面公式計算化合物對細胞生長的抑制率，實驗平行3次。

抑制率=（陰性對照OD值-加藥組OD值）/（陰性對照組OD值-空白對照組OD值）×100%

2 結(jié)果

2.1 化合物的表征數(shù)據(jù)

2.1.1 中間體化合物的表征數(shù)據(jù)

1：白色固體，產(chǎn)率92.1%，m.p.226～228。

2a：白色固體，產(chǎn)率58.0%，m.p.161～162℃；1H NMR(CDCl3,300 MHz)δ:1.25[d,6H,J=6.6 Hz,CH (CH3)2],4.16-4.28[m,1H,CH(CH3)2],5.48(br,1H,NH2), 5.78(br,1H,NH),6.60-7.24(m,3H,Ar-H)。

2b：白色固體，產(chǎn)率88.0%，m.p.119～123℃；1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:0.99(t,3H,J=7.6 Hz, CH2CH3),1.64(q,2H,J=7.2 Hz,CH2CH3),2.25(s,3H, CH3),3.35-3.40(m,2H,NHCH2),6.17(br,1H,NH), 7.15(d,1H,J=1.6 Hz,Ar-H),7.22(d,1H,J=2.4 Hz, Ar-H)。

2c：白色固體，產(chǎn)率89.0%,m.p.161～162℃；1H NMR (CDCl3,400 MHz)δ:1.25 (d,6H,J=6.4 Hz, CH3),2.14(s,3H,CH3),4.15-4.26(m,1H,CH),5.52 (br,2H,NH2),5.78(br,1H,NH),7.10-7.17(m,2H, Ar-H)。

2d：白色固體，產(chǎn)率95.0%,m.p.89～90℃；1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:1.45(s,9H,CH3)，2.13(s,3H, CH3),5.46(br,2H,NH2),5.79(br,1H,NH),7.07-7.12 (m,3H,Ar-H)。

3：白色固體，產(chǎn)率84.2%，m.p.200～202℃；1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:5.52(br,1H,NH2),6.01(br, 1H,NH2),6.71(s,1H,pyrazolyl-H),7.36(dd,1H,J= 4.8,8.0 Hz,pyridyl-H),7.83 (d,1H,J=8.0 Hz, pyridyl-H),8.41(d,1H,J=4.4 Hz,pyridyl-H)。

2.1.2 目標產(chǎn)物的表征

4a：白色固體，產(chǎn)率83.6%,m.p.204～206℃;1H NMR(DMSO,400 MHz)δ:1.03[d,6H,J=6.4 Hz,CH (CH3)2],3.80-3.88[m,1H,CH(CH3)2],7.51-7.52(m,2H, Ar-H),7.60(s,1H,pyrazolyl-H),7.68(dd,1H,J=4.8, 8.0Hz,pyridyl-H),8.13(d,1H,J=9.6 Hz,Ar-H),8.25 (d,1H,J=8.0 Hz,pyridyl-H),8.46(d,1H,J=8.0 Hz, NHCH),8.54(d,1H,J=4.8 Hz,pyridyl-H),11.06(br, 1H,CONHCO),11.41(br,1H,NHCO).Anal.Calcd for C20H17BrCl2N6O3:C 44.47,H 3.17,N 15.56;found C 44.43,H 3.28,N 15.21。

4b：白色固體，產(chǎn)率86.4%,m.p.186～189℃;1H NMR (DMSO,400 MHz)δ:0.81 (t,3H,J=7.6 Hz, CH2CH3),1.39(q,2H,J=7.2 Hz,CH2CH3),2.16(s,3H, CH3),3.02-3.07(m,2H,NHCH2),7.28(d,1H,J=2.4Hz, Ar-H),7.45(d,1H,J=2.0 Hz,Ar-H),7.64(s,1H, pyrazolyl-H),7.69(dd,1H,J=4.8,8.0Hz,pyridyl-H), 8.27(d,1H,J=8.0 Hz,pyridyl-H),8.34(t,1H,J=4.8 Hz,NHCH2),8.56(d,1H,J=4.4 Hz,pyridyl-H),9.82 (br,1H,CONHCO),11.39(br,1H,NHCO).Anal.Calcd for C21H19BrCl2N6O3:C 45.51,H 3.46,N 15.16;found C 45.73,H 3.24,N 15.37。

4c：白色固體，產(chǎn)率82.3%,m.p.202～203℃;1H NMR(DMSO,400 MHz)δ:1.01[d,6H,J=6.4 Hz,CH (CH3)2],2.16(s,3H,CH3),3.82-3.91[m,1H,CH(CH3)2], 7.25(s,1H,Ar-H),7.43(s,1H,Ar-H),7.65(s,1H, pyrazolyl-H),7.69(dd,1H,J=4.8,8.0Hz,pyridyl-H), 8.15(d,1H,J=7.6 Hz,NHCH),8.26(d,1H,J=8.0 Hz, pyridyl-H),8.55(d,1H,J=4.4 Hz,pyridyl-H),9.77 (br,1H,CONHCO),11.41(br,1H,NHCO).Anal.Calcd for C21H19BrCl2N6O3:C 45.51,H 3.46,N 15.16;C 45.63, H 3.12,N 14.86。

4d：白色固體，產(chǎn)率79.5%,m.p.187～189℃;1H NMR(DMSO,400 MHz)δ:1.19[s,9H,C(CH3)3],2.15 (s,3H,CH3),7.18(d,1H,J=2.0 Hz,Ar-H),7.39(d, 1H,J=2.0 Hz,Ar-H),7.67(s,1H,pyrazolyl-H),7.69 (dd,1H,J=4.8,8.0 Hz,pyridyl-H),7.82[s,1H,NHC (CH3)3],8.25(d,1H,J=8.0 Hz,pyridyl-H),8.54(d,1H, J=4.8Hz,pyridyl-H),9.73(br,1H,CONHCO),11.43 (b r,1H,NH CO).Anal.Calcd for C22H21BrCl2N6O3:C 46.50,H3.72,N14.79;found C 46.39,H 3.47,N 14.98。

2.2 目標化合物的抗癌活性 對目標化合物4a～4d進行了體外抗癌活性的初步篩選，結(jié)果見表1。

表1 化合物4a～4d對A-549、Bel7402和HCT-6癌細胞的抑制率Tab 1 Inhibition rates of compounds 4a～4d against A-549、Bel7402 and HCT-6 cell lines

3 討論

3.1 化合物的合成 雜環(huán)酰胺3在草酰氯的作用下生成中間體異氰酸酯，不用分離直接進行下一步反應即可。中間體異氰酸酯和中間體2的反應采用乙腈為溶劑，得到的白色固體能從溶劑中析出來，直接抽濾就能得到目標化合物4，可用乙醇洗滌固體或者重結(jié)晶就能得到純的產(chǎn)品。

3.2 化合物的1H NMR表征 以化合物4c為例說明。7.65(s,1H,pyrazolyl-H)是吡唑環(huán)上的CH峰；吡啶環(huán)上的三個氫的化學位移：7.69 ppm處是pyridyl-H5的峰，由于受鄰位pyridyl-H4及pyridyl-H6的耦合而裂分成dd峰,耦合常數(shù)分別為8.0 Hz和4.8 Hz，8.26 ppm處是pyridyl-H4的峰，由于受鄰位pyridyl-H5的耦合而裂分成d峰，耦合常數(shù)為8.0 Hz，8.55 ppm處是pyridyl-H6的峰，由于受鄰位pyridyl-H5的耦合而裂分成d峰，耦合常數(shù)為4.4 Hz；8.15 ppm處是脂肪酰胺的NH峰，9.77 ppm處是脲橋中雜環(huán)酰胺的NH峰，11.41 ppm處是脲橋中苯甲酰胺的NH峰。

3.3 化合物的紅外光譜表征 以化合物4c為例說明。3422 cm-1，3317 cm-1，3208 cm-1處分別是脲橋中苯甲酰胺、脲橋中雜環(huán)酰胺和脂肪酰胺的氮氫伸縮振動吸收峰；2972 cm-1處是烷烴的飽和C-H的吸收峰，1 696 cm-1，1 652 cm-1和1 577 cm-1分別是酰胺羰基的伸縮振動吸收峰，1 341～1 541 cm-1之間是苯環(huán)上的碳碳雙鍵的伸縮振動吸收峰。

3.4 目標化合物的抗癌活性及構(gòu)效關(guān)系分析 從表1數(shù)據(jù)可知，在5 μg/mL濃度下，所合成化合物4d對人肝癌細胞Bel7402有較高的抑制作用，其它化合物的抗癌活性也對于3種癌細胞有著不同程度的抑制作用，提示引入叔丁基可提高其生物活性。由上述結(jié)果可以看出，該系列化合物顯示出一定的抗癌活性，其構(gòu)效關(guān)系正在進一步的研究中。

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（2015-11-05收稿）

醫(yī)學論文中被誤用為單位符號的“ppm、ppb、ppt”英文縮寫的換算

在醫(yī)學論文中，“ppm、ppb、ppt”這類英文縮寫常常被作者作為單位符號使用，而“ppm、ppb、ppt”不是量綱一的量的單位的專門名稱，也不是數(shù)學符號，更不是單位符號，只是表示數(shù)量份額的英文名詞縮寫（英文全稱分別為parts per million、parts per billion、parts per trillion）。在實際研究中，儀器測量的數(shù)值可能會以“ppm、ppb、ppt”形式給出結(jié)果，作者在撰寫文章進行數(shù)據(jù)描述時則需對“ppm、ppb、ppt”進行換算。

對溶液而言，換算前需了解體積比還是質(zhì)量比。1 μg/mL是質(zhì)量-體積比，如果溶液的密度是1 g/mL，則1 μg/mL相當于1 ppm；如果溶液密度不是1 g/mL，則需要進行換算。

對大氣中的污染物而言，常用體積濃度和質(zhì)量-體積濃度來表示其在大氣中的含量。體積濃度是用每立方米大氣中含有污染物的體積數(shù)來表示（如cm3/m3、mL/m3），換算關(guān)系是：1 ppm=1 cm3/m3=10-6，1 ppb=10-9，1 ppt=10-12；質(zhì)量-體積濃度是用每立方米大氣中污染物的質(zhì)量數(shù)來表示（如mg/m3、g/m3），換算關(guān)系是：C= 22.4X/M，式中：X為污染物以mg/m3表示的濃度值；C為污染物以ppm表示的濃度值；M為污染物的分子質(zhì)量。

在土壤、動植物、固體廢棄物中“ppm、ppb、ppt”與質(zhì)量含量的換算關(guān)系為：1 ppm=1 mg/kg=1 000 μg/kg；1 ppb=1 μg/kg=10-3mg/kg；1 ppt=1 ng/kg=10-6mg/kg。

本刊編輯部

Synthesis and biological activity of novel amides containing 1-(pyridin-2-yl)pyrazole derivatives

CAI Wen-xi1,WANG Run-ling1,DONG Wei-li1,LIU Ai-lin2
（1.School of Pharmacy,Tianjin Medical University,Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Development of Clinical Therapeutics and Diagnostics,Tianjin 300070,China;2.Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences,National Center for Pharmceuticalscreening,Beijing 100050,China）

Objective：To design and synthesize a series of novel amides containing 1-(pyridin-2-yl)pyrazole derivatives,and to evaluate their biological activities in vitro.Methods：A series of amides containing 1-(pyridin-2-yl)pyrazole derivatives were synthesized using substituted aminobenzoic acid and pyrazole carboxylic acid as starting materials and the biological activity of the title compounds 4a～4d were tested against A-549,Bel7402 and HCT-8 cell lines.Results：Four new types of amides containing 1-(pyridin-2-yl)pyrazole derivatives were synthesized and characterized by1H NMR,IR and Elemental Analysis．The preliminary results indicated that the compound 4d showed inhibiting effects on Bel7402 cell line in vitro at the concentration of 5 μg/mL,while showing no notable inhibiting activity against other cell 1ines．Conclusion：Compound 4d may have anticancer activity,and is worth further studying.

amides containing 1-(pyridin-2-yl)pyrazole；synthesis；anticancer activity

R9

A

1006－8147（2016）02-0115-04

國家自然科學基金青年基金資助項目(21102103)，中國博士后科學基金特別資助項目(2014T70222)，中國博士后科學基金面上項目(2011M500532)

蔡文璽(1989-)，男，碩士在讀，研究方向：藥物化學；通信作者：董衛(wèi)莉，E-mail:dongweili@tijmu.edu.cn；劉艾林，E-mail: liuailin@imm.ac.cn。