曾令達(dá) 彭惠蓮 宋冠華 王紹芬

摘要：【目的】研究5種植物乙醇提取物及其復(fù)配物對(duì)荔枝霜疫霉菌的抑菌活性，為開(kāi)發(fā)荔枝水果保鮮劑和植物源復(fù)配殺菌劑提供科學(xué)依據(jù)。【方法】采用超聲波輔助提取法提取丁香、黃柏、細(xì)辛、苦參和花椒等5種植物的乙醇提取物，利用生長(zhǎng)速率法和孢子囊萌發(fā)法探討5種植物乙醇提取物及其復(fù)配物對(duì)荔枝霜疫霉菌的抑制作用。【結(jié)果】丁香、黃柏和細(xì)辛在提取物濃度5.000 mg/mL下對(duì)荔枝霜疫霉菌的抑菌率均為100.00%，苦參和花椒的抑菌率分別為83.00%和74.00%。丁香、細(xì)辛、黃柏、苦參和花椒的乙醇提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌的抑菌中濃度（EC50）分別為0.30、0.51、0.58、1.21和1.48 mg/mL。在1∶1（V/V）的配比下，苦參與花椒乙醇提取物的復(fù)配物抑制荔枝霜疫霉菌菌絲生長(zhǎng)的增效比率（SR）最高，為4.59，表現(xiàn)為增效作用；丁香+黃柏、丁香+細(xì)辛和黃柏+細(xì)辛復(fù)配物的SR則在0.5～1.5，表現(xiàn)為相加作用。【結(jié)論】丁香、黃柏、細(xì)辛、苦參和花椒等5種植物的乙醇提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌有較強(qiáng)的抑菌活性，其復(fù)配物對(duì)抑制荔枝霜疫霉菌菌絲生長(zhǎng)具有增效或相加作用。在抑菌復(fù)配劑配伍時(shí)，可從降低成本和保護(hù)野生植物資源角度考慮選擇適當(dāng)?shù)闹参锓N類。

關(guān)鍵詞： 乙醇提取物；復(fù)配物；荔枝霜疫霉；抑菌活性

中圖分類號(hào)： S482.38 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）08-1332-06

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to study antibacterial activity of ethanol extracts from 5 species of plants and their compounds against Peronophythora litchi Chen， in order to provide scientific basis for developing litchi preservatives and botanical compound fungicide. 【Method】Five kinds of extracts were extracted from Syringa aramaticum， Phellodendron amurense Rupr.， Asarum sieboldii， Sophora flavescens and Pricklyash peel by ultrasonic-assisted extraction method， respectively. The inhibitory effect of 5 kinds of extracts and their compounds on P. litchi were tested by using mycelial growth rate method and sporangial germination assay. 【Result】The results showed that， the inhibition rates of 5.000 mg/mL extracts from S. aramaticum， P. amurense and A. sieboldii against P. litchi were all 100.00%， those of extracts from S. flavescens and P. peel were 83.00% and 74.00%， respectively. The median effective concentrations（EC50） of five extracts from S. aramaticum， P. amurense， A. sieboldii， S. flavescens and P. peel were 0.30， 0.51， 0.58， 1.21 and 1.48 mg/mL， respectively. Furthermore， when any two extracts were mixed at the ratio of 1∶1（V/V）， the synergistic effect of compound extracts from S. flavescens and P. peel was the best， and the synergistic ratio（SR） was the highest（4.59）. The SR of S. aramaticum and P. amurense compound extracts， S. aramaticum and A. sieboldii compound extracts， P. amurense and A. sieboldii compound extracts ranged from 0.5 to 1.5， showing additive effect. 【Conclusion】The extracts from S. aramaticum， P. amurense， A. sieboldii， S. flavescens and P. peel have high antifungal activities to P. litchi， and their compounds have synergistic or additive inhibitory effects on mycelial growth of P. litchi. Considering compatibility of antifungal compound， the appropriate plant species should be selected from aspects of reducing cost and protecting wild plant resources.

Key words： ethanol extract； compound； Peronophythora litchi Chen； inhibitory activity

0 引言

【研究意義】荔枝霜疫霉病是荔枝最主要的病害之一，廣泛分布于我國(guó)荔枝主栽區(qū)，嚴(yán)重影響荔枝的產(chǎn)量（姜子德等，2011）及果實(shí)的貯藏和對(duì)外銷售，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失（戚佩坤，1994）。目前，荔枝霜疫霉病仍以化學(xué)藥劑防治為主（黃梁新，2013；曾蓉姿，2015），但瑞毒霉錳鋅、殺毒礬等常用化學(xué)藥劑的使用容易造成荔枝霜疫霉菌抗藥性提高，且頻繁用藥造成生產(chǎn)成本上升、環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等后果和風(fēng)險(xiǎn)（鞠榮等，2003）。因此，研究防治荔枝霜疫霉病的高效、無(wú)公害、無(wú)殘留植物源生物藥劑對(duì)荔枝產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】至今，已研究發(fā)現(xiàn)一些植物的提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌具有較強(qiáng)的抑菌活性。吳光旭等（2006）發(fā)現(xiàn)開(kāi)口箭甲醇提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌有明顯的離體和活體抗菌活性，對(duì)荔枝果實(shí)具有較好的貯藏保鮮效果。曾勇等（2007）發(fā)現(xiàn)盾葉薯蕷、水菖蒲等植物的甲醇和乙醇提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌的抑制率均在80%以上。丘麒等（2007）研究表明，巴核桃、大楊柳和甘草甲醇提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌有較高的抑菌活性。張慧等（2008）研究發(fā)現(xiàn)，金縷梅和毛枝魚藤等甲醇提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌具有較好的抑菌活性。羅建軍等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，甘草甲醇提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌的抑制率達(dá)97.83%。曾令達(dá)等（2012a， 2012b）研究發(fā)現(xiàn)，陰香、大蒜、丁香、黃連和細(xì)辛等乙醇提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌具有抑制作用。將具有抑菌作用的植物提取物進(jìn)行復(fù)配，可增強(qiáng)抑菌活性。關(guān)于防治荔枝霜疫霉的植物提取物復(fù)配研究也進(jìn)行了一些嘗試，但相關(guān)報(bào)道很少，且主要為提取物與化學(xué)殺菌劑之間的復(fù)配。賴毅東（2003）篩選出增效作用較好的中草藥配伍液PW-6，該配伍液對(duì)荔枝霜疫霉菌有很強(qiáng)的抑制作用；胡美英等（2009）發(fā)現(xiàn)茶皂素與咪鮮胺混合對(duì)自然傷口感染霜疫霉的荔枝果30 d防效可達(dá)95.23%。【本研究切入點(diǎn)】目前，關(guān)于植物提取物對(duì)荔枝霜疫霉抑制效果的研究主要在單一植物提取物方面，對(duì)不同植物提取物協(xié)同抑菌的研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在篩選較強(qiáng)抑菌活性植物的基礎(chǔ)上，采用離體培養(yǎng)方法進(jìn)行單一植物乙醇提取物和復(fù)配物對(duì)荔枝霜疫霉菌抑菌活性試驗(yàn)，明確單一植物乙醇提取物和復(fù)配物的抑菌活性差異，旨在為開(kāi)發(fā)高效、經(jīng)濟(jì)的荔枝水果保鮮劑和植物源復(fù)配殺菌劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試植物材料共4科5種（表1），均從惠州市惠城區(qū)大參林藥店購(gòu)進(jìn)。供試?yán)笾λ呙咕≒eronophythora litchi Chen）由惠州學(xué)院生命科學(xué)系生理實(shí)驗(yàn)室提供。

1. 2 植物提取物制備

將植物晾干后粉碎過(guò)40目篩，稱取50.0 g置于500 mL三角瓶中，加入95%乙醇100 mL浸泡5 h，超聲波提取1 h后過(guò)濾，再用95%乙醇定容至100 mL，置于-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 抑菌活性試驗(yàn)

1. 3. 1 菌絲生長(zhǎng)速率法 分別將5種植物提取物與 PSA培養(yǎng)基（馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基，冷卻至50 ℃左右）充分混合，配制成5.000 mg/mL帶藥培養(yǎng)基，進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)量測(cè)定；另外，將丁香、細(xì)辛和黃柏提取物配制成2.000、1.000、0.500、0.250和0.125 mg/mL等5個(gè)質(zhì)量濃度梯度的帶藥培養(yǎng)基，把苦參和花椒提取物配制成5.000、2.500、1.000、0.500和0.250 mg/mL等5個(gè)質(zhì)量濃度梯度的帶藥培養(yǎng)基，進(jìn)行同一植物提取物在不同濃度梯度下菌絲生長(zhǎng)量測(cè)定。取10 mL各帶藥培養(yǎng)基倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿制成帶藥培養(yǎng)基，用直徑為4 mm的打孔器在培養(yǎng)好的荔枝霜疫霉菌落邊緣打取菌餅，將菌餅移植到帶藥培養(yǎng)基中心（一皿一個(gè)菌餅），使菌絲面向下接觸培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測(cè)量并記錄菌落直徑，按下述公式計(jì)算抑菌率。以乙醇代替提取物制作培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。

菌絲凈生長(zhǎng)量=菌落直徑-菌餅直徑

抑菌率（%）=（對(duì)照菌絲凈生長(zhǎng)量-處理菌絲凈生長(zhǎng)量）/對(duì)照菌絲凈生長(zhǎng)量×100

毒力計(jì)算方法：將抑菌率換算成幾率值，質(zhì)量濃度以對(duì)數(shù)值表示，以各提取物不同質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值（x）和菌落生長(zhǎng)抑制率的幾率值（y）求取毒力回歸方程y=a+bx，并計(jì)算抑菌中濃度（EC50）。

1. 3. 2 孢子囊萌發(fā)法 將荔枝霜疫霉菌接種于PSA培養(yǎng)基上28 ℃下培養(yǎng)10 d后，用20 mL無(wú)菌蒸餾水沖洗菌絲及孢子囊，4層紗布過(guò)濾制得孢子囊懸液，鏡檢并調(diào)整孢子囊濃度，使其在低倍鏡下（10×10）每個(gè)視野的孢子數(shù)達(dá)80～100個(gè)。取5 mL孢子囊懸液于試管中，加入5.000 mg/mL植物提取物后放入28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h后鏡檢，隨機(jī)檢查3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)數(shù)，按下述公式計(jì)算孢子囊萌發(fā)抑制率。每處理重復(fù)3次，以95%乙醇加入孢子囊懸液作對(duì)照。

孢子囊萌發(fā)抑制率（%）=（對(duì)照孢子囊萌發(fā)率-處理孢子囊萌發(fā)率）/對(duì)照孢子囊萌發(fā)率×100

1. 4 復(fù)配物抑菌效果試驗(yàn)

參照Wadley的方法（王廷廷，2013）進(jìn)行植物乙醇提取物的復(fù)配試驗(yàn)。復(fù)配方法：用制備的提取物母液在1∶1（V/V）配比下混合，混合后以兩種提取物的EC50為基礎(chǔ)，用二倍稀釋法配制復(fù)配物梯度，根據(jù)濃度梯度的實(shí)測(cè)值通過(guò)毒力回歸方程計(jì)算EC50實(shí)測(cè)值，并通過(guò)下述公式計(jì)算理論EC50。

復(fù)配物理論EC50=（a+b）/[（a/A的EC50）+（b/B的EC50）]

式中，A、B分別代表不同植物提取物，a、b分別為兩組分在混劑中含量的比值。

以增效比值（SR）判定不同混合組配的抑菌活性作用，SR<0.5為拮抗作用，SR=0.5～1.5為相加作用，SR>l.5為增效作用。

增效比值（SR）=EC50理論值/EC50實(shí)際值

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同植物乙醇提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

如表2所示，在5.000 mg/mL濃度下，丁香、黃柏和細(xì)辛對(duì)荔枝霜疫霉菌的抑菌率均為100.00%，苦參和花椒的抑菌率分別為83.00%和74.00%。如表3所示，在2.000 mg/mL濃度下，丁香、黃柏和細(xì)辛對(duì)荔枝霜疫霉菌的抑菌率分別為97.36%、80.99%和92.28%，顯示丁香、黃柏和細(xì)辛較苦參和花椒對(duì)荔枝霜疫霉有更強(qiáng)的抑制作用。根據(jù)5種植物提取物的5個(gè)濃度梯度對(duì)荔枝霜疫霉菌的抑菌率分別計(jì)算各提取物的毒力回歸方程；根據(jù)回歸方程，得到各乙醇提取物的EC50（表3）。從表3的EC50可看出，對(duì)荔枝霜疫霉菌抑菌活性最強(qiáng)的為丁香，其后依次是細(xì)辛、黃柏、苦參和花椒。

2. 2 不同植物乙醇提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌孢子囊萌發(fā)的抑制作用

由表4可知，分別用濃度為5.000 mg/mL的植物乙醇提取液處理荔枝霜疫霉菌孢子囊，以花椒乙醇提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌孢子囊萌發(fā)的抑制率最高，為80.45%，黃柏、細(xì)辛、丁香和苦參的抑制率均在50.00%以上，分別為73.73%、57.65%、78.36%和58.90%，細(xì)辛乙醇提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌孢子囊的抑制率最低。

2. 3 不同植物乙醇提取物的復(fù)配物對(duì)荔枝霜疫霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

依椐上述不同植物提取物的抑菌效果，選取丁香、黃柏和細(xì)辛進(jìn)行兩兩復(fù)配，苦參與花椒進(jìn)行復(fù)配。如表5所示，在1∶1（V/V）的配比下，植物乙醇提取物復(fù)配后形成苦參+花椒、丁香+黃柏、丁香+細(xì)辛和黃柏+細(xì)辛4種復(fù)配物，對(duì)應(yīng)的EC50分別為0.29、0.45、0.30和0.52 mg/mL。由表6可知，苦參+花椒復(fù)配物對(duì)荔枝霜疫霉菌菌絲生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，SR為4.59，表現(xiàn)為增效作用；丁香+黃柏、丁香+細(xì)辛和黃柏+細(xì)辛復(fù)配物的SR分別為0.89、1.23和1.04，表現(xiàn)為相加作用。

3 討論

自然界中擁有非常豐富的荔枝霜疫霉生物防治資源（徐遲默等，2015），但不同植物的乙醇提取物的抑菌效果不同（謝俊杰等，2016）。本研究發(fā)現(xiàn)在乙醇提取物濃度5.000 mg/mL條件下，丁香、黃柏、細(xì)辛、苦參和花椒對(duì)荔枝霜疫霉菌的抑菌率均大于70.00%。在植物抑菌研究中，佘世望等（1997）測(cè)定了60種植物乙醇提取物的抗菌防腐作用，發(fā)現(xiàn)丁香、花椒等5種中藥對(duì)19種食品腐敗菌有明顯的抗菌作用，其中丁香和花椒具有較強(qiáng)的抑菌作用。本研究同樣發(fā)現(xiàn)丁香和花椒具有較強(qiáng)的抑菌活性，丁香和花椒對(duì)荔枝霜疫霉菌的EC50分別為0.30和1.48 mg/mL；在5.000 mg/mL條件下，丁香、花椒對(duì)荔枝霜疫霉的抑菌率分別為100.00%和74.00%，對(duì)荔枝霜疫霉孢子囊的萌發(fā)抑制率分別為78.36%和80.45%。黃柏具有廣泛的抗菌作用，都日娜和烏日娜（2008）研究發(fā)現(xiàn)黃柏在抗炎、抗菌方面有廣泛作用，有良好的開(kāi)發(fā)前景；王蘭等（2010）發(fā)現(xiàn)黃柏、苦參等中藥對(duì)黑曲霉、擬青霉等真菌有明顯的抑霉作用；陳潔等（2013）在進(jìn)行傳統(tǒng)中藥體外抗真菌研究中發(fā)現(xiàn)，黃柏、知母等具有較好的抗真菌活性。本研究發(fā)現(xiàn)黃柏對(duì)荔枝霜疫霉也具有較強(qiáng)的抑制作用，黃柏對(duì)荔枝霜疫霉的EC50為0.58 mg/mL，在5.000 mg/mL條件下，黃柏對(duì)荔枝霜疫霉的抑菌率為100.00%，對(duì)荔枝霜疫霉孢子囊的萌發(fā)抑制率為73.73%。曾勇等（2007）用10 mg/mL苦參甲醇提取物處理荔枝霜疫霉菌，其對(duì)菌絲的生長(zhǎng)抑制率為89.10%，具有較強(qiáng)的抑菌活性；本研究中苦參乙醇提取物在5.000 mg/mL條件下對(duì)荔枝霜疫霉的抑菌率為83.00%，兩者試驗(yàn)結(jié)果較一致。細(xì)辛為常用傳統(tǒng)中藥，活性成分復(fù)雜，不僅具有廣泛的藥理作用，還具有抗農(nóng)業(yè)害蟲和抗植物霉菌病害等作用（韓俊艷等，2011）。本研究中細(xì)辛對(duì)荔枝霜疫霉具有較強(qiáng)的抑菌活性，其對(duì)荔枝霜疫霉的EC50為0.51 mg/mL，在5.000 mg/mL條件下，細(xì)辛對(duì)荔枝霜疫霉的抑菌率為100.00%，對(duì)荔枝霜疫霉孢子囊的萌發(fā)抑制率為57.65%。另外，本研究發(fā)現(xiàn)在5.000 mg/mL條件下，花椒乙醇提取物對(duì)荔枝霜疫霉孢子囊萌發(fā)的抑制作用較強(qiáng)，細(xì)辛和苦參乙醇提取物的抑制率較低，但所有供試植物乙醇提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌的抑制率均超過(guò)50.00%，顯示這5種植物乙醇提取物具有較高的抑菌活性。而乙醇提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌菌絲生長(zhǎng)和孢子囊萌發(fā)的抑制率無(wú)一致性，可能與抑菌物質(zhì)的作用位點(diǎn)和作用機(jī)理不同有關(guān)。

不同的抑菌物質(zhì)，由于其化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)不同而具有不同的性質(zhì)，當(dāng)不同物質(zhì)同時(shí)存在時(shí)，常因相互之間的作用和影響而使其性質(zhì)發(fā)生不同程度改變。由于植物提取物的復(fù)配活性和作用機(jī)理非常復(fù)雜，復(fù)配效果必然是各種活性成分相互間作用的綜合結(jié)果，因此，提取物的復(fù)配是否得當(dāng)，直接影響殺菌劑的藥效。含有丁香、苦參等乙醇提取物的殺菌復(fù)配劑具有較好的殺菌效果。韓相鵬等（2003）研究表明，苦參素與2%新科高濃縮殺蟲劑混合可有效控制黃芪根病危害；方哲等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，丁香與苦參提取液復(fù)配對(duì)人參銹腐病菌的孢子萌發(fā)有很強(qiáng)的抑制作用，對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)有抑制作用；焦鐳等（2011）進(jìn)行了15種中草藥及復(fù)配液的抑菌性和穩(wěn)定性研究，結(jié)果表明，復(fù)配液PW4（丁香、厚樸、苦參）、PW7（紫丹參、厚樸、苦參）和PW10（厚樸、苦參、迷迭香）是其中效果較好的配伍；在荔枝霜疫霉的防治研究中，賴毅東（2003）篩選出含有丁香的配液PW-6增效最佳，對(duì)荔枝霜疫霜的最小抑菌濃度（MIC）為3.125 mg/mL。本研究將5種植物乙醇提取物進(jìn)行復(fù)配，發(fā)現(xiàn)在1∶1（V/V）的配比下，苦參+花椒復(fù)配物對(duì)荔枝霜疫霉菌菌絲生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，表現(xiàn)為增效作用；丁香+黃柏、丁香+細(xì)辛和黃柏+細(xì)辛復(fù)配物表現(xiàn)為相加作用。因此，在抑菌復(fù)配劑配伍時(shí)，應(yīng)從降低復(fù)配抑菌劑成本和保護(hù)野生植物資源的角度考慮選擇適當(dāng)?shù)闹参锓N類，但本研究中有關(guān)乙醇提取物和復(fù)配物對(duì)荔枝霜疫霉菌的作用部位和代謝影響等機(jī)理尚有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

丁香、黃柏、細(xì)辛、苦參和花椒等5種植物的乙醇提取物對(duì)荔枝霜疫霉菌有較強(qiáng)的抑菌活性，苦參與花椒的乙醇提取物復(fù)配物對(duì)荔枝霜疫霉菌菌絲生長(zhǎng)具有抑制增效作用，丁香+黃柏、丁香+細(xì)辛和黃柏+細(xì)辛等乙醇提取物復(fù)配物具有相加作用。在抑菌復(fù)配劑配伍時(shí)，可從降低成本和保護(hù)野生植物資源角度考慮選擇適當(dāng)?shù)闹参锓N類。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）