高歡歡 葛溫伯 覃冬云 于毅

摘要：韭菜遲眼蕈蚊幼蟲又稱韭蛆，是韭菜等多種蔬菜上的主要害蟲，化學(xué)防治作為其主要的防治方法，造成嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留問題。為了明確枯草芽孢桿菌對韭菜遲眼蕈蚊的作用，進(jìn)一步尋找防治韭蛆的新方法，本研究利用枯草芽孢桿菌侵染不同蟲態(tài)的韭菜遲眼蕈蚊，觀察其生長發(fā)育情況以及韭蛆體內(nèi)代謝酶活性的變化。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌對韭菜遲眼蕈蚊卵孵化率、蛹羽化率及成蟲產(chǎn)卵量均無顯著影響，但韭蛆對其反應(yīng)較為敏感，存活率顯著下降。四齡幼蟲體內(nèi)代謝物質(zhì)檢測結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌侵染后，其體內(nèi)的海藻糖、蛋白質(zhì)含量及脂肪酶活性均無顯著變化；纖維素酶活性顯著提高；幾丁質(zhì)酶、a-淀粉酶、堿性磷酸酶的活性顯著或極顯著降低，這與韭蛆存活率下降和壽命縮短有一定相關(guān)性。因此，枯草芽孢桿菌可以通過調(diào)節(jié)韭蛆體內(nèi)部分代謝酶的活性來影響其生長發(fā)育，為韭蛆的防治提供新方法。

關(guān)鍵詞：韭菜遲眼蕈蚊；枯草芽孢桿菌；生長發(fā)育；代謝酶活性；防治方法

中圖分類號：S436.33

文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2016）02-0089-05

韭菜遲眼蕈蚊（BradVsia odoriphaga Yang etZhang）屬雙翅目、長角亞目、眼蕈蚊科、遲眼蕈蚊屬。其幼蟲又稱韭蛆，取食范圍十分廣泛，可為害百合科、菊科、藜科、十字花科、葫蘆科、傘形科等多種蔬菜，尤其是韭菜，致使其產(chǎn)量損失嚴(yán)重。韭蛆危害分布非常廣泛，全國各地均有發(fā)生，除中國以外，中東、歐洲、北美以及東亞其他地區(qū)也有發(fā)生。在韭蛆的防治方面，化學(xué)防治仍然是目前最有效的方法，但農(nóng)藥的持續(xù)使用已經(jīng)導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、土壤污染以及抗藥性等多種問題的產(chǎn)生，因此，低毒高效的綜合防治方法是防治韭蛆危害亟需解決的問題。

韭蛆具有鉆蛀性，韭菜根部受到危害后易腐爛，同時滋生大量微生物。高歡歡等從韭蛆體內(nèi)，韭菜鱗莖、根部及其周圍土壤中分離出25種微生物，其中枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis在韭蛆和韭菜體內(nèi)均有發(fā)現(xiàn)。枯草芽孢桿菌作為一種腸道微生物已在多種昆蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，其菌體在生長發(fā)育過程中產(chǎn)生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等多種活性物質(zhì)，對致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用。a-淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶是昆蟲體內(nèi)物質(zhì)代謝必不可少的酶；韭菜遲眼蕈蚊以取食韭菜為主，韭菜中纖維素的降解和利用離不開纖維素酶；幾丁質(zhì)酶作為蛻皮和變態(tài)過程中的重要酶類，在昆蟲的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用；堿性磷酸酯酶在生物體中直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝過程，是生物體內(nèi)一種重要的調(diào)控酶，對昆蟲的防御體系以及滯育時間有調(diào)控作用。

本研究通過枯草芽孢桿菌侵染，觀察韭菜遲眼蕈蚊生長發(fā)育的變化規(guī)律以及韭蛆體內(nèi)a-淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶和堿性磷酸酯酶活性的變化，從而明確枯草芽孢桿菌對韭菜遲眼蕈蚊生長發(fā)育和代謝活動的影響，為韭蛆的防治提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試蟲源 韭菜遲眼蕈蚊幼蟲飼養(yǎng)于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所實驗室，溫度為（25±1）℃，濕度為（70±5）%，光周期為16L：8D。取不同發(fā)育時期（卵、幼蟲、蛹和成蟲）的韭菜遲眼蕈蚊用于試驗。

1.1.2 試驗儀器與試劑 超凈工作臺（SW-Cj-ZFD，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；培養(yǎng)箱（RXZ-328A型，寧波江南儀器廠）；離心機(jī)（D-78532，德國Tuttlingen）；紫外分光光度計（EMax Plus微孔板讀板機(jī)，美國美谷分子）；搖床（HY-6A數(shù)顯調(diào)速多用振蕩器，常州榮冠實驗分析儀器廠）。

NB培養(yǎng)基，0.01% PBS緩沖液，2%瓊脂，BCA法蛋白含量測定試劑盒、脂肪酶活性試劑盒、海藻糖含量試劑盒、植物a-淀粉酶試劑盒、纖維素酶活性測定試劑盒、組織及血液堿性磷酸酶活性測定試劑盒、幾丁質(zhì)酶試劑盒均購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌活化枯草芽孢桿菌菌株保存于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物防治實驗室，在NB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，重新活化。挑取單菌落過夜搖菌，經(jīng)稀釋和紫外分光光度計測定后，取OD值為1的菌懸液用于試驗。

1.2.2 韭菜遲眼蕈蚊卵孵化率及韭蛆壽命試驗

在鋪有10mL瓊脂和兩層濾紙的培養(yǎng)皿中輕輕挑入100枚韭菜遲眼蕈蚊的卵，對照組用無菌PBS溶液浸泡卵30min，處理組用OD值為1的枯草芽孢桿菌懸浮液浸泡卵30min，每組10個重復(fù)。取同等大小的韭菜段用75%酒精消毒并用無菌PBS緩沖液沖洗后晾干，處理組經(jīng)菌液浸泡30s后置于相應(yīng)培養(yǎng)皿中，對照組以PBS緩沖液浸泡代替。處理后的卵放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察卵的孵化情況，孵化后記錄韭蛆的死亡數(shù)量，用于韭蛆壽命的觀察試驗。

1.2.3 二齡、三齡、四齡韭蛆存活率及體重試驗

分別取同日齡的韭蛆二齡、三齡和四齡幼蟲，用5%次氯酸鈉溶液消毒并清洗，針扎每個幼蟲的腹部末端（二齡幼蟲體型較小，未經(jīng)過針刺處理，以避免死亡率過大，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性），處理組用枯草芽孢桿菌懸浮液浸泡30min，對照組用PBS緩沖液代替。處理后用細(xì)毛筆輕輕挑人鋪有10mL瓊脂和兩層濾紙的培養(yǎng)瓶中，同時放人消毒處理過的韭菜段（處理方法同上），每組每個蟲齡均設(shè)10個重復(fù)，共60個培養(yǎng)瓶，每個培養(yǎng)瓶50頭幼蟲。處理后的韭蛆放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后觀察韭蛆死亡數(shù)量，將存活的韭蛆收集后稱重。四齡幼蟲保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)試驗。

1.2.4 蛹羽化率試驗蛹除無需針刺以外，其他處理方式與幼蟲相同，枯草芽孢桿菌處理組和對照組均設(shè)置10個重復(fù)，處理后的蛹放人培養(yǎng)箱中，每日觀察羽化情況直至所有的蛹羽化完成。

1.2.5 成蟲產(chǎn)卵量試驗分別取20對無菌狀態(tài)下飼養(yǎng)的成蟲置于鋪有10mL瓊脂和兩層濾紙的培養(yǎng)瓶中，同時放人消毒處理過的韭菜段（處理方法同上），每組10個重復(fù)。處理后的成蟲放人培養(yǎng)箱中，每日更換培養(yǎng)瓶，記錄培養(yǎng)瓶中卵的數(shù)量，直至成蟲死亡。

1.2.6 四齡韭蛆體內(nèi)蛋白質(zhì)、海藻糖含量及5種代謝酶活性的測定從-80℃冰箱中取出保存的四齡幼蟲，枯草芽孢桿菌處理組和對照組分別10個重復(fù)，根據(jù)試劑盒的說明書測定幼蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)和海藻糖的含量以及5種代謝酶的活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗所得數(shù)據(jù)均采用t檢驗方法進(jìn)行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)分析所用軟件為SPSS 17.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌對卵孵化率、韭蛆壽命、蛹羽化率和成蟲產(chǎn)卵量的影響

由表1可知，與對照相比，枯草芽孢桿菌處理的卵孵化率和蛹羽化率有所下降，成蟲產(chǎn)卵量上升，但差異均不顯著；而韭蛆壽命則受到枯草芽孢桿菌的顯著影響（F=4.75，P=0.04），與對照相比，明顯下降。說明枯草芽孢桿菌對韭菜遲眼蕈蚊卵、蛹和成蟲不會造成顯著影響，幼蟲階段則較為敏感。

2.2 枯草芽孢桿菌對韭蛆體重和存活率的影響

由表2可知，二齡幼蟲和四齡幼蟲平均體重在枯草芽孢桿菌侵染后變化不顯著，三齡幼蟲平均體重則極顯著下降（F=13.17，P=0.002）。

由圖1可知，二齡、三齡、四齡幼蟲存活率均受到枯草芽孢桿菌的顯著影響。其中二齡幼蟲（F=4.88，P=0.042）和四齡幼蟲（F=7.80，P=0.013）的存活率在枯草芽孢桿菌侵染后顯著下降。三齡幼蟲對照組和枯草芽孢桿菌處理組的存活率均較低，其中對照條件下的存活率為（61.11±6.07）%，處理組卻顯著上升到（77.11+2.63）%（F=5.86，P=0.028），由此，枯草芽孢桿菌降低了三齡韭蛆的平均體重并使其存活率有所上升，二齡和四齡幼蟲的平均體重雖沒有顯著變化，但存活率顯著下降。

2.3 枯草芽孢桿菌對四齡韭蛆體內(nèi)蛋白質(zhì)、海藻糖含量的影響

由表3可知，四齡韭蛆體內(nèi)蛋白質(zhì)和海藻糖含量在枯草芽孢桿菌侵染后均有所波動，其中蛋白質(zhì)含量降低，海藻糖含量升高，但差異均不顯著。因此，枯草芽孢桿菌對四齡幼蟲體內(nèi)的蛋白質(zhì)、海藻糖含量并沒有造成顯著影響。

2.4 枯草芽孢桿菌對四齡韭蛆體內(nèi)5種代謝酶活性的影響

由圖2可知，枯草芽孢桿菌對四齡幼蟲體內(nèi)的纖維素酶、a-淀粉酶、堿性磷酸酯酶、幾丁質(zhì)酶活性有顯著或極顯著影響。其中纖維素酶的活性在枯草芽孢桿菌侵染后顯著升高（F=18.63，P=0.012）；a-淀粉酶酶活性極顯著降低（F=13.97，P=0.007）；堿性磷酸酯酶受影響最大，與對照相比，酶活性降低了74.26%（F=23.78，P=0.005）；脂肪酶活性在受到枯草芽孢桿菌侵染后有所上升，但差異并不顯著（F=3.26，P=0.11）；而幾丁質(zhì)酶則受到枯草芽孢桿菌的顯著影響（F=7.30，P=0.036），活性顯著下降。由此，枯草芽孢桿菌的侵染沒有引起四齡幼蟲體內(nèi)脂肪酶活性的顯著變化，而幾丁質(zhì)酶作為蛻皮和變態(tài)過程中的重要酶類，活性顯著下降，這與韭蛆壽命的變化一致。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌對韭菜遲眼蕈蚊卵、蛹和成蟲均沒有顯著影響，這是因為韭菜遲眼蕈蚊的卵有卵殼包被作為保護(hù)層，而蛹時期表皮中幾丁質(zhì)含量高，有效阻止了外源物質(zhì)的侵染，因此韭菜遲眼蕈蚊在未孵化前以及進(jìn)入蛹期后很難進(jìn)行防治。進(jìn)入成蟲階段后，韭菜遲眼蕈蚊取食量非常小，壽命較短，取食外源物質(zhì)并不能顯著改變其產(chǎn)卵量。而枯草芽孢桿菌對韭蛆幼蟲的存活率和體重影響較為顯著，二齡和四齡幼蟲的存活率顯著下降，三齡幼蟲體重顯著下降，但存活率有所升高。這可能是因為三齡階段是韭蛆危害較為嚴(yán)重的時期，取食量大，代謝活性較強(qiáng)，對外界環(huán)境產(chǎn)生了一定耐受力，但其是否與枯草芽孢桿菌形成了協(xié)同進(jìn)化的關(guān)系則需要進(jìn)一步研究。

本研究選擇了發(fā)育歷期最長、代謝活動最為復(fù)雜的四齡幼蟲作為研究對象進(jìn)行代謝物質(zhì)和酶活性的檢測，結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌侵染后，韭蛆體內(nèi)蛋白質(zhì)和海藻糖含量以及脂肪酶的活性并沒有受到顯著影響，而纖維素酶的活性顯著提高。幾丁質(zhì)在昆蟲生長的每個階段都必須維持在一定水平內(nèi)，過多或缺失都將對昆蟲造成致命影響，參與糖類代謝的a-淀粉酶以及參與幾丁質(zhì)代謝的幾丁質(zhì)酶在枯草芽孢桿菌侵染后顯著降低，同時韭蛆的壽命縮短和存活率下降，說明枯草芽孢桿菌可以通過調(diào)節(jié)韭蛆體內(nèi)a-淀粉酶和幾丁質(zhì)酶的活性來影響其生長發(fā)育。另外，堿性磷酸酯酶作為一種具有抗逆作用的酶，在昆蟲受到外界刺激時會產(chǎn)生活性的變化，以維持體內(nèi)物質(zhì)代謝的平衡，枯草芽孢桿菌侵染后，韭蛆體內(nèi)堿性磷酸酯酶的活性降低幅度最大，達(dá)到74.26%，說明堿性磷酸酯酶對枯草芽孢桿菌反應(yīng)較為敏感。

在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，枯草芽孢桿菌目前主要應(yīng)用于病害的防治研究，在昆蟲防治方面應(yīng)用較少。本研究通過枯草芽孢桿菌對韭蛆的侵染，發(fā)現(xiàn)其改變了韭蛆體內(nèi)代謝酶的活性，進(jìn)而對韭蛆的生長發(fā)育產(chǎn)生了不利影響。但若單獨(dú)用枯草芽孢桿菌防治韭蛆，則效果有限，因此可以作為增效劑，結(jié)合其他防治方法共同防治韭蛆，其效用如何還需進(jìn)一步研究。