李 晴, 胡麗紅, 曲 波

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科,黑龍江 哈爾濱 150086

不同濃度DSS誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的比較

李 晴, 胡麗紅, 曲 波

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科,黑龍江 哈爾濱 150086

目的 對比研究不同濃度葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium, DSS)誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)模型，從不同角度監(jiān)測炎癥反應(yīng)程度，為實(shí)驗(yàn)造模提供理論數(shù)值，并選擇最佳的造模方案。方法 用BALB/C小鼠自由飲用DSS溶液的方法建立低濃度(3%)和高濃度(5%)模型組，正常對照組飲用蒸餾水，每組24只。分別于第0天、3天、7天對小鼠進(jìn)行動態(tài)觀察：疾病活動指數(shù)(disease activity index, DAI)、結(jié)腸組織病理學(xué)改變、血清中HGB、CRP、TNF-α的表達(dá)、結(jié)腸黏膜中MOP、SOD、NF-κB的表達(dá)及NF-κB核轉(zhuǎn)位情況、繪制小鼠生存曲線。結(jié)果 HGB、SOD與UC疾病活動程度呈負(fù)相關(guān)，CRP、TNF-α、MOP、NF-κB與UC疾病活動程度呈正相關(guān)，均表現(xiàn)出明顯的時間和劑量依賴性。結(jié)論 隨著造模濃度和時間的增加，小鼠模型UC的炎癥程度也逐漸加重，但死亡率也隨之增加，得出3% DSS溶液喂養(yǎng)7 d建立的UC小鼠模型為最佳。

葡聚糖硫酸鈉;小鼠;潰瘍性結(jié)腸炎;造模

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確的慢性非特異性腸道炎性病變，發(fā)病率在我國逐年上升,其發(fā)病機(jī)制并不明確，治療也缺乏特異性方法，成為近些年消化領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium, DSS)誘導(dǎo)的小鼠UC模型的腸道病變與人類UC腸道病理形態(tài)變化最為相近[1]，因此被廣泛應(yīng)用。目前較為常用的造模DSS溶液濃度為3%和5%[1-3]，部分研究[4-5]以疾病活動指數(shù)(disease activity index, DAI)對小鼠進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)DAI評分隨著DSS溶液濃度呈線性增加。本文將通過更全面的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測，并對與UC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的核因子-κB(nuclear factor，NF-κB)[6]在UC小鼠結(jié)腸黏膜中的表達(dá)及激活情況進(jìn)行比較，以便指導(dǎo)我們選擇更優(yōu)的方式建立UC小鼠模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：雄性BALB/C小鼠，體質(zhì)量25～30 g，常規(guī)喂養(yǎng)，由哈爾濱市附屬第二醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 主要試劑：DSS(M.W.=36 000～50 000，上海翊圣生物科技有限公司)；MPO測定試劑盒、SOD測定試劑盒、ELISA試劑盒(北京義翹神州生物科技有限公司)；EMSA試劑PIERCE公司；其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 分組 72只BALB/C小鼠隨機(jī)分為正常對照(蒸餾水)組、低濃度(3%)組和高濃度(5%)組，每組24只，各組內(nèi)又隨機(jī)分為0 d、3 d、7 d 3個小組(8只/組)。

1.3 實(shí)驗(yàn)觀察

1.3.1 一般狀態(tài)：動態(tài)觀察小鼠體質(zhì)量、大便性狀及便血情況，根據(jù)表1進(jìn)行DAI評分[7]，并分別于第0天、3天、7天3個時間點(diǎn)對小鼠進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測。

表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)

Tab 1 Scoring of DAI

計(jì)分體質(zhì)量下降(%)大便性狀血便0無正常陰性11～5——26～10半稀便潛血310～15——4>15稀便肉眼血便

注：正常大便為干燥成形且呈小粒狀，半稀便為糊狀但不黏肛門，稀便為液體狀且黏肛門。

1.3.2 血液化驗(yàn)：摘眼球取血，將血液靜置離心(3 500 r/min)10 min，取血清，分裝后置-20 ℃冰箱保存，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，一部分統(tǒng)一于相關(guān)實(shí)驗(yàn)室測定血紅蛋白(hemoglobin, HGB)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)含量。

1.3.3 TNF-α檢測：另一部分靜脈血應(yīng)用ELISA法嚴(yán)格按照試劑盒說明書統(tǒng)一測定腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)的表達(dá)，以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由坐標(biāo)曲線查出相應(yīng)的濃度，然后乘以稀釋倍數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

1.3.4 MPO與SOD的活性測定：處死小鼠后取結(jié)腸標(biāo)本，第一部分以4.0%多聚甲醛固定，石蠟包埋后行4 μm厚度切片，HE染色光鏡下觀察組織病理學(xué)形態(tài)；第二部分用以測定髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的活性，冰1×PBS沖洗，凍存于液氮中，測定時從液氮中取出結(jié)腸組織，稱重，剪碎，以冰生理鹽水作勻漿介質(zhì)，玻璃勻漿器冰上勻漿成10%勻漿液，其他操作步驟根據(jù)試劑盒要求，做相應(yīng)處理后測定吸光度，計(jì)算相應(yīng)的MOP、SOD活性。

1.3.5 NF-κB的表達(dá)：組織以免疫組化方法測定NF-κB的表達(dá)，顯微鏡下，細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞為NF-κB P65陽性細(xì)胞，在40倍高倍鏡下選取典型視野計(jì)數(shù)1 000個細(xì)胞，其中陽性細(xì)胞數(shù)作為NF-κB P65計(jì)數(shù)值，并以百分率表示。

1.3.6 NF-κB的活化情況：檢測NF-κB核轉(zhuǎn)位情況，采用EMSA方法，活化的DNA結(jié)合蛋白可與特定序列的DNA探針結(jié)合形成DNA-蛋白復(fù)合物而使其電泳遷移率顯著減慢，于是在膠片或成像系統(tǒng)上出現(xiàn)較游離條帶滯后的新條帶，根據(jù)滯后條帶的強(qiáng)弱對樣品中的DNA結(jié)合蛋白(NF-κB)活性進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 正常對照組小鼠生長良好，無明顯變化；低濃度組第3天出現(xiàn)半稀便，便潛血陽性，此后逐漸出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、稀便、肉眼血便；高濃度組第2天即出現(xiàn)便血，體質(zhì)量減輕明顯(見表2)。此外，低濃度組3 d小鼠無死亡，高濃度組3 d小鼠死亡1只；低濃度組7 d小鼠死亡1只，高濃度組7 d小鼠死亡3只，高濃度組小鼠生存率明顯低于低濃度組(見圖1)。

表2 各模型組DAI值比較

Tab 2 Comparison of DAI value in each model group

分組DAI評分F值P值3d低濃度組2．38±0．521100．68<0．053d高濃度組4．29±0．497d低濃度組11．29±0．497d高濃度組11．40±0．89

圖1 小鼠生存曲線

2.2 病理形態(tài)學(xué)觀察 正常對照組小鼠結(jié)腸未見明顯病理改變。隨著DSS濃度及實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增加，可見炎性細(xì)胞浸潤的程度隨之增加，逐漸出現(xiàn)結(jié)締組織壞死，黏膜上皮細(xì)胞隨之壞死脫落(見圖2)。

2.3 血液指標(biāo)檢測結(jié)果 血液中HGB的表達(dá)與UC疾病活動程度呈負(fù)相關(guān)(F=434.05,P<0.0001)，CRP的表達(dá)與UC疾病活動程度呈正相關(guān)(F=308.01,P<0.0001,見表3)。

圖2 病理形態(tài)學(xué)觀察 A: 3 d正常對照組(HE 100×); B: 7 d正常對照組(HE 200×); C: 3 d低濃度組 (HE 200×); D:3 d高濃度組 (HE 200×); E: 7 d低濃度組 (HE 200×); F: 7 d高濃度組 (HE 200×)

Fig 2 Observation of pathomorphology A: normal control of 3 days (HE 100×); B: normal control of 7 days (HE 200×); C: low concentration of 3 days (HE 200×); D: high concentration of 3 days (HE 200×); E: low concentration of 7 days (HE 200×); F: high concentration of 7 days (HE 200×)

2.4 TNF-α在UC模型中的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)中隨著DSS溶液濃度及實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增加，TNF-α的表達(dá)與UC炎癥程度呈正相關(guān)(F=3655.50,P<0.0001,見表4)。

分組HGBF值P值CRPF值P值對照組0d161．88±6．31434．05<0．00010．93±0．10308．01<0．00013d163．38±3．290．84±0．077d161．88±6．310．93±0．10低濃度組0d161．50±6．190．86±0．043d140．63±3．621．41±0．047d73．29±4．921．85±0．05高濃度組0d162．13±5．380．91±0．103d106．86±4．261．71±0．047d60．00±3．542．09±0．06

分組TNF?αF值P值對照組3655．50<0．00010d35．25±1．583d35．88±1．257d35．75±1．39低濃度組0d36．25±3．853d84．00±2．007d134．14±2．12

續(xù)表4

分組TNF?αF值P值高濃度組0d36．25±1．393d104．00±1．417d155．00±1．87

2.5 MPO與SOD的活性測定 MPO與UC疾病活動呈正相關(guān)，SOD與UC病情活動程度呈負(fù)相關(guān)(見表5)。

2.6 NF-κB的表達(dá)情況 正常對照組、0 d低濃度、高濃度組幾乎無NF-κB的表達(dá)；3 d、7 d高濃度組的表達(dá)明顯高于低濃度組；而無論低濃度組還是高濃度組，7 d較3 d濃度組的表達(dá)均升高(見表6、圖2)。

分組MOPF值P值SODF值P值對照組0d0．23±0．042085．04<．000180．86±6．6393．93<．00013d0．22±0．0381．38±4．037d0．23±0．0480．88±6．62低濃度組0d0．22±0．0282．00±5．103d0．68±0．0262．38±2．337d1．23±0．0345．86±3．48高濃度組0d0．22±0．0280．38±6．783d0．88±0．0351．86±2．127d1．62±0．0332．60±4．16

2.7 NF-κB核轉(zhuǎn)位情況 通過EMSA方法分析，形成的新條帶由強(qiáng)到弱的順序分別為7 d高濃度組、7 d低濃度組、3 d高濃度組、3 d低濃度組(見圖3)。

3 討論

由于UC的病因不夠明確，治療上也缺乏特異性的藥物，對UC患者造成相當(dāng)大的困擾，世界衛(wèi)生組織將其列為難治性疾病之一。因此選擇合適濃度的DSS溶液建立更為標(biāo)準(zhǔn)的UC小鼠模型，對今后UC發(fā)病機(jī)制的研究及新藥物的開發(fā)顯得尤為重要。

分組NF?κBF值P值對照組1109．95<0．00010d1．43±0．173d1．35±0．147d1．35±0．18低濃度組0d1．45±0．143d3．20±0．157d5．09±0．16高濃度組0d1．35±0．183d4．66±0．107d6．32±0．11

圖3 NF-κB的病理表達(dá)(免疫組化400×) A: 3 d正常對照組; B: 7 d正常對照組; C: 3 d低濃度組; D: 3 d高濃度組; E: 7 d低濃度組; F: 7 d高濃度組

Fig 3 Expression of NF-κB (IHC 400×) A: normal control of 3 days; B: normal control 7 days; C: low concentration of 3 days; D: high concentration of 3 days; E: low concentration of 7 days; F: high concentration of 7 days

圖3 EMSA法檢測NF-κB核轉(zhuǎn)位情況 CK: 競爭抑制; SM3: 3 d低濃度組; HM3: 3 d高濃度組; SM7: 7 d低濃度組; HM7: 7 d高濃度組; 100: 陰性對照組

Fig 3 The nuclear translocation of NF-κB with EMSA CK: competitive inhibition；SM3: low concentration of 3 days; HM3: high concentration of 3 days; SM7: low concentration of 7 days; HM7: high concentration of 7 days; 100: negative control

目前建立UC模型的化學(xué)方法有很多種，例如乙酸造模法、角叉菜膠造模法、DSS造模法、NaOONO2造模法、TNBS造模法、DNCB造模法等，但每種造模方法都不盡如人意，通常存在操作復(fù)雜、造模成功后自愈性強(qiáng)、成本高等缺點(diǎn)，但近年DSS造模法應(yīng)用最廣泛，因其模型臨床癥狀、病理表現(xiàn)、疾病預(yù)后轉(zhuǎn)歸與人UC最為相似[1]。

本研究實(shí)驗(yàn)初期(0 d)，我們對每一組檢測指標(biāo)均進(jìn)行了相關(guān)性分析(P>0.05)，從而保證了實(shí)驗(yàn)基線水平的一致性；同樣對3 d、7 d的檢測指標(biāo)也進(jìn)行了相關(guān)性分析，各檢測指標(biāo)的相關(guān)性都很強(qiáng)(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，我們應(yīng)用3×3析因設(shè)計(jì)檢測各指標(biāo)給藥時間和給藥濃度的主效應(yīng)和交互效應(yīng)(P<0.05)，可以認(rèn)為不同給藥時機(jī)、不同給藥濃度對UC小鼠模型都有影響，在一定范圍內(nèi)，給藥時間越長UC小鼠模型越好，給藥濃度越高UC小鼠模型越好。最后在總體有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基礎(chǔ)上對各個檢測指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

NF-κB是一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，參與許多疾病的發(fā)病機(jī)制[8-10]。正常狀態(tài)下，NF-κB家族成員通常以二聚體形式與其抑制蛋白IκB形成復(fù)合物，以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。在各種活化因素的作用下，IκB蛋白激酶IKK活化，IκB被磷酸化并通過26S蛋白酶體順序降解，與NF-κB解離，NF-κB活化進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),其DNA結(jié)合位點(diǎn)暴露，與DNA啟動子上特定的認(rèn)知序列結(jié)合,調(diào)控NF-κB反應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)錄。在UC中，活化的NF-κB可調(diào)節(jié)與UC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的促炎性細(xì)胞因子，如TNF-α等的產(chǎn)生和釋放，加重腸道的炎性反應(yīng)[6,11]。由此提示NF-κB的激活在UC免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。在以往的實(shí)驗(yàn)中[12-13]已經(jīng)得到證實(shí)，隨著UC動物模型炎癥程度的增加，腸組織中NF-κB的表達(dá)隨之增強(qiáng)，核轉(zhuǎn)位隨之活躍，本實(shí)驗(yàn)也得出了一致的結(jié)論。

從整體實(shí)驗(yàn)中可以看出藥物濃度高、給藥時間長的UC模型各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的變化與UC炎癥變化更為接近，但是動物模型的建立是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，需綜合考慮模型的死亡率，因此結(jié)合小鼠生存曲線，本實(shí)驗(yàn)得出3%DSS溶液喂養(yǎng)7 d建立的UC小鼠模型為最佳。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Comparison of different concentrations of DSS induced a mouse model of ulcerative colitis

LI Qing, HU Lihong, QU Bo

Department of Gastroenterology, the 2nd Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, China

Objective To compare the mice ulcerative colitis (UC) model induced by different concentrations of dextran sulfate sodium (DSS), to monitore the degree of inflammation from different angles, and to choose the best modeling program. Methods The BALB/C mice were fed with 3% and 5% DSS solution to induce low concentration and high concentration colitis, the control group was only fed with distilled water, 24 mice in each group. The mice were observed dynamically at the 0, 3rd and 7th days: disease activity index (DAI), the histopathological changes of colon, the expression of HGB, CRP, TNF-α in serum, the contents of MOP, SOD, NF-κB in colonic mucosa and the nuclear translocation of NF-κB. Survival curves of mice were drawn. Results HGB, SOD levels were negatively associated with disease activity of UC, CRP, TNF-α, MOP and NF-κB levels were positively associated with disease activity of UC, they all showed a significant dose-dependent and time. Conclusion With the degree of inflammation in murine models modeling concentration and time of UC has gradually increased, but the mortality rate also increased, that the UC model fed 7 days with the concentration of 3%DSS is the best.

Dextran sulfate sodium; Mice; Ulcerative colitis; Modeling

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.10.008

黑龍江省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題(2014-332)

李晴，在讀碩士研究生，研究方向：潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制的研究。E-mail:1206105474@qq.com

曲波，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：內(nèi)鏡下的診斷與治療。E-mail:qubo-1970@hotmail.com

R574.62

A

1006-5709(2016)10-1106-05

2016-03-02