李 琴，胥 明，盧水蓉，孫欽娟，周衛(wèi)寧

上海市同濟大學附屬東方醫(yī)院消化內科，上海 200123

潰瘍性結腸炎誘發(fā)結腸癌小鼠模型中RegⅣ的表達及預測價值

李 琴，胥 明，盧水蓉，孫欽娟，周衛(wèi)寧

上海市同濟大學附屬東方醫(yī)院消化內科，上海 200123

目的 通過檢測再生基因Ⅳ(Regenerating gene Ⅳ,Reg Ⅳ)和Ki67在潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)誘發(fā)結腸癌小鼠模型中的表達，探討Reg Ⅳ對UC誘發(fā)結腸癌早期診斷、判斷預后的價值。方法 60只BALB/c小鼠分為正常對照組、模型組，采用偶氮氧甲烷(Azoxymethane, AOM)聯(lián)合葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulfate sodium, DSS)的方法建立UC癌變的小鼠模型，HE染色觀察小鼠結腸組織病理變化，采用免疫組化檢測不同時期腸道組織中Ki67和Reg Ⅳ蛋白的表達，實時熒光定量PCR檢測此兩項指標mRNA的表達。結果 癌變組小鼠結腸黏膜中Ki67的表達水平較其他組明顯升高(P<0.05)，輕-中度不典型增生組Reg Ⅳ的表達水平較癌變組明顯升高(P<0.05)，免疫組化法統(tǒng)計學結果與RT-PCR一致。結論 RegIV在腸黏膜癌變過程中表達過量可能先于Ki67，提示Reg Ⅳ可作為預測 UC誘發(fā)結腸癌的良好分子標志物。

再生基因Ⅳ；Ki67；潰瘍性結腸炎；結腸癌；小鼠模型

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性反復發(fā)作的非特異性結腸炎，近年來發(fā)病率呈升高趨勢，隨著病程的延長，常發(fā)生不同程度的不典型增生，較易轉化為癌組織。再生基因Ⅳ(Regenerating islet-derived family member 4, RegⅣ)屬于鈣依賴性凝集素超家族成員之一,選擇性表達于胃腸道，炎癥或腫瘤發(fā)生時其表達明顯增加。Ki67是評估細胞增殖動力學的有效指標，表達比率高即細胞增殖能力強。因此，我們通過檢測各期Ki67的表達水平，以區(qū)分不同增殖能力的樣本，并采用免疫組化和RT-PCR方法檢驗RegⅣ在不同樣本中的表達情況，以揭示其與UC癌變演進的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雌性BALB/c小鼠60只，7～8周齡，體質量18.5～22.5g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK(滬)2007-0003]。葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulfate sodium, DSS)(MP公司，分子量3.6～5萬Da)，偶氮氧甲烷(Azoxymethane, AOM)(Sigma公司)，鼠抗人RegⅣ單克隆抗體購自美國sanata公司，PowerVisionTM即用型二步法小鼠免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒購自南京塞泓瑞生物技術有限公司。Trizol-reagent、RT-reagent逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量試劑均購自大連TaKaRa公司。PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。LC480 Real Time PCR擴增儀購自美國羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 UC癌變小鼠模型的建立[1]：60只BALB/c小鼠隨機分為對照組(15只)和模型組(45只)。對照組第1天予以0.9%生理鹽水10 mg/kg腹腔注射，普通飲水9周。模型組第1天予AOM 10 mg/kg腹腔注射，繼續(xù)自由飲用4%DSS 1周，再普通飲水2周，飲用DSS及普通水重復3個循環(huán)。模型組自實驗開始每3周處死15只小鼠，第9周末兩組小鼠全部處死。最初購買75只小鼠，建模過程中死亡及剔除15只，取回盲部至直腸全部腸段，放大鏡下觀察后，截取潰瘍或糜爛最明顯處，沿縱軸切開，置于10%甲醛固定中待測，其余凍存于-80 ℃冰箱待測。

1.2.2 HE染色：將小鼠結腸組織經(jīng)甲醛固定24 h后取出，予以蒸餾水沖洗后脫水、石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色，封片，光鏡下觀察病理情況。

1.2.3 免疫組織化學法：對照組和模型組均進行免疫組化SABC染色檢測，操作步驟嚴格按照免疫組化試劑盒說明書進行。由2名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師獨立讀片，取平均值作為最終評分。結果評判采用半定量積分法，每組8個組織點陣，每個點陣連續(xù)觀察3個高倍鏡視野。每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞，計算陽性細胞百分數(shù)并賦值，≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥75%為4分；觀察著色強度并賦值，無著色為0分，淺黃著色為1分，黃色為2分，棕黃著色為3分。兩值相乘為最終結果，0～3分為陰性，4～12分為陽性。

1.2.4 實時熒光定量PCR(RT-PCR)：參照Trizol試劑盒說明書提取小鼠結腸組織總mRNA；逆轉錄試劑盒合成cDNA，利用熒光定量PCR試劑盒檢測各標本中的Ki67和 RegⅣmRNA 表達水平，內參基因為 GAPDH?；蛐蛄性O計由上海生工合成引物。分別是：Ki67上游：5′-AAAGTGCCCAAGCCATAGA-3′，Ki67下游：5′-ACACCATTTGCCAGTTCCTC-3′，RegⅣ上游：

5′-CTGAAGCTAACAGGGGCGAG-3′，RegⅣ下游:5′-TGCAAATCTGCAAGACCTCC-3′。RT-PCR操作步驟嚴格按照TaKaRa公司試劑盒說明書進行。熒光定量 PCR 結果分析：基因的相對定量通過2-△△CT表示，其中△△CT=△CT實驗組-△CT對照組；而△CT=△CT目的基因-△CT內參。3個指標均以正常對照組中最大值作為分界點判斷陽性。

2 結果

2.1 HE染色觀察各組不典型增生的情況 第3周末病理表現(xiàn)為急性腸炎，第6周末多呈輕-中度不典型增生改變，第9周末實驗組小鼠均有腫瘤形成，成瘤率高，且病理類型為重度不典型增生或原位癌。小鼠結腸標本常規(guī)固定包埋切片、HE染色后觀察，UC的確立標準包括：炎細胞浸潤、腺體缺失、隱窩膿腫、黏膜潰瘍及纖維化。不典型增生分為輕、中及重度不典型增生，癌分為原位癌和進展期癌。

2.2 Ki67和RegⅣ蛋白在不同病變結腸組織中的表達情況 Ki67蛋白癌變組與正常組、UC組和輕-中度不典型增生組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=7.5、22.5、52.5，P<0.05)。

RegⅣ蛋白：輕-中度不典型增生組與正常組、UC組、癌變組的表達差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=30.0、40.0、60.0，P<0.05)，其余各組之間差異無統(tǒng)計學意義。輕-中度不典型增生組表達明顯高于癌變組。

2.3 Ki67和RegⅣ mRNA在不同病變結腸組織中的表達情況 RT-PCR檢測結果：Ki67分別在正常組、對照組的第3周末(UC組)、第6周末(輕-中度不典型增生組)、第9周末(癌變組)的表達水平漸進性升高,第9周末與其余各組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F=28.55、9.24、6.58，P<0.05)。在以上4組中，RegⅣ在第6周末組中表達最高，其高于第9周末中的表達，第6周末組與其余3組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F=4.925、5.859、7.091，P<0.05)。

圖1 免疫組化檢測Ki-67(400×)； 圖2 免疫組化檢測RegⅣ(400×) A：正常對照組；B：UC組；C：癌變組

Fig 1 Ki-67 detected by immunohistochemical (400×); Fig 2 RegⅣ detected by immunohistochemical (400×) A: control group; B: UC group; C: cancerous group

表1 Ki67和RegIV蛋白在不同階段腸黏膜中的表達情況[例數(shù)(%)]

Tab 1 The expressions of Ki67 and Reg Ⅳ protein in the intestinal mucosa in different stages [n(%)]

組別例數(shù)Ki67RegIV正常對照組150．862±0．1051．292±0．237UC組151．560±0．0663．167±0．210輕-中度不典型增生組152．370±0．0736．601±0．468癌變組155．250±0．1274．221±0．204

3 討論

UC是一種慢性非特異性腸炎，近10年來在我國發(fā)病率呈上升趨勢。UC患者并發(fā)結腸癌的風險與病程呈正比，患病10年結直腸癌的發(fā)生率為2%，20年為8%，30年以上達18%[2]。癌變在炎癥性腸病患者致死病因中占10%～15%，對癌變的監(jiān)測成為了突出問題。因此,探索UC癌變的發(fā)病機制，尋找UC癌變的早期腫瘤標志物及新的治療靶標，成為研究熱點之一。

腫瘤的發(fā)生和演變是一個錯綜復雜的生物學過程，涉及癌基因突變活化、抑癌基因表達失調、凋亡調節(jié)紊亂等諸多改變。Ki67基因位于人類染色體10q25上，由分子量為345 kD和395 kD的兩條多肽鏈組成，其功能與細胞的有絲分裂有關。它表達于除G0期外的其他所有細胞周期中，其表達高低反映細胞增殖的程度，是判斷預后的有效指標之一[3]。鑒于檢測Ki67是評估結腸癌細胞增殖狀態(tài)的簡便方法，我們選取它作為UC癌變的參考對照，通過UC癌變過程中結腸組織表達Reg Ⅳ與Ki-67的分析比較，為尋找UC誘發(fā)結腸癌早期預防、早期診斷及評估轉歸和預后的生物標記建立基礎。

2001年Hartupee等[4]首次對炎癥性腸病庫的高流通量序列分析時篩選出RegⅣ，歸為鈣依賴凝素超家族成員。Reg Ⅳ定位于1p12-13.1，包含5個內含子和6個外顯子。翻譯出的前蛋白產(chǎn)物分子量為17 kD，由158個氨基酸組成, 包含22個氨基酸的信號肽和1個保守的鈣依賴性糖識別域(calcium-dependent carbohydrate-recognition domain, CRD),與其他Reg蛋白有43%～47%的同源性。Reg Ⅳ蛋白選擇性表達于正常胰腺、小腸上皮神經(jīng)內分泌細胞和胃黏膜的壁細胞中[5-7]。賴明廣等[8-9]報道，UC患者腸黏膜的腺管上皮和杯狀上皮細胞中Reg Ⅳ的表達顯著增加，可作為預測疾病活動度的一個獨立指標。

RegⅣ可能在結腸的癌前病變中發(fā)揮促進作用，但對于RegⅣ與UC癌變發(fā)生、發(fā)展的研究處于起步階段，確切的分子機制尚未明確。據(jù)Bishnupuri等[10-11]報道，將重組的人RegⅣ基因轉染至結腸腺癌細胞系HT29和HCT116后，癌細胞數(shù)目呈劑量依賴性增長，并引發(fā)了Akt蛋白的絲氨酸、蘇氨酸和表皮生長因子受體酪氨酸的快速磷酸化。采用熒光素酶基因檢測發(fā)現(xiàn)，RegⅣ可以通過Akt蛋白和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)介導的信號通路增強活化蛋白-1(AP-1)轉錄因子的活性,AP-1則通過下游靶基因的表達參與細胞基質的降解、腫瘤新生血管等環(huán)節(jié)。另外,抗凋亡基因(Bcl-2、 Bcl-XL、存活素和基質溶解因子等)表達量顯著升高，提示預后不良。由此研究者推斷, 在結腸組織癌變進程中RegⅣ可以通過增加Bcl-2、Bcl-XL、存活素等的表達水平激活EGFR/Akt/AP-1信號通路，從而提高了癌細胞的存活率。

本研究著眼于UC癌變不同階段的組別中統(tǒng)計Ki67和RegⅣ的表達情況，Ki67在正常組、對照組的第3周末(UC組)、第6周末(輕-中度不典型增生組)、第9周末(癌變組)的表達水平逐步升高,差異具有統(tǒng)計學意義，反映了小鼠模型UC癌變過程中細胞增殖狀態(tài)的變化。同時發(fā)現(xiàn)與Ki67隨著時間推移漸進性升高不同， RegⅣ在輕-中度不典型增生組中表達最高,且表達水平與其他各組有顯著性差異(P<0.05)，提示RegⅣ在腸黏膜癌變的過程中表達過量可能先于Ki67，免疫組化法統(tǒng)計學結果與RT-PCR一致。由此推斷，Reg Ⅳ是一個提示癌變風險較大的早期生物學指標。在病程較長和炎癥活動頻發(fā)的UC高危人群中，早期監(jiān)測結腸黏膜RegⅣ表達意義重大，可作為臨床判斷結腸癌生物學行為的一項重要指標，但其作用機制還有待進一步探討。

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Expression and predictive value of RegⅣ in colon cancer mice model induced by ulcerative colitis

LI Qin, XU Ming, LU Shuirong, Sun Qinjuan, ZHOU Weining

Department of Gastroenterology, Dongfang Hospital, Tongji University, Shanghai 200123, China

Objective To evaluate the early diagnostic and predictive value of Regenerating gene Ⅳ (Reg Ⅳ) in ulcerative colitis (UC) cancerization by detecting Reg Ⅳ and Ki67 in UC cancerization mice model.Methods Sixty mice were divided into the experimental group and the control group in the study. UC cancerization mice model was set up byazoxymethane combined with dextran sulfate sodium.Colon tissue pathological changes were observed by HE dyeing. Gene expression was investigated by immunohistochemistry.mRNA expression was investigated by reversetranscription-PCR.Results Ki67 expression in colonic mucosa of colon cancer group mice was obviously higher than other groups (P<0.05).Reg Ⅳ expression in light to moderate dysplasia group was apparently higher than that in the cancerous group (P<0.05). Statistical results of immunohisto-chemical were consistent with RT-PCR.Conclusion The high expression of Reg Ⅳ may precede Ki67 in cancerous process of intestinal mucosal.Reg Ⅳ level is a good cancer molecular marker for predicting the cancerization in UC patients.

Regenerating gene Ⅳ; Ki67; Ulcerative colitis; Colon cancer; Mice model

李琴，主治醫(yī)師，碩士，研究方向：炎癥性腸病的發(fā)病機制。E-mail：xybd@sh163.net

胥明，副主任醫(yī)師，博士，研究方向：炎癥性腸病的發(fā)病機制。E-mail：jessiegod@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.10.010

R574.62

A

1006-5709(2016)10-1116-04

2016-09-04