張夏璐，李冶夫，周 平

1.北京空軍總醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100142； 2. 哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，美國(guó)馬薩諸塞州波士頓

腸道炎癥在早期骨關(guān)節(jié)炎模型小鼠中的表現(xiàn)

張夏璐1,2，李冶夫2，周 平1

1.北京空軍總醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100142； 2. 哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，美國(guó)馬薩諸塞州波士頓

目的 研究小鼠早期骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)與腸道炎癥的關(guān)系，為炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)相關(guān)的OA的治療提供新的思路。方法 使用Ⅸ型膠原蛋白部分缺失的自發(fā)性O(shè)A模型小鼠?；蛐头中秃?，將cho/+小鼠作為實(shí)驗(yàn)組，其同窩出生的野生型+/+小鼠作為對(duì)照組。使用零假設(shè)理論，假設(shè)“小鼠早期OA與腸道炎癥病變的發(fā)生無(wú)關(guān)”，在小鼠3個(gè)月大時(shí)參考疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)的內(nèi)容對(duì)其進(jìn)行臨床表現(xiàn)方面的觀察；收集腸道組織，參考結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(CMDI)進(jìn)行大體病理學(xué)觀察，并將腸道標(biāo)本進(jìn)行組織病理學(xué)處理后，進(jìn)行鏡下觀察。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在臨床表現(xiàn)和組織病理學(xué)方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 接受零假設(shè)，即小鼠OA在早期與腸道炎癥的發(fā)生無(wú)關(guān)，也證明早期OA不會(huì)誘發(fā)IBD的發(fā)生。

炎癥性腸?。粷冃越Y(jié)腸炎；克羅恩??；骨關(guān)節(jié)炎；零假設(shè)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種以腸道嚴(yán)重的炎癥及黏膜破壞為特征的慢性復(fù)發(fā)性疾病，包括克羅恩病(Crohn’s disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)，目前尚無(wú)明確病因。IBD有多種臨床表現(xiàn)，包括消化道癥狀、全身癥狀及腸外表現(xiàn)(extraintestinal manifestations，EIMs)?，F(xiàn)已報(bào)道的EIMs的發(fā)病率范圍為6%～47%[1]，其中骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)發(fā)病率最高，在成人IBD患者中達(dá)到40%[1]，在兒童IBD患者中為25%[2]。OA雖病因不明，但因軟骨和骨骼的破壞最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和功能喪失等臨床表現(xiàn)[3]，給患者的日常生活帶來(lái)很多痛苦，也增加了IBD治療的復(fù)雜性?，F(xiàn)階段，EIMs的發(fā)病機(jī)理尚不完全清楚，但有研究表明細(xì)菌可以通過(guò)胃腸道黏膜引發(fā)腸道外部位的免疫反應(yīng)[4-5]。但尚無(wú)明確的研究表明IBD的EIMs，如OA是否可引發(fā)IBD或加重IBD的病情。

2003年，Xu等[6-7]對(duì)軟骨發(fā)育不全(chondrodysplasia，cho)小鼠(即基因編碼Ⅸ型膠原的α1鏈(Col11a1)時(shí)發(fā)生功能缺失性突變)進(jìn)行報(bào)道，證實(shí)其雜合子小鼠(cho/+)出現(xiàn)OA病變；與雜合子小鼠同窩的純合子小鼠(cho/cho)出生即死亡；野生型小鼠(+/+)作為對(duì)照組，最后證實(shí)不出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨退化等OA特征。同時(shí)，Xu等[7]在文章中指出，從3個(gè)月開(kāi)始，雜合子小鼠即在膝關(guān)節(jié)及下頜骨關(guān)節(jié)表現(xiàn)出OA的特征改變。

在本次研究中，我們選擇上述OA小鼠模型，觀察其臨床癥狀，并對(duì)腸道組織進(jìn)行組織病理學(xué)研究，在零假設(shè)的理論基礎(chǔ)上，對(duì)OA小鼠模型進(jìn)行腸道炎癥表現(xiàn)的探索。

1 材料與方法

1.1 材料 根據(jù)前文所述軟骨發(fā)育不全小鼠的基因特點(diǎn)[6]，選擇雜合子cho/+小鼠和野生型+/+小鼠進(jìn)行研究。所有小鼠均在哈佛醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行交配和飼養(yǎng)，室溫為恒溫25 ℃，保持12 h燈光照明及12 h黑暗，小鼠自由進(jìn)食顆粒飼料及自來(lái)水。所有方案均符合哈佛醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)(Institutional Animal Care and Use Committees，IACUC)的要求。

1.2 方法

1.2.1 基因型分型：在小鼠生長(zhǎng)到3周時(shí)通過(guò)打耳洞的方式對(duì)其進(jìn)行編號(hào)，同時(shí)剪取一段長(zhǎng)約3 mm的尾巴并從中提取DNA。隨后進(jìn)行PCR，獲得含有528個(gè)堿基對(duì)的DNA片段。在PCR中所使用的正向引物為：5′-GGTGTTGTCCTGGGTAAACAG-3′；反向引物為：5′-GCAGTCACCATTGTCTAATCATC-3′。將PCR產(chǎn)物根據(jù)QIAGEN試劑盒法純化后，進(jìn)行DNA測(cè)序，所使用引物為：5′-AGCTAAGCCACTGAGGCACAA-3′。最后根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行基因型分型。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：在已明確基因型分型的小鼠中隨機(jī)抽取3個(gè)月大的4只cho/+小鼠作為實(shí)驗(yàn)組，4只野生型+/+小鼠為對(duì)照組，且每組為2只雌鼠和2只雄鼠。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 臨床癥狀觀察：觀察其精神狀態(tài)，進(jìn)食、活動(dòng)及皮毛狀況，并參考疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)中的觀察指標(biāo)：體質(zhì)量、大便性狀[8]。具體于實(shí)驗(yàn)終止期前1周每日觀察其精神、進(jìn)食情況及大便性狀等，并于終止期進(jìn)行體質(zhì)量測(cè)量。

1.3.2 大體病理學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)終止期收集腸道組織:末端回腸、結(jié)腸、直腸[9-10]。此參考結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(colonic mucosa damage index，CMDI)對(duì)結(jié)腸組織進(jìn)行肉眼觀察，包括腸道有無(wú)粘連，有無(wú)充血、潰瘍或腸壁增厚等[11]。

1.3.3 組織病理學(xué)觀察：將腸道標(biāo)本進(jìn)行組織固定、乙醇梯度脫水及石蠟包埋。為更全面地觀察組織病理變化，我們將每一個(gè)腸道組織進(jìn)行橫切面及縱切面兩種包埋方式。組織切片時(shí)，每個(gè)蠟塊均做組織最大切面的多個(gè)連續(xù)切片(10～14片)，每一個(gè)切片厚度為6 μm。HE染色后，采用雙盲法在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀 實(shí)驗(yàn)終止期前1周對(duì)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠進(jìn)行前述臨床癥狀觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，cho/+小鼠及+/+小鼠在精神狀態(tài)、進(jìn)食、活動(dòng)及皮毛狀況上無(wú)明顯差異，進(jìn)食、活動(dòng)均正常，精神佳，毛色光澤，大便性狀正常。無(wú)精神萎靡、少動(dòng)、進(jìn)食減少、腹瀉、血便等癥狀。實(shí)驗(yàn)終止期，分別對(duì)其進(jìn)行體質(zhì)量測(cè)量，實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量較對(duì)照組無(wú)明顯差異，未出現(xiàn)體質(zhì)量減輕情況。2.2 大體病理學(xué)觀察 處死小鼠后，解剖實(shí)驗(yàn)組小鼠時(shí)，未發(fā)現(xiàn)結(jié)腸與周?chē)M織粘連，近端腸腔無(wú)擴(kuò)張，未發(fā)現(xiàn)腸腔局部充血水腫，腸壁無(wú)潰瘍且未增厚。即所有參考CMDI的觀察指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均無(wú)顯著性差異。

2.3 組織病理學(xué)觀察 鏡下觀察組織切片時(shí)，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)炎癥異常表現(xiàn)，可見(jiàn)清晰的黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層，且無(wú)充血水腫、無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);隱窩結(jié)構(gòu)正常，無(wú)扭曲或膿腫；細(xì)胞形態(tài)正常，且無(wú)杯狀細(xì)胞減少等(見(jiàn)圖1)。腸道黏膜層在腸道免疫系統(tǒng)中起到重要作用，小鼠的結(jié)腸黏膜層各組織結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)非典型增生和肉芽組織形成；上皮細(xì)胞及杯狀細(xì)胞排列規(guī)則(圖中如花朵狀)，無(wú)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和淋巴濾泡形成?；ǘ錉罱Y(jié)構(gòu)周?chē)墓逃袑咏Y(jié)締組織正常，無(wú)炎性細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖2)。其中派伊爾結(jié)(Peyer’s patches，PP)是小腸的黏膜濾泡組織，為腸道相關(guān)淋巴樣組織的重要組成部分。其在實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中也無(wú)明顯數(shù)量上的差異，且邊界清晰，T細(xì)胞、B細(xì)胞及M細(xì)胞無(wú)異常增多(見(jiàn)圖3)。

圖2 結(jié)腸黏膜層縱切面高倍光鏡下表現(xiàn)(400×) A：實(shí)驗(yàn)組；B：對(duì)照組

Fig 2 Expression of longitudinal section of colonic mucosa under lighe microscopic(400×) A: experimental group;B: control group

圖3 小腸縱切面派伊爾結(jié)光鏡下表現(xiàn)(100×) A：實(shí)驗(yàn)組；B：對(duì)照組

Fig 3 Expression of longitudinal section of PPs in small intestines under light microscopic(100×) A: experimental group;B: control group

3 討論

隨著Fisher對(duì)現(xiàn)代統(tǒng)計(jì)學(xué)的建立，其與Neyman、Pearson等先后提出很多重要的理論方法為統(tǒng)計(jì)學(xué)做出了重大貢獻(xiàn)。其中“零假設(shè)”(null hypothesis)這一理論概念的提出，在科學(xué)界受到廣泛贊揚(yáng)，成為客觀數(shù)據(jù)分析的必要條件[12-13]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用了零假設(shè)的理論，即假設(shè)“小鼠早期OA與腸道炎癥病變的發(fā)生無(wú)關(guān)”。這為本次實(shí)驗(yàn)研究的進(jìn)行奠定了嚴(yán)肅客觀的基石。

近年來(lái)，IBD的發(fā)病率正在逐年上升。有研究顯示，UC每年在歐洲居民中的發(fā)病率為19.2/100 000～24.3/100 000，在亞洲和中東國(guó)家居民的發(fā)病率為6.3/100 000；CD每年在歐洲和美國(guó)的發(fā)病率為12.7/100 000～20.2/100 000，在亞洲和中東的發(fā)病率為5/100 000[14]。又因?yàn)镮BD病因不明、病情遷延不愈，使IBD成為消化系統(tǒng)疾病中一個(gè)亟待解決的難題。同時(shí)因其伴隨復(fù)雜多樣的腸外表現(xiàn)，又加重了IBD治療的復(fù)雜性。在此現(xiàn)狀基礎(chǔ)上我們發(fā)現(xiàn)，在IBD患者的腸外表現(xiàn)中，最多發(fā)且嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的疾病為OA。它是一種滑膜關(guān)節(jié)的進(jìn)行性疾病，表現(xiàn)為滑膜關(guān)節(jié)組織異常使得重力導(dǎo)致的關(guān)節(jié)損害不能正常修復(fù)。由于IBD是自身免疫系統(tǒng)紊亂引起免疫系統(tǒng)過(guò)度反應(yīng)而導(dǎo)致臨床癥狀出現(xiàn)的疾病，同時(shí)OA也是一種炎癥性疾病，所以我們將OA和IBD的腸道炎癥表現(xiàn)作為實(shí)驗(yàn)研究的兩個(gè)方面，如前文所述，假設(shè)“小鼠早期OA與腸道炎癥病變的發(fā)生無(wú)關(guān)”。在此基礎(chǔ)上對(duì)OA小鼠模型進(jìn)行深入實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果或可對(duì)IBD的治療起到參考作用。

1971年，Seegmiller等[15]發(fā)現(xiàn)小鼠常染色體隱性的cho基因突變引起四肢、肋骨、下頜骨和氣管的軟骨發(fā)育障礙，導(dǎo)致骨骼缺陷。1995年Li等[6]發(fā)現(xiàn)其突變位點(diǎn)并揭開(kāi)了其中的奧秘：cho基因與編碼Ⅺ型膠原α1鏈(Col11a1)的基因在3號(hào)染色體的同一位點(diǎn)，在此位點(diǎn)的mRNA上缺失了翻譯啟動(dòng)密碼子下游第570個(gè)核苷酸位點(diǎn)的胞嘧啶，使閱讀框架發(fā)生改變，最終導(dǎo)致了終止密碼子的提前出現(xiàn)。在此基礎(chǔ)上，Xu等[7]在2003年對(duì)cho/+基因小鼠的膝關(guān)節(jié)及下頜骨關(guān)節(jié)進(jìn)行研究時(shí)又發(fā)現(xiàn)，其軟骨形態(tài)學(xué)、膠原纖維狀態(tài)、MMP-3和MMP-13蛋白表達(dá)水平及生物力學(xué)等變化特征均與人類(lèi)OA發(fā)展過(guò)程相似。又由于早在上世紀(jì)90年代就有研究證明單基因突變或?yàn)镺A的誘發(fā)因素：基因編碼Ⅱ型膠原(Col 2a1)、Ⅸ 型膠原(Col 9a1、Col 9a2、Col 9a3)、Ⅺ型膠原(Col11a1、Col11a2)時(shí)發(fā)生突變，與人類(lèi)軟骨發(fā)育不全的早發(fā)型OA密切相關(guān)[16-20]。所以，cho基因小鼠無(wú)論是在基因突變類(lèi)型還是OA發(fā)展進(jìn)程中，都與人類(lèi)OA高度相符，成為世界上最早且最符合人類(lèi)OA特征的小鼠模型。

EIMs在IBD中有很高的發(fā)病率，同一種EIMs的復(fù)發(fā)很常見(jiàn)，且患一種EIMs后出現(xiàn)其他種類(lèi)EIMs的風(fēng)險(xiǎn)也明顯增高[21]。OA是IBD患者中最常見(jiàn)的EIMs，在CD患者中的發(fā)病率的是UC的2倍(20%：11%)[22]，男性和女性的患病風(fēng)險(xiǎn)基本相同[23]。IBD患者中的OA分為外周關(guān)節(jié)炎和脊柱關(guān)節(jié)炎兩大類(lèi)，外周關(guān)節(jié)炎又分兩種類(lèi)型：I型(少關(guān)節(jié)型)和Ⅱ型(多關(guān)節(jié)型)[24]。現(xiàn)階段對(duì)IBD相關(guān)性O(shè)A的治療以減少炎癥和防止殘疾及畸形為目的[25]，Ⅰ型外周關(guān)節(jié)炎與IBD的活動(dòng)性相關(guān)，所以使用藥物和手術(shù)積極治療原發(fā)IBD就可以有效控制關(guān)節(jié)炎病情。研究[21]表明，在成功治療IBD之后的8～10周，OA癥狀可消失，且無(wú)關(guān)節(jié)損害和畸形[23]。Ⅱ型外周關(guān)節(jié)炎與IBD的活動(dòng)性無(wú)關(guān)，病情可持續(xù)數(shù)月或數(shù)年[24]，其治療相對(duì)困難和復(fù)雜。由于腸道癥狀治療對(duì)OA無(wú)效，所以以物理療法和止痛治療為主[1]。脊柱關(guān)節(jié)炎在IBD患者中的發(fā)病率為3%～5%[26-27]，男性較女性高發(fā)[23]。也分兩種類(lèi)型：強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)和骶髂關(guān)節(jié)炎，均與IBD活動(dòng)性無(wú)關(guān)。IBD相關(guān)的AS治療完全依據(jù)無(wú)IBD的單純AS治療方案：物理治療被用來(lái)保持脊柱靈活性和防止脊柱畸形；運(yùn)動(dòng)方案包括深呼吸、脊柱運(yùn)動(dòng)和游泳[28]。骶髂關(guān)節(jié)炎通常無(wú)癥狀[29]，無(wú)特殊治療方案，以物理治療為主。除此之外，非甾體類(lèi)抗炎藥(NSAIDs)、抗腫瘤壞死因子(anti-TNF)、柳氮磺吡啶、類(lèi)固醇類(lèi)等藥物廣泛應(yīng)用于IBD相關(guān)的OA治療中，但因藥物自身的副作用及病情的復(fù)雜性，使藥物在IBD相關(guān)OA中的應(yīng)用更為謹(jǐn)慎和多樣化[1,21,25,29]。臨床數(shù)據(jù)表明，在使用生物藥物時(shí)，我們需根據(jù)不同類(lèi)型及不同嚴(yán)重程度的OA制定不同的治療方案[30]。

在本實(shí)驗(yàn)研究中，我們從OA模型小鼠入手，深入探討OA與腸道炎癥的關(guān)系，或可為復(fù)雜的臨床治療開(kāi)辟新的思路。研究結(jié)果顯示3個(gè)月時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠在臨床癥狀及組織病理學(xué)方面與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。這一結(jié)果使我們?cè)诮邮芰慵僭O(shè)的同時(shí)，也證明了OA在早期不引起腸道炎癥發(fā)生，不會(huì)誘發(fā)IBD出現(xiàn)。由于接受零假設(shè)僅代表此次實(shí)驗(yàn)樣本的結(jié)果，并不能說(shuō)明沒(méi)有傾向，所以可繼續(xù)進(jìn)行中期和晚期OA與腸道炎癥發(fā)生的關(guān)系研究，以進(jìn)一步完整探索OA在發(fā)生、發(fā)展、形成的全過(guò)程中與腸道炎癥的關(guān)系。其結(jié)果可對(duì)IBD與OA的關(guān)系及IBD相關(guān)OA的治療提供更全面的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Manifestation of intestinal inflammation at early stages of osteoarthritis in model mice

ZHANG Xialu1,2, LI Yefu2, ZHOU Ping1

1. Department of Gastroenterology, Air Force General Hospital, PLA, Beijing 100142，China; 2.Faculty of Medicine, Harvard Medical School, Boston

Objective To investigate the relationship between early osteoarthritis (OA) and intestinal inflammation in model mice, thus provide novel insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease(IBD) associated with OA.Methods A spontaneous mouse model of OA, type Ⅺ collagen-haploinsufficiency (chondrodysplasia, cho) in mice was used in this study. After genotyping, cho/+ mice were used as the experimental group, while their wild-type littermates were as the control group. The null hypothesis, which was no significant relationship between early OA and inflammation of intestines, was applied in this investigation. The intestine of mice at the age of 3 months old was collected and evaluated according to disease activity index(DAI). The tissues were also assessed for the pathological analysis based on colonic mucosa damage index(CMDI).Results The clinical manifestations and histopathology were no singnificant difference between the exeperimental group and control group. Conclusion The early OA is not related to the onset of intestinal inflammation in mice and the IBD is not exacerbated at the early stage of OA in mice.

Inflammatory bowel disease; Ulcerative colitis; Crohn’s disease; Osteoarthritis; Null hypothesis

周平，主任醫(yī)師，博士，研究方向：消化系統(tǒng)常見(jiàn)疾病及消化系統(tǒng)腫瘤。E-mail：zhouping4946@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.10.011

R574.62

A

1006-5709(2016)10-1120-04

2015-12-19