胡麗紅, 李 晴, 曲 波

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科, 黑龍江 哈爾濱 150086

烏司他丁對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型炎癥抑制作用及機(jī)制研究

胡麗紅, 李 晴, 曲 波

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科, 黑龍江 哈爾濱 150086

目的 探討烏司他丁是否可通過對NF-κB活性的抑制，起到治療潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)的作用。方法 24只BALB/C小鼠以DSS法建立UC小鼠模型，造模后隨機(jī)分為模型對照組、柳氮磺吡啶治療組、柳氮磺吡+烏司他丁治療組，每組8只，另8只正常小鼠設(shè)為正常對照組(飲用蒸餾水)。于用藥后7 d對小鼠進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定：疾病活動指數(shù)(DAI)、結(jié)腸組織病理學(xué)改變、血清中ALB、C反應(yīng)蛋白、TNF-α的表達(dá)、結(jié)腸黏膜中SOD、NF-κB的表達(dá)。結(jié)果 用藥后各組小鼠DAI、C反應(yīng)蛋白、TNF-α、NF-κB對比：正常對照組<柳氮磺吡啶+烏司他丁治療組<柳氮磺吡啶治療組<模型對照組；ALB、SOD的對比：正常對照組>柳氮磺吡啶+烏司他丁治療組>柳氮磺吡啶治療組>模型對照組。結(jié)論 烏司他丁可明顯抑制NF-κB的表達(dá)，對UC的治療效果明顯優(yōu)于單純使用柳氮磺吡啶。

烏司他??；小鼠；潰瘍性結(jié)腸炎；NF-κB；治療

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確的慢性非特異性腸道炎性病變,由于UC的病因不夠明確，治療上也缺乏特異性藥物，世界衛(wèi)生組織將其列為難治性疾病之一。

在UC中，活化的NF-κB可調(diào)節(jié)與UC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的促炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1, IL-1)等的產(chǎn)生和釋放，加重腸道的炎性反應(yīng)[1]。由此提示NF-κB的激活在調(diào)節(jié)免疫及炎性反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，抑制NF-κB的活性可以起到治療UC的作用[2]。尋找靶向抑制NF-κB活性的方法用于UC治療，具有非常重大的科學(xué)意義和社會價值。

烏司他丁主要成分為健康男性新鮮尿液中分離純化出的糖蛋白,作為蛋白酶抑制劑,在抑制溶酶體酶釋放、穩(wěn)定溶酶體膜、清除氧自由基及抑制炎性介質(zhì)釋放方面有顯著作用[ 3-4 ]。烏司他丁是否可通過抑制NF-κB活性的途徑抑制UC的炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到治療UC的目的，目前尚無研究。

本課題中我們應(yīng)用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium, DSS)誘導(dǎo)的BALB/C小鼠建立UC動物模型，研究烏司他丁在UC中對NF-κB的抑制作用，及通過此途徑治療UC的價值。以此為基礎(chǔ)應(yīng)用于臨床研究，擴(kuò)展烏司他丁的應(yīng)用范圍, 開發(fā)新的用于UC的藥物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取健康雄性BALB/C小鼠32只，8周齡，體質(zhì)量20～25 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。小鼠常規(guī)飼養(yǎng),保證環(huán)境清潔，通風(fēng)良好，濕溫度適宜(溫度24～25 ℃，濕度70%～75%，照明方案12 L/12 D)。此方案經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物保護(hù)與應(yīng)用委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要藥物和試劑 DSS(M.W.=36 000～50 000，上海翊圣生物科技有限公司)；MPO測定試劑盒、SOD測定試劑盒、ELISA試劑盒(北京義翹神州生物科技有限公司)；其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.3 動物模型的建立及分組處理 從32只小鼠中隨機(jī)抽取24只禁食不禁水24 h后稱重，自由飲用3%DSS溶液7 d建立小鼠急性UC模型。造模后24 h隨機(jī)分3組，每組8只，模型對照組：每日生理鹽水0.1 ml 灌胃，生理鹽水0.1 ml腹腔注射；柳氮磺吡啶治療組：每日濃度為50 mg/ml的柳氮磺吡啶0.1 ml灌胃，生理鹽水0.1 ml腹腔注射；柳氮磺吡啶+烏司他丁治療組：每日濃度為50 mg/ml濃度的柳氮磺吡啶0.1 ml灌胃，濃度為1 500 U/ml的烏司他丁0.1 ml腹腔注射。另外8只小鼠作為正常對照組，自由飲用清水7 d后，間隔24 h后開始每日生理鹽水0.1 ml 灌胃，生理鹽水0.1 ml腹腔注射。

1.4 測定相關(guān)指標(biāo)

1.4.1 疾病活動指數(shù)(DAI)評分[5]：包括體質(zhì)量下降情況、大便性狀及便血情況，記錄疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)， 評分方法見表1。

表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)

Tab 1 Scoring of DAI

計(jì)分體質(zhì)量下降(%)大便性狀便血0無正常陰性11～5--26～10半稀便潛血311～15--4>15稀便肉眼血便

注：正常大便為干燥成形且呈小粒狀，半稀便為糊狀但不黏肛門，稀便為液體狀且黏肛門。

1.4.2 HE染色光鏡下觀察組織病理學(xué)改變：取病變明顯處以多聚甲醛固定，24 h后進(jìn)行漂洗，經(jīng) 70%、80%、90%、95%、95%、100%、100%、100%酒精梯度逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后行4 μm 厚度切片，HE染色，用中性樹脂封閉后，光鏡下觀察病理形態(tài)。具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表2[6]。

表2 組織學(xué)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)

Tab 2 Scoring of hisopathology damage

組織學(xué)表現(xiàn)評分潰瘍(mm)無潰瘍0小潰瘍<31大潰瘍>32炎癥輕度1重度2肉牙腫無0有1病變深度無0黏膜下層1肌層2漿膜層3纖維化無0輕度1重度2

1.4.3 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性測定： 取中段結(jié)腸,冰1×PBS 沖洗,凍存于液氮;測定時從液氮中取出結(jié)腸組織,稱重,剪碎,以冰生理鹽水作勻漿介質(zhì),玻璃勻漿器冰上勻漿成10%勻漿液,其它操作步驟根據(jù)試劑盒要求,作相應(yīng)處理后測定吸光度,計(jì)算相應(yīng)的SOD活性。

1.4.4 免疫組化方法測定小鼠結(jié)腸黏膜 NF-κB的表達(dá)：免疫組化采用半定量積分法計(jì)算免疫組化學(xué)染色積分：陽性細(xì)胞率：每張切片檢測5個視野(400倍)，所見的陽性細(xì)胞分為0～4級;染色強(qiáng)度：顯微鏡下觀察，僅細(xì)胞核著藍(lán)色者為陰性，細(xì)胞漿或核膜上呈棕黃色為陽性。強(qiáng)度分0～3級。

1.4.5 ELISA法測定TNF-α、白蛋白、C反應(yīng)蛋白的表達(dá)：摘眼球取血，將血液靜置后離心(3 500 r/min)10 min取血清，分裝后置-20 ℃冰箱保存，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，嚴(yán)格按照試劑盒說明書統(tǒng)一測定 TNF-α、白蛋白、C反應(yīng)蛋白含量。計(jì)算：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)是標(biāo)準(zhǔn)物的濃度，縱坐標(biāo)是OD值。根據(jù)樣品的OD值由坐標(biāo)曲線查出相應(yīng)的濃度，然后乘以稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 DAI評分結(jié)果 小鼠于造模開始第3天逐漸出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)直立、肉眼血便，第5天出現(xiàn)血便，至第7天均出現(xiàn)肉眼血便或便潛血陽性，嚴(yán)重者在出現(xiàn)肉眼純稀血便的同時肛周黏附少量血液。造模7 d后小鼠體質(zhì)量下降明顯，均超過原體質(zhì)量的15%，均出現(xiàn)肉眼血便。給予柳氮磺吡啶治療后，小鼠血便逐漸減少、質(zhì)地變干，體質(zhì)量逐漸升高，而加用烏司他丁組則好轉(zhuǎn)更為明顯。至第7天，柳氮磺吡啶+烏司他丁治療組小鼠大多排半稀便，個別便潛血陽性，體質(zhì)量減輕多為5%以內(nèi)，DAI評分為3.750+0.707，柳氮磺吡啶治療組大部分小鼠仍半稀便，但多為便潛血陽性甚至可見肉眼血便，體質(zhì)量下降6%～10%，DAI評分為5.250+0.886；正常對照組表現(xiàn)均正常，DAI評分為0。而模型對照組小鼠一般狀態(tài)極差，仍持續(xù)血便，體質(zhì)量下降明顯，DAI評分為9.625+0.916；4組之間采用SNK-q檢驗(yàn)，且各組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=238.647，P<0.001)。

2.2 白蛋白、C反應(yīng)蛋白檢測結(jié)果 白蛋白：正常對照組(26.200±0.532)>烏司他丁+柳氮磺吡啶治療組(19.050±0.359)>柳氮磺吡啶組(16.138±0.169)>模型對照組(15.100±0.307)，且各組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1501.561，P<0.001)。

C反應(yīng)蛋白：正常對照組(0.856±0.022)<烏司他丁+柳氮磺吡啶組(1.188±0.087)<柳氮磺吡啶組(1.513±0.023)<模型對照組(1.846±0.045)，且各組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=547.200，P<0.001)。

2.3 組織病理學(xué)改變 對照組病理檢查顯示正常結(jié)構(gòu)和病變組織無異常變化(見圖1A)。模型對照組黏膜損傷明顯，結(jié)構(gòu)破壞，明顯的上皮細(xì)胞崩解，炎性細(xì)胞浸潤、水腫和隱窩膿腫形成(見圖1B)。柳氮磺吡啶治療組炎癥反應(yīng)明顯降低(見圖1C)，加用烏司他丁組炎癥減輕更為明顯，組織學(xué)評分顯著下降(見圖1D)。HE評分正常對照組(0)<烏司他丁+柳氮磺吡啶組(3.000±0.535)<柳氮磺吡啶治療組(4.125±0.641)<模型對照組(7.875±0.641)。

2.4 SOD測定結(jié)果 烏司他丁+柳氮磺吡啶組較柳氮磺吡啶組SOD指標(biāo)明顯升高(見圖1、表3)。

圖1 各組組織病理學(xué)改變(HE 100×) A:正常對照組;B:模型對照組;C:柳氮磺吡啶治療組;D:柳氮磺吡啶+烏司他丁組

Fig 1 Histological changes in each group(HE 100×) A:normal control group;B:model control growp;C:Sulfasazine treatment group;D:Sulfasalazine combined with Ulinastatin treatment group

表3 各處理組SOD 值比較

Tab 3 Comparison of SOD value in each treatment group

分組α=0．05的子集只數(shù)1234模型對照組844．3750柳氮磺吡啶組865．6250烏司他丁+柳氮磺吡啶組873．8750正常對照組882．6250顯著性1．0001．0001．0001．000

2.5 免疫組化方法測定小鼠結(jié)腸黏膜NF-κB的表達(dá) 免疫組化評分正常對照組(1.450±0.141)；模型對照組(5.375±0.292)；柳氮磺吡啶治療組(3.700±0.151)；烏司他丁+柳氮磺吡啶組(2.575±0.128)，各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6 ELISA法檢測TNF-α的表達(dá) SNK-q檢驗(yàn)F=2559.967，P<0.001，各組間比較見下表(見表4)。

圖2 各組小鼠結(jié)腸黏膜NF-κB的表達(dá)情況(HE 200×) A:正常對照組;B:模型對照組;C:柳氮磺吡啶治療組;D:柳氮磺吡啶+烏司他丁治療組

Fig 2 The NF-κB expression of colonic mucosa in each group (HE 200×) A:normal control group;B:model control group;C:Sulfasalazine grap;D:Sulfasalazine combined with Ulinastatin treatment group

表4 各處理組TNF-α數(shù)值的比較(μg/L)

Tab 4 Comparison of TNF-α value in each treatment group(μg/L)

劑量α=0．05的子集只數(shù)1234模型對照組836．2500柳氮磺吡啶組893．3750烏司他丁+柳氮磺吡啶組8123．5000正常對照組8134．3750顯著性1．0001．0001．0001．000

3 討論

IBD是一種臨床常見疾病，具有病程長、病情遷延不愈、反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)，傳統(tǒng)治療方式如5-氨基水楊酸制劑及其衍生物、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等，能控制部分患者的癥狀，但療效并不盡如人意，且存在藥物依賴、副作用大等問題[7-8]。近年來生物治療已由實(shí)驗(yàn)研究逐步轉(zhuǎn)向臨床應(yīng)用。如抗TNF單克隆抗體Infliximab(英夫利昔)對IBD的療效和安全性已獲得肯定，但治療過程中存在感染、輸液反應(yīng)、遲發(fā)型過敏反應(yīng)、自身抗體及藥物性紅斑狼瘡等不良反應(yīng)[9]。因此，基于IBD的發(fā)病機(jī)制，開發(fā)研制治療IBD療效確切且安全可靠的藥物仍是現(xiàn)階段面臨的主要問題。

核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)是一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)， 廣泛存在于真核細(xì)胞中，參與許多疾病的發(fā)病機(jī)制。正常狀態(tài)下，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB家族成員通常以二聚體形式與其抑制蛋白IκB形成復(fù)合物，以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。只有在受到各種活化因素的作用，IκB蛋白激酶IKK活化，IκB被磷酸化并通過26S 蛋白酶體順序降解，與NF-κB解離，NF-κB活化進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，其DNA結(jié)合位點(diǎn)暴露，與DNA啟動子上特定的認(rèn)知序列結(jié)合，調(diào)控NF-κB反應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)錄。在IBD中，活化的NF-κB可調(diào)節(jié)與IBD發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的促炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(Interleukin-1，IL-1)等的產(chǎn)生和釋放，加重腸道的炎性反應(yīng)。由此提示NF-κB的激活在調(diào)節(jié)免疫及炎性反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，抑制NF-κB的活性可以起到治療IBD的作用。尋找靶向抑制NF-κB活性的方法用于IBD治療，此方面的研究具有非常重大的科學(xué)意義和社會價值，從新藥開發(fā)的角度也具有較高的經(jīng)濟(jì)價值。這也是本課題的研究重點(diǎn)。

烏司他丁是臨床上應(yīng)用非常廣泛的藥物。作為蛋白酶抑制劑,能夠?qū)ν该髻|(zhì)酸酶、胰蛋白酶、緩激肚、彈力蛋白酶等多種蛋白分解酶,同時能夠有效抑制脂肪、磷脂酶AZ等脂肪分解酶,同時可維持溶酶體膜、細(xì)胞膜,對溶酶體酶釋放及活性,從而在水解酶外溢、細(xì)胞溶酶體膜破裂、功能亢進(jìn)等導(dǎo)致的疾病如失血性休克、急性胰腺炎等疾病中使用,同時可對腫瘤轉(zhuǎn)移及侵襲進(jìn)行抑制。也有研究[10]表明，烏司他丁可以通過抑制NF-κB活性的途徑減輕肝缺血再灌注后的損傷程度。

本實(shí)驗(yàn)通過經(jīng)典的DSS法成功建立了UC小鼠模型，通過觀察小鼠一般狀態(tài)記錄DAI、HE染色記錄組織學(xué)損傷指數(shù)、血液化驗(yàn)C反應(yīng)蛋白及ALB、SOD活性測定幾個水平檢測烏司他丁對UC模型小鼠的治療效果，可見明顯優(yōu)于單純使用傳統(tǒng)藥物柳氮磺吡啶組。免疫組化檢測NF-κB p65的表達(dá)，可見應(yīng)用烏司他丁組較單純應(yīng)用柳氮磺吡啶組更明顯抑制NF-κB的表達(dá)，分析烏司他丁對NF-κB活性的抑制可能與烏司他丁作為蛋白酶抑制劑抑制了26S蛋白酶的活性從而抑制了IκB降解，NF-κB與IκB無法解離，從而處于非活性狀態(tài)有關(guān)。NF-κB的抑制也減輕了TNF-α的產(chǎn)生和釋放，進(jìn)一步抑制了炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到治療的目的。本實(shí)驗(yàn)為烏司他丁用于IBD的治療提供了理論依據(jù)，而烏司他丁作為臨床上應(yīng)用廣泛的藥物，其安全性和有效性也已得到證實(shí)。在臨床中將烏司他丁用于IBD的治療對開拓藥物的應(yīng)用領(lǐng)域，提高患者的治療效果起到重要的作用，也是我們今后臨床研究的方向。

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Research on the inhibition effect and mechanism of Ulinastatin on mice model with ulcerative colitis

HU Lihong, LI Qing, QU Bo

Department of Gastroenterology, the 2nd Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, China

Objective To explore whether Ulinastatin can inhibit the NF-κB activity and can exert effect on the treatment of ulcerative colitis (UC).Methods Twenty-four BALB/C mice were used to establish UC mice model in the method of DSS. After modeling, the mice were randomly divided into 3 groups, the model control group, Sulfasalazine treatment group, Sulfasalazine combined with Ulinastatin treatment group, and normal control group were arranged to drink distilled water. Seven days after treatment, relevant parameters of mice were measured: disease activity index (DAI), changes of colon histopathology, expressions of ALB, CRP and TNF-α in serum， the expressions of SOD and NF-κB in colonic mucosa. Results Comparison of activity index, CRP, TNF-α and NF-κB of mice in each group after treatment: there were the normal control groupSulfasalazine combined with Ulinastatin treatment group>Sulfasalazine treatment group> model control group. Conclusion Ulinastatin can significantly inhibit the expressions of NF-κB, and the therapeutic effect of UC is distinctly Superior to the use of traditional drug Sulfasalazine.

Ulinastatin; Mice; Ulcerative colitis; NF-κB; Treatment

黑龍江省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題(2014-332)

胡麗紅，主治醫(yī)師，碩士，研究方向：潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制的研究。E-mail:hlh902@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.10.009

R574.62

A

1006-5709(2016)10-1111-05

2016-06-17