周 穎, 呂 紅, 汪紅英, 錢家鳴

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院消化科，北京 100730； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院 分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室

論著·炎癥性腸病

維生素D3對小鼠實驗性結(jié)腸炎和炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌的保護(hù)作用

周 穎1, 呂 紅1, 汪紅英2, 錢家鳴1

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院消化科，北京 100730； 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院 分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室

目的 探究預(yù)防性補充維生素 D3(VitD3)對小鼠急性實驗性結(jié)腸炎(AC)和炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌(colitis-associated CRC, CAC)的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。方法 采用葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate, DSS)誘導(dǎo)小鼠實驗性結(jié)腸炎模型，氧化偶氮甲烷(AOM)聯(lián)合DSS誘導(dǎo)CAC模型，干預(yù)組VitD3定期灌胃。機(jī)制研究采用實時熒光定量PCR和免疫組化染色法。結(jié)果 VitD3干預(yù)后，AC模型小鼠的結(jié)腸炎癥減輕，其中結(jié)腸組織TNF-α表達(dá)和結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡減少。CAC模型小鼠的成瘤體積變小，其中β-catenin的表達(dá)水平和入核減少。結(jié)論 預(yù)防性補充VitD3對小鼠結(jié)腸炎癥和CAC形成具有保護(hù)作用。

維生素D3；實驗性結(jié)腸炎；炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)在中國及亞洲的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。不同于西方國家，中國的IBD中潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)顯著多于克羅恩病(Crohn’s disease, CD)[1]。大量研究提示UC是結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)發(fā)生的危險因素[2]。這種由結(jié)腸炎癥演變的CRC，其發(fā)病機(jī)制與散發(fā)型CRC有所不同，故稱為炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌(colitis-associated CRC, CAC)。維生素D(Vitamin D, VitD)是甾體類激素骨化三醇的前體，近年來發(fā)現(xiàn)除調(diào)節(jié)鈣、磷代謝外，VitD對人體還具有免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥和預(yù)防癌癥等作用[3]。本研究通過對急性實驗性結(jié)腸炎(acute experimental colitis, AC)和CAC模型小鼠預(yù)防性補充VitD3，探究VitD3對結(jié)腸炎癥和CAC的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物和材料 實驗動物為雄性C57BL/6小鼠50只(6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g)，購自維通利華公司。葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate, DSS)分子量36 000～50 000，購自MP Biomedicals公司。VitD3采用膽維丁乳，商品名為“英康利”。氧化偶氮甲烷(Azoxymethane, AOM)購自Sigma-Aldrich公司。Trizol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自Lifetechnology公司。SYBR Green染料采用Takara公司的SYBR Premix Ex TaqII。Cleaved Caspase-3和β-catenin的一抗均購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 動物模型和分組

1.2.1 小鼠AC模型分為以下三組：(1)空白對照組(Control組，5只)；(2)AC模型組(AC組，10只)，給予含2.5% DSS的飲用水5 d，第10天處死小鼠；(3)VitD干預(yù)組(AC+VitD組，10只)，除DSS處理外給予VitD3定期灌胃，劑量為每周32.5 IU/g，灌胃從建模前2周持續(xù)至小鼠處死。小鼠在建模和喂養(yǎng)過程中無死亡。

1.2.2 小鼠CAC模型分為以下三組：(1)空白對照組(Control組，5只)；(2)CAC模型組(CAC組，10只)，予腹腔注射12.5 mg/kg AOM，1周后給予含2.5% DSS的飲用水5 d，第12周末處死小鼠;(3)VitD干預(yù)組(CAC+VitD組，9只)，除上述誘導(dǎo)成瘤外予定期VitD3灌胃，方法同上。VitD干預(yù)組中1只小鼠因灌胃誤吸死亡。

1.3 結(jié)腸炎癥評估 給予小鼠DSS后第0～10天每天評估疾病活動指數(shù)(Disease Activity Index, DAI)(見表1)。處死小鼠取出結(jié)腸后進(jìn)行大體結(jié)腸炎評分(見表2)。根據(jù)Cooper等[4]的“螺絲狀”(Swiss Roll)方法，請病理科醫(yī)生進(jìn)行病理炎癥評分(見表3)。取一段長0.5 cm的新鮮結(jié)腸組織，根據(jù)比色法測定髓過氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)活性[5]。

表1 疾病活動指數(shù)DAI計算方法

Tab 1 Disease Activity Index(DAI) evaluation

評分體質(zhì)量下降大便性狀便潛血00成形-11%～5%//25%～10%半成型，不粘于肛門+～+++310%～20%//4>20%液體狀，粘于肛門口肉眼血便

表2 小鼠實驗性結(jié)腸炎大體評分

Tab 2 Macroscopic colitis score in mice

評分表現(xiàn) 0正常結(jié)腸組織1腸壁輕度增厚，無充血2腸壁中度增厚，伴充血3腸壁中度增厚，僵硬，充血4腸壁重度增厚，僵硬，充血

1.4 結(jié)腸成瘤判斷 計算結(jié)腸肉眼可見的成瘤數(shù)(直徑D≥1 mm)，用游標(biāo)卡尺測定腫瘤平均直徑，計算瘤負(fù)荷(即所有腫瘤的平均直徑之和)。結(jié)腸切片請病理科醫(yī)生判斷是否形成腫瘤，如有腫瘤則進(jìn)一步判斷腫瘤累及的層次及異型性。根據(jù)腫瘤平均直徑(D)將成瘤分為大(D>4 mm)、中(2 mm

表3 小鼠實驗性結(jié)腸炎病理評分

Tab 3 Histological colitis score in mice

評分炎癥程度損傷范圍隱窩破壞0無無無1輕度黏膜層基底層1/32中度黏膜下層基底層2/33重度全層僅表面上皮完整4//上皮、基底層均破壞

1.5 實驗方法 實時熒光定量PCR：Trizol一步法提取小鼠結(jié)腸組織總RNA，按試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。實時熒光定量PCR根據(jù)SYBR Green I方法進(jìn)行相對定量分析。引物序列及PCR產(chǎn)物長度見表4。免疫組織化學(xué)(Immunohistochemical, IHC)染色：按常規(guī)步驟進(jìn)行，抗原修復(fù)采用微波法，一抗4 ℃過夜，二抗采用二步試劑法。小鼠血清25羥維生素D的測定:采用同位素稀釋超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(Isotope dilution ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, ID.UPLC/MS/MS)，該方法可同時檢測25(OH)D3和25(OH)D2；由北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科代為檢測。

表4 實時熒光定量PCR的引物序列及產(chǎn)物長度

Tab 4 Primer sequence and product length in RT-PCR

合成物引物序列(5′?3′)產(chǎn)物長度(bp)TNF?αForward：CAGCCGATGGGTTGTACCTT100Reverse：ATAGCAAATCGGCTGACGGTCyclinD1Forward：CAAGTGTGACCCGGACTGC149Reverse：CACATCTCGCACGTCGGTβ?cateninForward：ATGGAGCCGGACAGAAAAGC111Reverse：TGGGAGGTGTCAACATCTTCTTGAPDHForward：AACTTTGGCATTGTGGAAGG223Reverse：ACACATTGGGGGTAGGAACA

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料比較采用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。分類資料比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VitD3抑制小鼠實驗性結(jié)腸炎 VitD3定期灌胃可使小鼠血清25(OH)D水平顯著升高(見圖1A)。AC模型構(gòu)建成功，AC組和AC+VitD組在癥狀出現(xiàn)時間、DAI進(jìn)展速度及DAI峰值上基本一致，但AC+VitD組結(jié)腸炎癥狀較AC提前恢復(fù)(見圖1B)。AC+VitD組的結(jié)腸大體評分、病理評分和MPO活性均較AC組下降(病理評分P=0.06，余P均<0.05，見圖1C～1E)?？傮w來說，AC組小鼠結(jié)腸中重度炎癥多見，肌層受累者多于AC+VitD組，隱窩破壞更嚴(yán)重(見圖1F)。

2.2 VitD3抑制小鼠結(jié)腸組織TNF-α表達(dá)和結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡 測定各組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α的mRNA表達(dá)水平，AC組和AC+VitD組較空白對照組均顯著升高(P<0.05)，AC+VitD組TNF-α表達(dá)較AC組顯著降低(P<0.05，見圖2A)。對結(jié)腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cell, IEC)進(jìn)行活化的Caspase 3(Activated Caspase 3)免疫組織化學(xué)染色，AC組小鼠IEC凋亡較空白對照組顯著增加，主要分布于隱窩上1/3處；AC+VitD組IEC凋亡較AC組顯著減少，僅在隱窩頂部可見凋亡細(xì)胞，但仍多于空白對照組(見圖2B)。

注：*P<0.05。

圖1 VitD3對小鼠實驗性結(jié)腸炎癥的抑制作用 A：血清25(OH)D濃度；B：建立AC模型后DAI的變化；C：實驗性結(jié)腸炎大體評分；D：實驗性結(jié)腸炎病理評分；E：結(jié)腸組織MPO活性；F：典型的結(jié)腸大體和病理表現(xiàn)(HE 100×)

Fig 1 VitD3 suppressed experimental colitis in mice A: concentration of serum 25(OH)D level; B: change of DAI after the establishment of AC model; C: macroscopic colitis score; D: histological colitis score; E: MPO level of colonic tissue; F: typical macroscopic and histological features (HE 100×)

注：*P<0.05。

圖2 VitD3對小鼠結(jié)腸組織TNF-α表達(dá)和結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡的抑制作用 A：結(jié)腸上皮TNF-α mRNA相對表達(dá)水平；B：活化的Caspase 3在IEC內(nèi)的表達(dá)分布(IHC 400×)

Fig 2 VitD3 reduced colonic TNF-α expression and intestinal epithelial cell apoptosis in mice A: expression of TNF-α mRNA of colon; B: expression of activated Caspase 3 in IEC (IHC 400×)

2.3 VitD3抑制小鼠CAC的腫瘤大小 評估各組小鼠的結(jié)腸成瘤情況，CAC組10只小鼠均可見結(jié)腸肉眼成瘤，CAC+VitD組9只小鼠中8只成瘤，成瘤個數(shù)分別為(5±2)個和(3.8±3.99)個，瘤負(fù)荷分別為 (1.28±0.9) cm和(0.83±0.91) cm。CAC+VitD組的成瘤個數(shù)和瘤負(fù)荷較CAC組均有下降趨勢(見圖3A)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.08)。CAC組中大、中、小腫瘤的組成比分別為10%、54%和36%，而CAC+VitD組為0、35%和65%，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001, 見圖3B)。

2.4 VitD3抑制小鼠結(jié)腸組織β-catenin表達(dá)水平及其入核 檢測小鼠結(jié)腸組織中β-catenin mRNA表達(dá)情況，與CAC組相比， CAC+VitD3組β-catenin mRNA表達(dá)水平顯著下降(見圖4A，P<0.05)。進(jìn)一步檢測β-catenin下游產(chǎn)物Cyclin D1的表達(dá)情況，CAC+VitD組的Cyclin D1 mRNA 表達(dá)水平較CAC組顯著降低(P<0.05，見圖4B)。β-catenin的免疫組化染色結(jié)果顯示，正常結(jié)腸組織中β-catenin主要表達(dá)于胞漿和細(xì)胞膜上，細(xì)胞核內(nèi)很少表達(dá)；CAC組的結(jié)腸腫瘤內(nèi)，細(xì)胞膜上β-catenin表達(dá)消失，細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)顯著增加；CAC+VitD組的結(jié)腸腫瘤仍可見細(xì)胞膜上β-catenin表達(dá)，細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)量也低于CAC組(見圖4C)。

注：***P<0.001。

圖3 VitD3對小鼠CAC腫瘤大小的抑制作用 A：典型的結(jié)腸大體成瘤情況；B：大(D>4 mm)、中(2 mm

Fig 3 VitD3 reduced tumor size in CAC mice model A: tumor formation of typical macroscopic CAC; B: proportion of Large(D>4 mm), medium(D>4 mm) and small(D≤2 mm) sized tumors

注：*P<0.05。

圖4 VitD3對小鼠結(jié)腸組織β-catenin表達(dá)水平及其入核的抑制作用 A：β-catenin mRNA的相對表達(dá)水平；B ：Cyclin D1 mRNA的相對表達(dá)水平；C：β-catenin在結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)分布(IHC 400×)

Fig 4 VitD3 suppressed colonic β-catenin expression and its nuclear localization A: β-catenin mRNA level; B: Cyclin D1 mRNA level; C: β-catenin expression in IEC(IHC 400×)

3 討論

目前VitD對CRC的化學(xué)預(yù)防作用尚不明確，雖然流行病學(xué)數(shù)據(jù)和臨床前研究提示補充VitD、升高血清25(OH)D水平能預(yù)防結(jié)直腸腫瘤，但為數(shù)不多的來自人群的隨機(jī)對照研究并未發(fā)現(xiàn)類似的保護(hù)作用[6-7]。但已有的研究只關(guān)注了散發(fā)型CRC。IBD相關(guān)結(jié)直腸癌患者病例較少見，從結(jié)腸炎發(fā)展至CAC的過程多在10年以上，難以在IBD人群中開展前瞻性的CAC干預(yù)性研究。因此動物模型是研究CAC預(yù)防的有效方式。目前VitD對CAC預(yù)防作用的動物研究尚不多。采用AOM-DSS誘導(dǎo)的小鼠CAC模型，Hummel 等[8]發(fā)現(xiàn)給予C56BL/6小鼠飼料中添加VitD3可預(yù)防結(jié)腸的癌前病變，且預(yù)防作用與小鼠血清25(OH)D3濃度呈正相關(guān)，但該研究的終點指標(biāo)是癌前病變而非結(jié)直腸癌。另一研究采用DMH聯(lián)合DSS誘導(dǎo)小鼠CAC模型，飼料中添加VitD3聯(lián)合二甲雙胍可顯著抑制結(jié)腸成瘤[9]。我們的研究采用單一VitD3作為干預(yù)藥物，發(fā)現(xiàn)VitD3不僅能抑制結(jié)腸炎癥，并首次證實VitD3能抑制小鼠CAC的成瘤大小。但本研究中VitD3干預(yù)并不影響CAC的病理學(xué)成瘤評估，兩組均為中分化的黏膜內(nèi)癌。

已有研究表明VitD缺乏的小鼠更易出現(xiàn)實驗性結(jié)腸炎，補充VitD及其類似物能減輕結(jié)腸炎癥[5,10]。本課題組曾用TNBS誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎，VitD干預(yù)也有類似結(jié)果[11]。本研究再次證實，預(yù)防性補充VitD3可以使小鼠血清25(OH)D濃度升高，結(jié)腸炎癥水平下降。機(jī)制方面，本研究檢測了VitD3干預(yù)前后TNF-α、IL-6、IL-21等多個炎癥因子的表達(dá)情況，只有TNF-α在VitD3干預(yù)后表達(dá)顯著下降。這也佐證了TNF-α是IBD發(fā)病機(jī)制中的重要炎癥因子，TNF-α單抗是IBD治療的主要生物制劑。既往研究發(fā)現(xiàn)VitD/維生素D受體(VDR)信號通路在IBD中主要參與免疫調(diào)節(jié)[12]，但近期新研究提出VitD能保護(hù)腸上皮黏膜屏障的完整性，從而減少腸腔內(nèi)促炎物質(zhì)(細(xì)菌及其產(chǎn)物)進(jìn)入組織[13]。我們的研究發(fā)現(xiàn)VitD干預(yù)能抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡，這提示VitD可能通過抑制IEC凋亡來實現(xiàn)對腸上皮黏膜屏障的保護(hù)作用。

Wnt/β-catenin信號通路的突變在散發(fā)結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制中占有核心作用，β-catenin促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生的主要機(jī)制是β-catenin從胞漿入核，進(jìn)而促進(jìn)其下游基因的轉(zhuǎn)錄。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)該信號通路在CAC中也存在異常[14]。本實驗室曾用免疫組化染色檢測UC、UC癌變、結(jié)腸絨毛管狀腺瘤和CRC患者結(jié)腸腫瘤標(biāo)本的APC、Wnt1、β-catenin表達(dá)陽性率，結(jié)果顯示UC和UC癌變標(biāo)本β-catenin 的陽性率顯著高于腺瘤和結(jié)直腸癌[15]。體外實驗還發(fā)現(xiàn)，給予結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 TNF-α和IL-6刺激，可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá)和入核[16]。Palmer等[17]發(fā)現(xiàn)β-catenin是VitD抑制CRC細(xì)胞生長、增殖的重要機(jī)制，給予結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480以1,25(OH)2D3處理，可以抑制β-catenin表達(dá)，VDR還能結(jié)合β-catenin抑制其入核。本研究發(fā)現(xiàn)，在CAC動物模型中VitD3使結(jié)腸β-catenin表達(dá)下降、入核減少，并下調(diào)β-catenin的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物Cyclin D1。Cyclin D1是細(xì)胞周期蛋白家族成員之一，其功能是促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S的進(jìn)展，VitD3干預(yù)后Cyclin D1表達(dá)的下降也進(jìn)一步佐證了ViD3對腫瘤的抑制作用。

總而言之，VitD3作為一種體內(nèi)的生理性維生素，對結(jié)腸炎癥和CAC形成具有一定的保護(hù)和預(yù)防作用，可能是延緩CAC發(fā)展的因素之一。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Protective role of Vitamin D3 in experimental colitis and colitis-associated colorectal cancer in mice

ZHOU Ying1, LV Hong1, WANG Hongying2, QIAN Jiaming1

1.Department of Gastroenterology, Peking Union Medical College Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100730; 2.Key Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Hospital Chinese Academy of Medical Science, China

Objective To explore whether Vitamin D3 (VitD3) palys a protective role in acute experimental colitis(AC) and colitis-associated colorectal cancer (CAC) in mice and its mechanisms. Methods Dextran sodium sulfate(DSS) was used to induce AC mouse model. Azoxymethane and DSS were used to induce CAC model. VitD3 was given by gastric lavage. RT-PCR and immunohistochemical (IHC) staining were used in mechanism studies. Results VitD3 reduced colitis severity in AC model in which colonic TNF-α expression and intestinal epithelial cell apoptosis were decreased significantly after VitD3 intervention. VitD3 reduced tumor size significantly in CAC model, in which colonic β-catenin expression and nuclear localization were decreased significantly. Conclusion VitD3 palys a protective role in experimental colitis and CAC in mice.

Vitamin D3; Experimental colitis; Colitis-associated colorectal cancer

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.10.007

2011年高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(20111106110009)，衛(wèi)生行業(yè)科研專項項目(201002020)

周穎，醫(yī)學(xué)博士，研究方向：炎癥性腸病。E-mail：zhouying07@qq.com

錢家鳴，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，研究方向：炎癥性腸病。E-mail：qianjiaming1957@126.com

R574.62；R735.3+7

A

1006-5709(2016)10-1101-05

2016-08-10