李永幸，楊　帆，姜澤東,2,3，倪　輝,2,3，楊秋明,2,3，肖安風,2,3（.集美大學食品與生物工程學院，福建廈門3602；2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建廈門3602；3.廈門南方海洋研究中心經濟海藻資源化利用與深加工重點實驗室，福建廈門3602）

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響應面優(yōu)化微泡菌ALW1產褐藻膠裂解酶的發(fā)酵條件

李永幸1，楊帆1，姜澤東1,2,3，倪輝1,2,3，楊秋明1,2,3，肖安風1,2,3
（1.集美大學食品與生物工程學院，福建廈門361021；
2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建廈門361021；
3.廈門南方海洋研究中心經濟海藻資源化利用與深加工重點實驗室，福建廈門361021）

摘要：采用單因素和響應面法對產褐藻膠裂解酶菌種Microbulbifer sp. ALW1發(fā)酵產酶的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。通過單因素實驗，得到發(fā)酵條件如下：培養(yǎng)基初始pH 7.5，接種量5%，裝液量50 mL，溫度25℃，最大酶活力達到117.1 U/mL。在單因素實驗的基礎上，通過Box-Behnken設計和響應面分析，得到最佳的發(fā)酵培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基初始pH 8.0，接種量6.5%，裝液量50 mL，溫度23℃，褐藻膠裂解酶活力達到130 U/mL，比基礎培養(yǎng)條件下提高16.5%。

關鍵詞：微泡菌ALW1；褐藻膠裂解酶；響應面分析；條件優(yōu)化

褐藻膠是從巨藻、羊棲菜、海帶等褐藻間質中提取的多糖聚合物，主要有由α-L-古洛糖醛酸（G）及β-D-甘露糖醛酸（M）聚合而成［1-2］，因其良好的增稠、穩(wěn)定及凝膠作用，被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化工等領域［3］。研究表明褐藻膠降解生成的低分子量寡糖具有多種生理活性，如促進植物生長［4-5］、促進雙歧桿菌生長［6］、抗氧化活性［7］等。

目前，褐藻膠寡糖的制備方法主要有物理法［8］、化學法［9］和酶解法［10］。物理法及化學法反應條件復雜，不易控制，并且所得產物中副產物多；相比之下酶解法反應條件較溫和、容易操作、專一性強，因此酶解法逐漸取代物理化學法成為獲取寡糖的首要選擇。褐藻膠裂解酶來源廣泛，可以從海洋細菌［11］、革蘭氏陰性菌［12］和革蘭氏陽性菌［13］等中分離出來。但是酶產量制約著酶法水解褐藻膠在工業(yè)化上的應用，因此獲得高產量的褐藻膠裂解酶是實現酶法制備褐藻膠寡糖的前提與必要條件。

提高酶產量的方法包括高產菌株的選育、發(fā)酵工藝的優(yōu)化、基因工程改造等。發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及條件的優(yōu)化是提高褐藻膠裂解酶產量、降低成本、縮短發(fā)酵時間的重要手段之一。1994年，Dyrset［14］對菌株Klebsiella pneumoniae進行高密度發(fā)酵生產褐藻膠裂解酶工藝研究，發(fā)現蔗糖促進菌株生長，海藻酸鈉作為產酶誘導劑，確定碳源補加策略以提高酶產量。2009年，馬悅欣等［15］采用單因素及正交試驗設計相結合的方法，以褐藻膠作為唯一碳源對菌株Pseudoalteromonas sp. LJ1進行培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件優(yōu)化，在最佳條件下褐藻膠裂解酶活力提高66%。

本研究從海帶中篩選出一株產褐藻膠裂解酶菌株ALW1，鑒定為微泡菌屬（Microbulbifer sp.）。以往的研究報道中，產褐藻膠裂解酶菌種多是弧菌、假單胞菌、棒狀桿菌等，而對微泡菌屬（Microbulbifer sp.）產褐藻膠裂解酶的報道較少，該研究豐富了褐藻膠裂解酶資源。在前期的研究中，發(fā)現該菌株所產褐藻膠裂解酶為胞外酶，并且具有較好的熱穩(wěn)定性。為了微泡菌屬產褐藻膠裂解酶的推廣應用及工業(yè)化生產，采用單因素及響應面實驗方法，通過搖瓶發(fā)酵方式對其產褐藻膠裂解酶發(fā)酵條件進行了研究，以提高其產酶量。

1　材料和方法

1.1菌種

微泡菌Microbulbifer sp. ALW1，為本實驗室選育，經過中國工業(yè)微生物菌種管理保藏中心（CICC）鑒定為一株新菌，保藏編號為23821。

1.2主要試劑

K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaCl、無水Na2SO3、NaOH、酒石酸鉀鈉等試劑均為市售分析純；海藻酸鈉（CP）購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.3培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基成分：海藻酸鈉5 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉1 g/L，（NH4）2SO45 g/L，K2HPO42 g/L，NaCl 30 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，pH 7.5，121℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基中加入15 g/L瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基成分：海藻酸鈉1 g/L，NaCl 60 g/ L，MgSO4·7H2O 3 g/L，K2HPO46 g/L，FeSO4·7H2O 0.06 g/L，pH 7.5，121℃滅菌20 min。

1.4發(fā)酵條件

發(fā)酵條件：將活化后的種子培養(yǎng)基以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，250 mL三角瓶中裝液量為50 mL，溫度25℃，轉速180 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)60 h。

1.5酶活力的測定

取250 μL離心后的（12 000 r/min，8 min）發(fā)酵上清液，添加500 μL 5 g/L海藻酸鈉溶液（50 mmol/L pH為7.0的PBS緩沖液配制），40℃水浴30 min，再沸水浴5 min終止反應，加0.5 mL DNS，沸水顯色5 min后冷卻，最后加蒸餾水稀釋到5 mL，混勻后測540 nm處的吸光值，根據標準曲線來計算反應液中還原糖的生成量。對照組的酶液先用沸水浴滅活5 min，其他步驟與反應組一致。

上述條件下1 min催化產生1 μg還原糖所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.6生物量的檢測

取1.0 mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心8 min，去掉上清液后，用蒸餾水稀釋適當倍數，并用蒸餾水作空白，在600 nm波長下測吸光值。

1.7單因素篩選及響應面試驗

分別對培養(yǎng)基初始pH、裝液量、接種量以及溫度進行單因素變量實驗，每組設置3個平行，測定酶活力。應用SPSS Statistics 17.0對單因素結果進行方差分析，選出對酶活力影響顯著的因素進行Box-Behnken實驗設計。

2　結果與分析

2.1培養(yǎng)條件的單因素試驗

2.1.1初始pH對產酶的影響

李悅明等［16］對芽孢桿菌發(fā)酵產褐藻膠裂解酶進行研究，得出在培養(yǎng)基初始pH為7.0～8.5時，菌株能較好的產酶，在pH 7.5時產酶量最高。溫順華等［17］對Shewanella haliotis BP-1發(fā)酵產褐藻酸鹽裂解酶進行研究，得出培養(yǎng)基初始pH為7.5～8.0時，菌株具有較高的產酶能力，最適產酶pH為8.0。

調節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH，考察初始pH對Microbulbifer sp. ALW1生長以及產酶的影響。結果如圖1所示：隨著pH增加，Microbulbifer sp. ALW 1的生物量呈現略有上升的趨勢。在pH 5～9之間，菌株均可以產酶，比報道的pH范圍寬，但是產酶量受不同的培養(yǎng)基pH影響。隨著培養(yǎng)基pH的升高，酶活力呈現先增大后減小的趨勢，初始pH為7.5時，產酶量最高，達到111.6 U/mL。

圖1　初始pH對微泡菌ALW 1生長以及產酶的影響

2.1.2裝液量對產酶的影響

通常，在搖瓶培養(yǎng)過程中，裝液量過大不利于供氧，從而影響菌體的生長以及產酶。傅曉妍等［18］對褐藻膠裂解酶產生菌Vibrio sp. QY102的發(fā)酵條件進行研究，得出在250 mL的三角瓶中裝液量為25 mL時，酶產量最大，并且隨著裝液量增加酶產量降低。

按照不同的裝液量培養(yǎng)Microbulbifer sp. ALW1，發(fā)酵結束后檢測生物量及酶活力，結果如圖2所示。由圖2可以看出：生物量隨著裝液量的增加而無明顯變化，當裝液量小于50 mL時，隨著裝液量的增加，菌株的產酶量也隨之增加；裝液量為50 mL時，酶活力最高為118.9 U/mL；裝液量在50～90 mL范圍內，褐藻膠裂解酶活力基本保持不變；裝液量繼續(xù)增加，褐藻膠裂解酶活力開始下降。這說明過高的裝液量使得供氧受到了限制，導致微生物的產酶受到了影響。

圖2　裝液量對微泡菌ALW 1生長以及產酶的影響

2.1.3接種量對產酶的影響

接種量多少對發(fā)酵過程中的延滯期長短以及對數生長期菌體的生長情況都有較大的影響。接種量過少會使菌體生長緩慢，培養(yǎng)時間增加；接種量過多則會使菌體大量繁殖，消耗大量營養(yǎng)，不利于產酶。李恒等［19］對菌株Halomonas sp. WF6產褐藻膠裂解酶的發(fā)酵條件進行研究，得出當接種量為2%時，產酶量最高。

接種量對Microbulbifer sp. ALW1生長和產酶的影響如圖3所示：接種量小于5%時，生物量緩慢增加，酶產量則迅速增大；當接種量大于10%時，生物量增加速度加快，而酶產量迅速減小，說明接種量過大利于菌株生長而不利于產酶；接種量為5%時，酶活力達到最大為125.4 U/mL。

圖3　接種量對微泡菌ALW 1生長以及產酶的影響

2.1.4溫度對產酶的影響

發(fā)酵溫度影響發(fā)酵液的理化性質及微生物的代謝調控機制，因此在發(fā)酵過程中需要維持適宜的溫度才能保證菌體的正常生長代謝。李悅明等［16］對發(fā)酵產褐藻膠裂解酶菌株培養(yǎng)溫度進行研究，得出該菌株在32℃時產酶量最大。Fu等［20］對菌株Vibrio sp. YKW-34產褐藻膠裂解酶的條件進行研究，得出該菌株在20～30℃能較好的生長，25℃為其最佳產酶溫度。

實驗研究了溫度對Microbulbifer sp. ALW1生長及產酶的影響。結果如圖4所示：溫度在20～25℃范圍，酶活力隨著溫度的升高而升高；溫度大于25℃時，酶活力迅速下降，25℃為該菌株產褐藻膠裂解酶的最適溫度，酶活力為117.1 U/ mL。ALW1在20～40℃范圍內均能較好生長，說明溫度對產酶的影響大于對菌株生長的影響，可能是因為菌株的生長與褐藻膠裂解酶的產生不關聯，也可能是溫度影響酶的穩(wěn)定性。

圖4　溫度對微泡菌ALW 1生長以及產酶的影響

2.2響應面分析法優(yōu)化發(fā)酵條件

應用SPSS Statistics 17.0對單因素結果進行方差分析，方差分析所得各因素P值：溫度（P= 0），裝液量（P=0.343），接種量（P=0.022），pH（P= 0.026），其中裝液量P值大于0.05，對酶活力影響不顯著，故對酶活力影響顯著因素為溫度、接種量、pH。根據Box-Behnken實驗設計原理，進行3因素3水平的試驗設計，分析因素及設計見表1。

表1　響應面試驗因素水平表

根據試驗結果，利用Design Expert軟件進行回歸分析，經回歸擬合后，得到回歸方程：

Y =-1 284.44 +23.64A +80.95B +217.71C -0.66AB+0.24AC-2.48BC-0.46A2-3.51B2-12.86C2

對回歸模型方差分析，結果見表2。當“Pro＞F”值小于0.05表明該指標顯著，由表3可以看出：整體模型P值略大于0.001，說明模型比較顯著，失擬項為0.074 0，失擬項大于0.05失擬項不顯著，說明回歸方程擬合程度較好。校正決定系數R2=0.932 0進一步說明預測值與真實值相關性好。表中一次項B（P=0.000 2）、C（P=0.002 2）對結果有顯著影響，A （P=0.191 7）則不顯著；二次項中A2（P=0.057 0）對結果不顯著，B2（P=0.001 1）、C2（P=0.040 5）都對結果有顯著影響；交互項中AC（P=0.803 2）、AB（P= 0.080 2）、BC（P=0.159 8）均不顯著。表明響應值與各項之間都有很大關系，各因子與響應值之間的關系不是簡單的線性關系所能滿足。

表2　回歸模型的方差分析

各變量之間對響應值的影響可以通過三維響應面圖和等高線圖進行分析并解釋，根據回歸方程做出響應面回歸分析圖，如圖5所示：圖（a1）表示由溫度和接種量為變量生成的響應面圖，當溫度一定時，酶活力隨著接種量增加而增加，等高線的形狀可以顯示兩因素的交互效應強弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，處于同一曲線上的酶活力值相等；從圖（a2）中可以看出溫度與接種量兩因素交互作用顯著，它們呈現的等高線為橢圓形，響應面立體圖開口向下，可以看出響應值增大到極值點后，各因素值繼續(xù)增大，響應值則隨之減小；圖（b1）表示以溫度與pH為變量生成的響應面圖，從（b2）可知兩者交互作用不明顯，pH對結果的影響比溫度顯著，表現在響應面曲面的變化幅度更加顯著；圖（c1）表示發(fā)酵溫度固定的情況下，以接種量和pH為變量生成的響應面圖，等高線為橢圓形，但方差分析中兩因素的P=0.1598，說明兩因素存在一定的交互作用，接種量在6%～8%之間，pH在8～8.5之間酶活力可得到最大值。

圖5　溫度、接種量、pH對褐藻膠裂解酶活力影響的響應面圖及等高線圖

2.3試驗結果驗證

根據回歸模型，得出Box-Behnken實驗最優(yōu)組合為溫度23.01℃，接種量6.54%，起始pH 8.04，在此條件下褐藻膠裂解酶活力為127.8 U/ mL。經過修正，選擇溫度23℃，接種量6.5%，起始pH 8.0，進行3次重復試驗進行驗證，得到褐藻膠裂解酶酶活力平均值為130 U/mL，與預測值127.8 U/mL接近，說明該模型與實驗數據擬合較好。

將優(yōu)化結果與方法中的初始發(fā)酵條件進行比較（圖6），由圖6可知：初始條件下酶活力為111.6 U/mL，優(yōu)化后酶活力達到130 U/mL，較優(yōu)化前提高16.5%，優(yōu)化效果顯著。

圖6　初始條件和優(yōu)化后的的酶活力

3　結　論

本實驗通過單因素和Box-Behnken設計對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，建立了發(fā)酵條件影響微泡菌ALW1產酶的二次多項數學模型，并對該模型進行顯著性檢驗，根據該模型確定了產褐藻膠裂解酶的最佳發(fā)酵條件：培養(yǎng)基初始pH 8.0，接種量6.5%，裝液量50 mL，溫度23℃，褐藻膠裂解酶活力達到130 U/mL，比初始的111.6 U/mL提高了16.5%。

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（責任編輯：朱小惠）

Response surface optim ization of fermentation conditions for alginate lyase production by M icrobulbifer sp. ALW 1

LI Yongxing1，YANG Fan1，JIANG Zedong1，2，3，NI Hui1，2，3，YANG Qiuming1，2，3，XIAO Anfeng1，2，3
（1. College of Food and Biological Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China；
2. Fujian Provincial Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering，Xiamen 361021，China；3. Key Laboratory of Systemic Utilization and In-depth Processing of Economic Seaweed，Xiamen Southern Ocean Technology Center of China，Xiamen 361021，China）

Abstract：In this study，the optimization of fermentation conditions for alginate lyase production by Microbulbifer sp. ALW1 was carried out by single factor experiment and response surface analysis. The optimal fermentation conditions were obtained by single factor as follows：initial pH 7.5，inoculation volume 5%，liquid volume 50 mL，temperature 25℃. Box-Behnken design and response surface analysis were further used to optimize fermentation conditions on the basis of single factor test. The final optimum fermentation conditions as follows：initial pH 8.0，inoculum volum 6.5%，liquid volume 50 mL，temperature 23℃. The alginate lyase activity reached 130 U/ mL，which was 16.5%higher than that of the initial conditions.

Keywords：Microbulbifer sp. ALW1；alginate lyase；response surface analysis；conditions optimization

作者簡介：李永幸（1988—），男，河南商丘人，碩士研究生，主要研究方向為微生物發(fā)酵與酶工程，E-mail：liyongxing03 @sina.com.通信作者：肖安風教授，E-mail：xxaaffeng@jmu.edu.cn.

基金項目：國家海洋公益性行業(yè)科研專項（201505033）；福建省科技重大專項專題項目（閩科計［2015］66號）；福建省高校產學合作項目（2016N5008）

收稿日期：2016-01-20

中圖分類號：TQ92

文獻標志碼：A

文章編號：1674-2214（2016）02-0075-06