董正偉，朱芳瑩，朱文淵，田宋奎，柳志強(qiáng)（1.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310014；2.生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程研究中心，浙江杭州310014）

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轉(zhuǎn)氨酶的固定化及酶學(xué)性質(zhì)研究

董正偉1,2，朱芳瑩1,2，朱文淵1,2，田宋奎1,2，柳志強(qiáng)1,2
（1.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310014；
2.生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程研究中心，浙江杭州310014）

摘要：利用環(huán)氧樹脂載體進(jìn)行固定化轉(zhuǎn)氨酶的研究，通過單因素優(yōu)化確定了較優(yōu)的酶固定化條件：ES-103b樹脂載體、轉(zhuǎn)氨酶和輔酶磷酸吡哆醛最佳質(zhì)量比為50：6：5，在pH為7.0的1 mol/L磷酸鉀緩沖液介質(zhì)中吸附25 h。將得到的固定化顆粒重新置于pH為9.0的100 mmol/L磷酸鉀緩沖液中，30℃保溫30 h。取出后置于pH為8.5的3 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液中，25℃保溫12 h，制得固定化轉(zhuǎn)氨酶，其比活力為52.7 U/g（濕載體），酶活回收率達(dá)到49.3%。酶學(xué)性質(zhì)研究表明：固定化轉(zhuǎn)氨酶催化反應(yīng)最適pH、溫度分別為7.0、50℃；固定化酶熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性明顯提高，50℃條件下的半衰期為20.2 d；在pH 8.0的三乙醇胺緩沖液中（4℃），10 d后酶活仍保持初始酶活的82.3%。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)氨酶；固定化；磷酸吡哆醛；比酶活；酶學(xué)性質(zhì)

轉(zhuǎn)氨酶（Aminotransferases，ATs）是一類磷酸吡哆醛依賴性酶，普遍存在于自然界中，在生物體內(nèi)催化氨基由氨基供體向氨基受體的轉(zhuǎn)移反應(yīng)。轉(zhuǎn)氨酶具有較高的立體選擇性、區(qū)域選擇性，較高的反應(yīng)速率與穩(wěn)定性［1］，廣泛應(yīng)用于合成天然及非天然氨基酸、手性胺、氨基醇等重要醫(yī)藥及農(nóng)藥中間體。其中，手性胺在制藥工業(yè)中需求不斷增長［2］，而轉(zhuǎn)氨酶的出現(xiàn)則為手性胺的合成提供了一種新方法。

抗糖尿病新藥Januvia的主要成分西他列汀是一種R-型手性胺。轉(zhuǎn)氨酶參與西他列汀合成中關(guān)鍵步驟，即催化西他列汀前體酮不對稱合成西他列汀。默克公司利用一種改造的轉(zhuǎn)氨酶在200 g/L底物質(zhì)量濃度下，24 h內(nèi)轉(zhuǎn)化率達(dá)到92%，e.e.值大于99.5%［3］。

酶固定化技術(shù)發(fā)展于上世紀(jì)50年代，常用的固定化酶方法主要包括物理吸附、共價結(jié)合、交聯(lián)法和包埋法［4］。固定化酶實(shí)現(xiàn)催化劑重復(fù)利用，反應(yīng)體系與催化劑易于分離，簡化了生產(chǎn)工藝。Truppo等［5］成功地將西他列汀轉(zhuǎn)氨酶固定在一種多孔疏水樹脂SEPABEAD EXE120表面。固定化酶以乙酸異丙酯作為反應(yīng)介質(zhì)，在200 g/L底物質(zhì)量濃度下，重復(fù)使用10批，轉(zhuǎn)化率始終保持在90%以上。

本文采用高孔容、高比表面積的ES-103b環(huán)氧基樹脂載體對本實(shí)驗(yàn)室獲得的轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行固定化工藝研究，考察了酶濃度、pH、磷酸鹽濃度、溫度、時間、輔酶濃度對固定化效果影響，并對固定化酶部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行考察。

1　材料與方法

1.1主要材料及試劑

ES-103b樹脂，天津南開和成科技有限公司；產(chǎn)轉(zhuǎn)氨酶的大腸桿菌由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏；BCA蛋白測定試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；西他列汀前體酮、西他列汀均由浙江永太科技股份有限公司提供；磷酸吡哆醛購自西格瑪公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1固定化參數(shù)測定

取10 mL反應(yīng)液（如表1所示）于50 mL搖瓶中，并加入1 mmol/L的PLP，在45℃恒溫?fù)u床中預(yù)熱4～5 min，準(zhǔn)確稱取0.5 g固定化酶或者500 μL固定化酶液于搖瓶中。45℃，150 r/min振蕩反應(yīng)2 h，取樣700 μL，通過HPLC檢測產(chǎn)物西他列汀含量，計算酶活。比酶活定義如下：在45℃，pH 8.5條件下，1 g轉(zhuǎn)氨酶凍干粉/固定化酶每小時生成西他列汀的物質(zhì)的量（μmol）。

酶活回收率（%）=固定化酶活/初始酶液總酶活×100

蛋白吸附率（%）=（初始蛋白濃度-殘余蛋白濃度）/初始蛋白濃度×100，蛋白濃度采用BCA試劑盒測定

表1　酶活測定反應(yīng)體系

1.2.2酶源［3］

實(shí)驗(yàn)室自制轉(zhuǎn)氨酶凍干粉作為固定化酶源。

1.2.3固定化載體篩選

以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的8種環(huán)氧樹脂ES-103b、ES-105（pore size，300～450 μm）、ES-105（pore size，150～300 μm）、LX -1000、ES -1、MC150EP、MC300EP、ES-1制作的固定化酶連續(xù)進(jìn)行4批次催化實(shí)驗(yàn)，篩選較為理想的載體。固定化酶制備方法如下：稱量0.02 g轉(zhuǎn)氨酶凍干粉溶解于10 mL pH 7.0的100 mmol/L三乙醇胺緩沖液中，加入1 g環(huán)氧載體及1 mmol/L輔酶PLP，置于25℃水浴搖床中，150 r/min孵育過夜，抽濾并用蒸餾水清洗兩遍得固定化酶。在10 mL催化體系（表1）中稱量加入1 g固定化酶，置于45℃，150 r/min水浴搖床中開始反應(yīng)，24 h取樣測定產(chǎn)物濃度并計算底物轉(zhuǎn)化率。

1.2.4固定化工藝參數(shù)優(yōu)化

1）酶濃度對固定化酶活的影響

配制pH為7.0的100 mmol/L磷酸鹽緩沖液，分別加入一定量轉(zhuǎn)氨酶凍干粉分別配制成質(zhì)量濃度為1、3、6、9、12、15 g/L的均一酶液（含有濃度為2 mmol/L的PLP）。取10 mL酶液加入50 mL搖瓶中，并準(zhǔn)確稱量加入0.5 g ES-103b樹脂，置于25℃水浴搖床中，150 r/min振蕩孵育10 h后取上清殘余酶液測定蛋白濃度，抽濾得固定化酶，用蒸餾水洗滌兩遍，進(jìn)行酶活測定。計算蛋白吸附率、酶活回收率。

2）鹽離子濃度對固定化酶活的影響

配制pH 7.0，濃度分別為250、500、1 000、1 500、2 000 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，取10 mL緩沖液（含有濃度為2 mmol/L的PLP）加入0.06 g轉(zhuǎn)氨酶凍干粉及0.5 g ES-103b樹脂載體，置于25℃水浴搖床中，150 r/min振蕩孵育10 h，抽濾得固定化酶，并用蒸餾水洗滌兩遍，進(jìn)行酶活測定。

3）pH對固定化酶活的影響

配制濃度為1 mol/L，pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的磷酸鹽緩沖液。在10 mL緩沖液（含有濃度為2 mmol/L PLP）中加入0.06 g轉(zhuǎn)氨酶凍干粉及0.5 g ES-103b樹脂載體，置于25℃水浴搖床中，150 r/min振蕩孵育10 h，抽濾得固定化酶，并用蒸餾水洗滌兩遍，進(jìn)行酶活測定。

4）溫度對固定化酶活的影響

配制pH為7.0的1 mol/L磷酸鹽緩沖液，在10 mL緩沖液（含有濃度為2 mmol/L PLP）中加入0.06 g轉(zhuǎn)氨酶凍干粉及0.5 g ES-103b樹脂載體，分別置于20、25、30、35、40℃溫度條件下，150 r/ min震蕩孵育10 h，抽濾得固定化酶，并用蒸餾水洗滌兩遍，進(jìn)行酶活測定。

5）固定化時間對固定化酶活的影響

配制pH為7.0的1 mol/L磷酸鹽緩沖液，在10 mL緩沖液（2 mmol/L PLP）中加入0.06 g轉(zhuǎn)氨酶凍干粉及0.5 g ES-103b樹脂載體，置于25℃水浴搖床中，150 r/min振蕩孵育2、5、10、15、20、25 h后取出，抽濾得固定化酶，并用蒸餾水洗滌兩遍，進(jìn)行酶活測定。

6）輔酶濃度對固定化酶活的影響

本實(shí)驗(yàn)將固定化酶體系中輔酶濃度分別設(shè)定為0、1、2、4、6 mmol/L，考察輔酶濃度對固定化效果影響。在10 mL pH為7.0的1 mol/L磷酸鹽緩沖液中加入0.06 g轉(zhuǎn)氨酶凍干粉及0.5 g樹脂載體，置于25℃水浴搖床中，150 r/min孵育25 h，抽濾得固定化酶，并用蒸餾水洗滌兩遍，進(jìn)行酶活測定。

根據(jù)文獻(xiàn)報道的環(huán)氧樹脂固定化酶成熟工藝流程，本文將第一階段得到的固定化酶加入pH 為9.0的100 mmol/L磷酸鹽緩沖液（20%甘油）中，30℃保溫處理30 h，在此階段酶蛋白與樹脂表面的環(huán)氧基形成多個共價鍵。之后將保溫處理后得到的固定化酶加入pH為8.5的3 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液中，在25℃條件下保溫12 h，除去未反應(yīng)的環(huán)氧基。本實(shí)驗(yàn)利用得到的固定化酶進(jìn)行以下部分的酶學(xué)性質(zhì)研究。

1.2.5固定化酶學(xué)性質(zhì)

1）固定化酶催化反應(yīng)最適pH確定

配制底物質(zhì)量濃度為10 g/L的反應(yīng)液（參照表1所示），用濃鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH分別為6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5，并將反應(yīng)體系定容至20 mL。取10 mL反應(yīng)液加入50 mL磁力攪拌反應(yīng)釜中，準(zhǔn)確稱量0.25 g固定化酶加入其中，利用4 mol/L異丙胺溶液控制反應(yīng)體系pH，在45℃，300 r/min條件下，催化反應(yīng)2 h后取樣700 μL，測定產(chǎn)物濃度。每個pH條件重復(fù)三次，并做不加固定化酶的空白對照實(shí)驗(yàn)。

2）固定化酶催化反應(yīng)最適溫度確定

配制pH為8.0，底物質(zhì)量濃度為10 g/L的反應(yīng)液10 mL，加入50 mL磁力攪拌反應(yīng)釜中，精確稱量0.25 g固定化酶加入其中，分別設(shè)置反應(yīng)溫度為30、40、45、50、55、60、70、80℃，其他反應(yīng)條件如1.3.5第1部分所述，每個溫度條件重復(fù)三次，并做空白對照。

3）固定化酶pH穩(wěn)定性研究

配制100 mmol/L，pH分別為7.0、8.0、9.0的TEA緩沖液，稱量一定固定化酶分別加入相應(yīng)的緩沖液中，均置于4℃冰箱儲存。每隔24 h取出，準(zhǔn)確稱量0.5 g固定化酶，進(jìn)行酶活檢測。酶活檢測方法如1.3.1所示。

4）固定化酶熱穩(wěn)定性研究

配制三份pH 8.0的TEA緩沖液，稱量一定量的固定化酶加入三份緩沖液中，并分別置于40、50、60℃水浴保溫。每隔24 h取出，準(zhǔn)確稱量0.5 g固定化酶，進(jìn)行酶活檢測。酶活檢測方法如1.3.1所述。

2　結(jié)果及討論

2.1固定化載體篩選

環(huán)氧樹脂載體由于孔徑、粒徑、環(huán)氧值等材料參數(shù)存在差異，固定化效果受到影響。本文從實(shí)驗(yàn)室已有的環(huán)氧樹脂中篩選適合轉(zhuǎn)氨酶固定化的載體，結(jié)果如圖1所示。

圖1　固定化酶載體篩選

由圖1可以看出：以ES-105（300～450 μm），ES-103b，Sepabeads EC-EP作為載體得到的固定化酶活性及操作穩(wěn)定性較好；其中Sepabeads ECEP固定化酶穩(wěn)定性最好，但酶活較差，原因可能是樹脂表面環(huán)氧基密度較小，因此固定在表面的酶蛋白較少［6］；ES-105（300～400 μm）樹脂載體雖然孔徑與其他兩種樹脂相同，但粒徑較大，因此比表面積較小，可能會存在較強(qiáng)的擴(kuò)散限制等問題［7］，不利于后期的催化反應(yīng)。綜上考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇ES-103b作為固定化酶載體，其在未優(yōu)化前固定化酶活為28 U/g，酶活測定方法如1.3.1所示。

2.2固定化體系酶濃度確定

在固定化酶的研究中，載體的投放量必須與所固定化的酶液中蛋白含量一致才能達(dá)到理想的效果，否則會造成酶蛋白或載體的浪費(fèi)，增加固定化成本［8］。

本實(shí)驗(yàn)通過改變固定化體系加酶量，考察酶液濃度對固定化影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出：隨著酶濃度增加，固定化酶活增加，速度減緩，但酶活回收率及蛋白吸附率卻在不斷減小，可能是因?yàn)楣潭ɑd體表面可利用的環(huán)氧基逐漸達(dá)到飽和；在圖中也可以看出蛋白吸附率始終高于酶活回收率，原因是在固定化過程中酶蛋白發(fā)生了構(gòu)象改變或者是活性位點(diǎn)被遮蓋，導(dǎo)致固定化酶活性降低［6］；當(dāng)固定化酶質(zhì)量濃度為12 g/L時，固定化酶活達(dá)到峰值63 U/g，之后又出現(xiàn)小幅下降，可能是因?yàn)檫^量的固定化酶在孔道內(nèi)部形成了一定空間位阻效應(yīng)，影響底物及產(chǎn)物內(nèi)擴(kuò)散［9］。考慮到催化劑及載體成本，本實(shí)驗(yàn)選擇6 g/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)固定化體系酶濃度，此時固定化酶活為48 U/g。

圖2　酶濃度對固定化影響

2.3固定化體系鹽離子濃度確定

在環(huán)氧樹脂固定化第一階段，增加溶液中鹽離子濃度在一定程度上可以促進(jìn)酶蛋白吸附在樹脂疏水表面，增加環(huán)氧基團(tuán)與酶蛋白氨基形成共價鍵的幾率。本實(shí)驗(yàn)以磷酸鉀鹽考察鹽離子濃度對固定化效果影響，結(jié)果如圖3所示：固定化酶活回收率及比酶活均隨磷酸鹽濃度先升高再下降，在磷酸鹽濃度1 mol/L時，酶活回收率與固定化酶活達(dá)到最高87 U/g；而在磷酸鹽濃度較高的情況下，游離酶蛋白可能出現(xiàn)鹽析、凝聚等現(xiàn)象，從而堵塞載體孔徑通道，或是僅僅簡單吸附在樹脂顆粒的外表面，從而影響固定化效果。綜上考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇1 mol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)固定化酶體系磷酸鹽濃度。

圖3　磷酸鹽濃度對固定化影響

2.4固定化酶體系pH確定

酶液pH會影響到酶蛋白側(cè)鏈氨基的解離形式，進(jìn)而影響到其與環(huán)氧基團(tuán)的反應(yīng)效率。本實(shí)驗(yàn)配制了不同pH的固定化酶液，考察pH對固定化影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出：固定化酶活回收率與固定化酶活均呈現(xiàn)隨pH升高先上升然后下降的趨勢，在pH 5.0時達(dá)到最大值57U/g。固定化酶體系在強(qiáng)酸及強(qiáng)堿性環(huán)境下，游離酶發(fā)生不同程度的變性失活，并出現(xiàn)蛋白沉淀析出，從而使得固定化酶活較低。

圖4　pH對固定化影響

我們通過軟件BioXM分析得知，本課題所用的轉(zhuǎn)氨酶等電點(diǎn)為5.0左右。在pH 5.0環(huán)境中，酶蛋白可能出現(xiàn)凝聚并沉積在樹脂表面，導(dǎo)致固定化酶活較高，而此時酶蛋白可能只是附著在載體顆粒的外表面，容易脫落進(jìn)入溶液中，最終得到的固定化酶穩(wěn)定性可能較差。為了避免這些問題，本部分補(bǔ)加了對pH 5.0、6.0、7.0條件下得到的固定化酶操作穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，每個批次反應(yīng)2 h，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出：當(dāng)固定化體系pH 5.0時，固定化酶在第二批反應(yīng)時活力迅速下降，可能是由于酶蛋白簡單吸附在樹脂外表面，沒有進(jìn)入顆粒內(nèi)部，在反應(yīng)時被洗脫下來；而在中性環(huán)境中酶蛋白分子以可溶的形式存在，活力較為穩(wěn)定［6］，可以自由地與載體表面的環(huán)氧基結(jié)合。綜上考慮，本文選擇在pH 7.0條件下進(jìn)行酶固定化。

圖5　固定化pH對固定化酶操作穩(wěn)定性考察

2.5固定化溫度對固定化影響

酶蛋白氨基酸殘基與環(huán)氧基團(tuán)形成共價鍵過程也屬于一種化學(xué)反應(yīng)，高溫有利于加快反應(yīng)速度，但催化劑屬于生物大分子，在高溫下可能會出現(xiàn)變性失活。因此選擇一個合適的固定化溫度對固定化影響較大。本實(shí)驗(yàn)分別在20、25、30、35、40℃條件下考察溫度對固定化效果影響。結(jié)果如圖6所示：固定化酶活隨溫度先升高后降低，在25℃時取得最大值80.39 U/g；當(dāng)溫度超過30℃時固定酶活性逐漸降低，可能是溶液中游離酶蛋白在吸附到固定化載體表面前便出現(xiàn)變性失活。綜上本文確定25℃作為固定化溫度。

圖6　固定化溫度對固定化影響

2.6固定化時間的確定

固定化時間長短影響固定化效果，固定化時間太短，酶蛋白不能進(jìn)入樹脂內(nèi)部而吸附在樹脂表面。本部分實(shí)驗(yàn)探究了固定化酶活隨時間變化趨勢，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出：當(dāng)固定化反應(yīng)進(jìn)行到5 h時固定化酶活即達(dá)到峰值，說明酶蛋白第一階段吸附作用比較迅速；在10 h時固定化酶活稍有下降，可能是吸附的酶蛋白又重新溶解到溶液中；如果再延長固定化時間，酶活基本保持不變?？紤]到第二階段固定化過程中酶蛋白可能大量脫離載體表面，為了確保最終的固定化酶活，本實(shí)驗(yàn)將固定化時間延長至25 h。

圖7　固定化時間對固定化影響

2.7固定化輔酶濃度的確定

轉(zhuǎn)氨酶為PLP依賴型酶，在游離細(xì)胞或酶催化反應(yīng)中需要額外添加輔酶，而輔酶回收困難較大，因此造成極大浪費(fèi)。本課題將轉(zhuǎn)氨酶與輔酶共固定化，轉(zhuǎn)氨酶與輔酶可以在反應(yīng)結(jié)束后同時從反應(yīng)液中分離，實(shí)現(xiàn)重復(fù)利用，從而進(jìn)一步降低了催化成本。本節(jié)對固定化時輔酶濃度進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。由圖8可知：當(dāng)輔酶濃度大于2 mmol/L時固定化酶活趨于穩(wěn)定。為了避免輔酶的浪費(fèi)，本文確定固定化時輔酶濃度為2 mmol/L，此時固定化比酶活為77.23 U/g。

圖8　固定化輔酶濃度對固定化酶穩(wěn)定性影響

將第一階段得到的固定化酶進(jìn)行第二、三階段處理，最終得到的固定化酶活為52.7 U/g。與未優(yōu)化前相比，酶活提高了88.5%，酶活回收率提高至49.3%。

2.8固定化酶催化反應(yīng)最適pH確定

酶固定化載體攜帶的部分電荷可能會改變固定化酶周圍微環(huán)境pH，進(jìn)而導(dǎo)致固定化酶pH—活性曲線發(fā)生一定的遷移。圖9為固定化酶的pH—活性曲線。由圖可知：固定化酶活在中性及弱堿性條件下變化不大，在pH 8.5～9.0范圍內(nèi)固定化酶活最高，當(dāng)pH超過9.0時酶活迅速下降。與游離酶相比，固定化酶的最適pH基本不變。由于環(huán)氧樹脂載體表面呈中性，因此酶的固定化不會對其所處的微環(huán)境pH構(gòu)成影響。

隨著轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的進(jìn)行，異丙胺不斷消耗、揮發(fā)，導(dǎo)致反應(yīng)體系pH持續(xù)降低。而在中性及弱堿性條件下，固定化酶對pH變化不敏感，活力較為穩(wěn)定，在工業(yè)中可以減少對酸堿控制的依賴。綜上考慮，本實(shí)驗(yàn)確定pH 8.0作為后續(xù)催化反應(yīng)最適pH。

圖9　pH對固定化酶催化反應(yīng)影響

2.9固定化酶催化反應(yīng)最適溫度確定

與游離酶相比，固定化酶熱穩(wěn)定性增加的同時，催化反應(yīng)最適溫度也會發(fā)生改變。圖10為固定化轉(zhuǎn)氨酶的溫度—活性曲線。由圖可知：固定化酶最適反應(yīng)溫度為65℃，當(dāng)超過65℃時酶活迅速下降。與游離酶相比固定化酶最適反應(yīng)溫度提高了10℃，可能是由于酶蛋白在載體表面形成多個共價鍵，分子剛性增加，或者酶活中心被載體遮擋，亦或是酶蛋白在樹脂孔道內(nèi)形成一定空間位阻，底物及產(chǎn)物擴(kuò)散阻力較大，綜合因素導(dǎo)致催化反應(yīng)需要更多能量攝入。而底物西他列汀前體酮當(dāng)溫度超過50℃時會出現(xiàn)自發(fā)分解，因此本實(shí)驗(yàn)將固定化酶催化反應(yīng)溫度設(shè)定為50℃。

圖10　溫度對固定化酶催化反應(yīng)影響

2.10固定化酶pH穩(wěn)定性的考察

本部分實(shí)驗(yàn)考察了固定化轉(zhuǎn)氨酶在不同pH條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖11所示：固定化酶在pH 8.0條件下較為穩(wěn)定，10 d后酶活仍保持有初始酶活的82.3%，具有較好的pH穩(wěn)定性。

圖11　固定化酶pH穩(wěn)定性

2.11固定化酶溫度穩(wěn)定性的考察

溫度穩(wěn)定性是固定化酶最重要的一個屬性。本實(shí)驗(yàn)考察固定化轉(zhuǎn)氨酶在40、50、60℃條件下的溫度穩(wěn)定性，結(jié)果如圖12所示。

圖12　固定化酶溫度穩(wěn)定性

由圖12可以看出：在各種溫度條件下，隨著時間延長，固定化酶活均緩慢降低。本文以初始酶活為100%，計算不同時間點(diǎn)相對酶活，并與時間進(jìn)行線性擬合及計算分析。固定化酶在40、50、60℃條件下的失活常數(shù)分別為0.020 9，0.034 3，0.083 5 d-1，半衰期分別為33.1、20.2、8.3 d，40℃條件下酶活較為穩(wěn)定，10 d后固定化酶活還保持有初始酶活的77.2%。

3　結(jié)論

本文首先通過對幾種環(huán)氧樹脂載體進(jìn)行篩選，確定ES-103b作為本課題所用的固定化酶載體。其次優(yōu)化了固定化過程中重要參數(shù)，如酶濃度、pH、磷酸鹽濃度、溫度、輔酶濃度、時間。并根據(jù)成熟的環(huán)氧樹脂固定化方法對轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行固定化，最終的固定化工藝如下：ES-103b樹脂載體、轉(zhuǎn)氨酶和輔酶磷酸吡哆醛以質(zhì)量比為50：6：5，加入pH為7.0的1 mol/L磷酸鉀緩沖液中，室溫振蕩吸附25 h。將得到的固定化顆粒重新置于pH 為9.0的100 mmol/L磷酸鉀緩沖液中，30℃保溫30 h。取出再置于pH為8.5的3 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液中，25℃保溫12 h，制得固定化轉(zhuǎn)氨酶，其比活力為52.7 U/g，酶活回收率達(dá)到49.3%，與未優(yōu)化前相比，酶活提高了88%。之后，我們對獲得的固定化轉(zhuǎn)氨酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了研究。固定化酶催化反應(yīng)最適溫度為50℃，最適pH 為8.0，在中性及弱堿性條件下固定化酶催化活力變化不大，pH高于9.0時酶活降低迅速。固定化酶在40、50、60℃條件下半衰期分別為33.1、20.2、8.3 d。在pH 8.0條件下固定化酶穩(wěn)定性較好，10 d后酶活還保持有初始酶活的82.3%左右，熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性優(yōu)良，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Immobilization of transam inase and characterization of its enzymatic properties

DONG Zhengwei1，2，ZHU Fangying1，2，ZHU Wenyuan1，2，TIAN Songkui1，2，LIU Zhiqiang1，2
（1. Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province，College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang
University of Technology，Hangzhou 310014，China；
2. Engineering Research Center of Bioconversion and Biopurification of the Ministry of Education，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Abstract：This study focused on the transaminase immobilization using epoxy-activated resin as support. Optimal conditions for immobilization were as follows：Resin ES-103b，lyophilized enzyme and PLP were added into 1 mol/L potassium phosphate solution（pH 7.0）at the ratio of 50：6：5 and incubated at room temperature for 25 h. The obtained immobilized enzyme was placed into 100 mmol/L potassium phosphate buffer（pH 9.0）for 30 h at 30℃，followed by its incubation in 3 mol/ L Glycine-NaOH buffer（pH 8.5）at 25℃for 12 h. The activity of immobilized enzyme was determined as 52.7 U/g（wet support）with activity recovery of 49.3%. The enzymatic characteristics of the immobilized transaminase were investigated. The optimal reaction temperature and pH were 50 ℃and 8.0，respectively. The immobilized transaminase possessed an improved pH and thermal stability. The half-time of the immobilized enzyme at 50℃was 20.2 d. The immobilized transaminase remained 82.3%of the original activity after 10 d of storage in TEA buffer（pH 8.0）at 4℃. Keywords：transaminase；immobilization；PLP；specific activity；enzymatic properties

作者簡介：董正偉（1989—），男，山東泰安人，碩士，主要從事發(fā)酵及生物催化方面研究，E-mail：937143668@qq.com.通信作者：柳志強(qiáng)教授，E-mail：microliu@zjut.edu.cn.

收稿日期：2015-05-25

中圖分類號：Q814

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1674-2214（2016）02-0081-07