吳石金，戴安迪（浙江工業(yè)大學生物工程學院，浙江杭州310014）

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L-瓜氨酸生產菌株的篩選及鑒定

吳石金，戴安迪
（浙江工業(yè)大學生物工程學院，浙江杭州310014）

摘要：通過選擇性培養(yǎng)基初篩（利用精氨酸雙水解酶篩選培養(yǎng)基）和復篩（高效液相色譜法測定L-瓜氨酸質量濃度），從杭州市勾莊地區(qū)西瓜大棚的土壤中篩選獲得45株產L-瓜氨酸菌株。其中一株細菌（菌株編號11）轉化L-精氨酸生產L-瓜氨酸的能力最強，產生的L-瓜氨酸濃度最高，0.344 g濕菌，在60 mL轉化體系中轉化一天，可將20 g/L的底物L-精氨酸轉化為9.31 g/L的L-瓜氨酸。對11號菌株分別進行形態(tài)學觀察，生理生化試驗及分子生物學鑒定，初步鑒定該菌株為糞腸球菌（Enterococcus faecalis）。

關鍵詞：L-瓜氨酸；糞腸球菌；篩選鑒定

L-瓜氨酸（L-citrulline）是人體尿素循環(huán)中的一種代謝中間產物，有利尿作用，臨床上常與L-精氨酸、L-鳥氨酸等共同用于治療高氨血癥［1］。近年來，眾多國內外研究表明L-瓜氨酸還具有很多其他重要的生理功能，如清除有害的自由基、抗氧化、穩(wěn)定血壓、指示異體排斥效應［2-3］，瓜氨酸還可松弛血管，增強男性性功能，以及治療性功能障礙［4］。

目前，生產L-瓜氨酸的方法主要有生物發(fā)酵法、化學合成法、提取法和酶法。發(fā)酵法生產L-瓜氨酸的缺點是產率低［5］；化學法生產的產品中含有L-瓜氨酸的旋光對映體D-瓜氨酸［6］；提取法的生產工藝相對困難，產品很難純化，因此成本比較高；酶法的優(yōu)點是生產條件溫和，產品中無D型旋光對映體產生［11］。酶法生產L-瓜氨酸是一種效率高、成本低的生產方法，將在瓜氨酸生產中起到重要作用［7-9］。已有報道利用銅綠假單胞菌［10］、惡臭假單胞菌［11］、乳酸乳球菌［12］等提取精氨酸脫亞胺酶，轉化生產L-瓜氨酸，但瓜氨酸產量低，工藝也尚不成熟。轉化能較強的菌株將在未來瓜氨酸生產中扮演重要角色。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1實驗材料

土壤樣品：杭州市勾莊地區(qū)西瓜大棚土壤表層5～10 cm的沃土以及大棚旁邊溝渠中的水樣適量。西瓜根系纖弱，耐干不耐濕，所以培育的土壤多為旱地，瓜氨酸具有一定的耐旱作用，能產生瓜氨酸菌株能在旱地較好的生存，故選取西瓜大棚土壤作為取樣來源。

1.1.2主要試劑

L-瓜氨酸標準品購于Sigma試劑公司；L-精氨酸購于上海藍季生物公司；乙腈（色譜純，美國天地有限公司）；2，4-二硝基氟苯購于豪普斯生物試劑公司；其余試劑均為分析純。

1.1.3培養(yǎng)基與試劑

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.4，115℃滅菌30 min。

篩選培養(yǎng)基：蛋白胨1 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO40.3 g/L，L-精氨酸10 g/L，酚紅0.01 g/L，pH 6.7，固體培養(yǎng)基另加瓊脂20 g/L，115℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 3 g/L，KH2PO42 g/L，pH 7.2，115℃滅菌30 min。

發(fā)酵基本培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/ L，NaCl 10 g/L，L-精氨酸2 g/L，pH 7.2，115℃滅菌30 min。

轉化液成分：pH 6.0的底物精氨酸質量濃度為20 g/L，0.4 mol/L的NaAc-HAc緩沖液，115℃滅菌30 min。

衍生劑試劑：Na2CO3-NaHCO3緩沖液的配制，準確稱取Na2CO3和NaHCO3，制成0.5 mol/L Na2CO3和0.5 mol/L NaHCO3溶液，用Na2CO3調NaHCO3的pH值為9.0，即制得Na2CO3-NaHCO3緩沖液。

2，4-二硝基氟苯乙腈液的配制：準確量取2，4-二硝基氟苯，制得體積分數(shù)為1.5%的2，4-二硝基氟苯乙腈溶液。

K2HPO4-KH2PO4緩沖液的配制：準確稱取K2HPO4和KH2PO4，制成0.1 mol/L的K2HPO4和KH2PO4溶液，互調pH值至7.0，即制得K2HPO4-KH2PO4緩沖液。

流動相A的配制：含1%N，N-二甲基甲酰胺（體積分數(shù)）的0.05 mol/L NaAc和HAc緩沖溶液。分別準確配制0.05 mol/L的NaAc和HAc溶液，用HAc調NaAc溶液的pH值至6.4，然后加入溶液體積1%的N，N-二甲基甲酰胺，用0.45 μm水相膜過濾。流動相B的配制：V（乙腈）：V（水）=3：1，用0.45 μm有機膜過濾。

1.2儀器與設備

雙層全溫恒溫培養(yǎng)搖床；D-3752型臺式高速冷凍離心機，德國ThermoFisher；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療設備廠；YXQ-LS-S型全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療設備廠；GE-100型DNA水平電泳儀；Mastercycler型聚合酶反應儀，德國Eppendorf；Gel Dac XR+型凝膠成像系統(tǒng)，美國BIO-RAD；光學顯微鏡，日本尼康；分光光度計，美普達儀器公司；恒溫水浴鍋，萬華實驗儀器廠；Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司。

1.3實驗方法

1.3.1樣品的處理

將從菌源地采樣得來的樣品分別溶于無菌生理鹽水中，置于30℃搖床1 h混勻。

1.3.2初篩［13-14］

取上述土壤懸濁液溶于無菌水中，梯度稀釋，取10-4、10-5、10-63種稀釋度，取0.2 mL涂布于固體篩選平板上，倒置放入30℃恒溫培養(yǎng)箱，充分培養(yǎng)。若菌落能產生精氨酸脫亞胺酶，脫去精氨酸的亞氨基，同時生成瓜氨酸和氨，氨成堿性，會使培養(yǎng)基中添加的酚紅指示劑變成紅色，形成紅色的變色圈。

每日定時觀察上述平板上菌株的生長情況，若發(fā)現(xiàn)周圍有紅色變色圈菌落，立即挑取菌落在LB固體培養(yǎng)基上進行劃線純化，經過菌落形態(tài)特征觀察和鏡檢，初步認定為純種，各自用甘油凍存保藏，并編號。將上述保藏菌株接于液體篩選培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)。培養(yǎng)基轉變?yōu)榧t色者為陽性，以不加精氨酸的液體篩選培養(yǎng)基作為對照。保留所有陽性菌株，編號保藏。

1.3.3復篩［15］

通過初篩得到的菌株分別接種到液體種子培養(yǎng)中，37℃，180 r/min培養(yǎng)12 h獲得均勻的種子，然后以2%（體積分數(shù)）的接種量分別接到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的菌液6 000 r/min離心10 min，用滅菌生理鹽水洗滌菌體1～2次，轉入0.4 mol/L醋酸緩沖液中（底物精氨酸質量濃度為20 g/L，pH 6），反復吹打均勻，裝液量60 mL，置于37℃，180 r/min搖床中進行轉化。高效液相色譜法測定轉化液中瓜氨酸質量濃度。

瓜氨酸衍生化方法：轉化液10 000 r/min離心5 min，取1 mL放入10 mL的棕色容量瓶中（衍生物見光易分解），加入配制好的Na2CO3-NaHCO3緩沖液1 mL，再加入1 mL的2，4-二硝基氟苯乙腈溶液后搖勻，60℃水浴加熱1 h后，用K2HPO4-KH2PO4緩沖液定容。衍生化后的樣品10 000 r/min離心5 min，取0.6 mL入棕色液相瓶中待用。

高效液相色譜法檢測條件設置：使用Agilent XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm）。流動相A為含1%（體積分數(shù)）N，N-二甲基甲酰胺的0.05 mol/ L NaAc和HAc緩沖溶液，流動相B為乙腈-水，進樣量5 μL。實驗采用梯度洗脫，流動相A和B的體積比為：初始A與B的體積比為3：1，10 min 后A與B的體積比為2：3，13 min時A與B的體積比增至1：19，17 min時A與B的體積比還原為3：1，20 min洗脫結束。流速1.0 mL/min，進樣量5μL，二極管陣列（DAD）檢測器，檢測波長360 nm。

瓜氨酸標準曲線的繪制：精確稱取瓜氨酸標準品（購自Sigma公司）10 mg，用去離子水溶解并定容至5 mL，質量濃度為2 g/L。衍生化定容，按照上述液相檢測方法，分別進樣2、4、6、8、10 μL，平行進樣5次，記錄瓜氨酸的峰面積。以瓜氨酸的進樣量為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.4菌株鑒定［16-17］

1）細菌形態(tài)學特征及生化鑒定

將菌株接種到牛肉膏蛋白胨平板和液體培養(yǎng)物中，培養(yǎng)24 h后分別作革蘭染色，光學顯微鏡及電子顯微鏡觀察其形態(tài)，并對11號菌株進行生化鑒定。

2）分子生物學鑒定

采用16S rDNA序列分析法對菌株進行鑒定。用OMEGA公司的基因組提取試劑盒（E.Z.N. A.TM Bacterial DNA Kit）快速提取菌株基因組DNA。以基因組DNA為模板，以通用引物F27和R1492為引物進行16S rDNA序列擴增。

通用引物序列具體如下所示：

F27：5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

R1492：5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′

PCR擴增反應體系：96℃預變性5 min，95℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)。72℃延伸10 min。PCR產物交由GENEWIZ公司測序，進行16S rDNA基因序列比對。

2　結果與分析

2.1瓜氨酸HPLC檢測圖譜及標準曲線

分別進樣衍生劑和瓜氨酸衍生后產物，由液相圖譜圖1（a）可知衍生劑的出峰時間大約為5.768 min，由圖1（b）可知瓜氨酸衍生物的出峰時間內大概為5.159 min左右。

以瓜氨酸濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，回歸系數(shù)R2=0.997，線性關系良好。圖1（c）為瓜氨酸標準曲線。

圖1　瓜氨酸HPLC檢測圖譜及瓜氨酸標準曲線

2.2初篩

將土壤樣品溶于無菌水梯度稀釋后涂布于固體篩選培養(yǎng)基上，倒置于30℃培養(yǎng)箱中充分培養(yǎng)，挑選出菌落周圍產生紅色變色圈的菌株，劃線純化，經過菌落形態(tài)特征觀察和鏡檢，初步認定為純種的菌株有168株。將上述菌株接于液體篩選培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)。培養(yǎng)基轉變?yōu)榧t色者為陽性，以不加精氨酸的液體篩選培養(yǎng)基作為對照，排除本身代謝產物呈堿性的菌株，共有45株呈陽性，為初篩對象。

2.3復篩

將初篩出來的45株接入50 mL種子液中，活化后按照1.3.3中的方法進行復篩，轉化液離心取上清，衍生化后HPLC測定瓜氨酸質量濃度，結果見表1。

表1　不同菌株瓜氨酸質量濃度檢測結果比較

菌株　　瓜氨酸質量濃度/（g·L-1）　菌株　　瓜氨酸質量濃度/（g·L-1）29　2.81　38　1.49 30　1.57　39　0.54 31　0.45　40　0.36 32　0.31　41　0.21 33　5.20　42　3.58 34　0.02　43　0.35 35　3.91　44　6.08 36　1.34　45　0.26 37　4.54

由表1可知，經HPLC檢測，11號菌株轉化液中瓜氨酸質量濃度最大，遠高于其他菌株。因此選擇11號菌作為目的菌進行后續(xù)實驗。11號菌轉化液HPLC檢測圖譜見圖2（5.190 min為瓜氨酸衍生物出峰，5.717 min為精氨酸衍生物出峰，5.891 min為剩余衍生劑出峰）。

圖2　11號菌轉化液HPLC檢測圖譜

2.4菌株鑒定

2.4.1形態(tài)及生化鑒定

菌體在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中形態(tài)：菌落呈圓形，邊緣整齊，凸起，菌落呈白色半透明見圖3（a）。革蘭氏染色后菌體球狀呈陽性見圖3 （b），陰性桿菌為實驗室保藏的氣單胞菌。透射電鏡（負染）下見圖3（c），菌體呈球狀，未見鞭毛。根據(jù)16S rDNA的比對結果確定菌株所在的屬，配合《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》研究菌株的生化特征，菌株生化特征見表2。

表2　菌株11生理生化試驗

2.4.2分子生物學鑒定

16S rDNA區(qū)域序列同源性分析是一種常用的細菌分子鑒定方法。菌株的16S rDNA片段擴增后測序得到一個長為1 447 bp的序列，16S rDNA以及Marker的瓊脂糖電泳見圖4（泳道M 為Marker，泳道1為PCR產物）。將所得有效序列在NCBI中進行BLAST同源序列搜索，根據(jù)搜索結果，選取相似性較高的菌種的相關序列進行分析。利用MEGA5軟件中的Neighbor-Joining法對結果進行比對分析，以漫游菌屬（Vagococcus Collins NCBI登錄號為NR_118902.1）為外群，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap values為100（圖5）。分析結果表明，菌株11與糞腸球菌遺傳距離最近，同源性高達99%，因此初步鑒定11為糞腸球菌（Enterococcus faecalis）。

圖3　菌株11形態(tài)觀察

圖4　菌株11 16S rDNA PCR產物電泳凝膠成像圖

圖5　菌株11系統(tǒng)發(fā)育樹

3　討　論

瓜氨酸是一種非蛋白質氨基酸，有著非常廣泛的應用前景。11號菌株在較為簡單的培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝條件下就具有較強的精氨酸生產能力，為酶法生產瓜氨酸工業(yè)化的研究夯實基礎。通過對11號菌株的形態(tài)學觀察、生化試驗及分子生物學鑒定，認定該菌株為糞腸球菌（Enterococcus faecalis）。初步研究表明，菌株11可將20 g/L的精氨酸轉化為9.31 g/L的瓜氨酸，轉化率為46.28%。國內對于糞腸球菌酶法生產瓜氨酸的報道較多，如王瑩等［18］研究了糞腸球菌SK23.001產瓜氨酸的發(fā)酵條件，優(yōu)化后以蔗糖為碳源，大豆蛋白胨和NH4Cl為氮源，接種為3%，裝液量為50 mL/250 mL，起始pH 6.0，溫度37℃，100 g/L精氨酸轉化反應6 h，瓜氨酸產量可達83.06 g/L。李成付等［19］對復合誘變后的糞腸球菌NJ402進行了精氨酸脫亞胺酶酶學性質研究，經SephadexG-75凝膠柱層析純化后，其比酶活為8.151 U/mg。張鵬等［20］用海藻酸鈉對糞鏈球菌Streptococcus faecalis CGMCC1866進行固定化，每升反應液能產生瓜氨酸112～165 g/L。本文篩得的11號菌株并未表現(xiàn)出如此之高的瓜氨酸產量，可能是由于碳氮源等發(fā)酵條件，底物濃度等轉化條件不適宜，導致菌體生長緩慢，瓜氨酸產量偏低。若后續(xù)能對其進行復合誘變，酶定向改造，探索其發(fā)酵、轉化等因素的最優(yōu)條件，提高瓜氨酸產量，可能在酶法生產瓜氨酸領域有更廣闊的應用前景。

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（責任編輯：朱小惠）

Screening and identification of L-citrulline producing strains

WU Shijin，DAI Andi
（College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Abstract：Forty-five L-citrulline producing strains were preliminarily screened from Hangzhou watermelon greenhouse soil using arginine dihydrolase selective medium and their productivities were determined by HPLC. The strain of NO.11 had the highest ability to convert L-arginine to L-citrulline. 20 g/L L-arginine was converted into 9.31 g/L L-citrulline in 60 mL reaction mixture in one day with 0.344 g wet cells. The strain was identified as Enterococcus faecalis by morphology observation，physiological and biochemical characterization and molecular biological identification. Keywords：L-citrulline；Enterococcus faecalis；screening

作者簡介：吳石金（1971—），男，江西贛州人，教授，博士，研究方向為生物化學與應用分子生物學，E-mail：wujan28@zjut. edu.cn.

基金項目：浙江省自然科學基金資助項目（GB14021050070）

收稿日期：2015-12-04

中圖分類號：Q93

文獻標志碼：A

文章編號：1674-2214（2016）02-0088-06